全 文 ：中 国 糖 料
Sugar Crops of China
2012 年
第 2 期
文章编号：1007－2624（2012）02－0009－02
甘蔗近缘属斑茅组织培养高频再生体系的建立
吴转娣，刘家勇，陆 鑫，张 敏，林秀琴，赵培方，吴才文
（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远 616600）
摘 要：以甘蔗近缘属植物斑茅的幼嫩叶片为材料，研究 MS、SH、B5 三种基本培养基和不同激素（2，4-D、NAA、6-
BA）配比对斑茅愈伤组织诱导及继代培养的影响，并筛选出斑茅细胞高频再生体系的最优培养基配方。 研究结果表
明， 斑茅幼嫩叶片愈伤组织诱导培养基以 MS+2，4-D 3.0 mg/L+6-BA 0.4 mg/L 为最适， 愈伤组织继代培养基以
MS+2，4-D 3.0 mg/L 为最适。在此条件下诱导的愈伤组织质地疏松，具有较强的分化能力。目的是建立斑茅组织培
养的高频再生体系，为斑茅材料的细胞悬浮培养、染色体加倍和细胞融合等研究提供一定参考。
关键词：斑茅；组织培养；高频再生体系
中图分类号：S566.103 文献标识码：A
斑茅（Erianthus arundinaceus）是甘蔗近缘属植物，染色体为 2n=30、40、60，因生势强、具有抗干旱、抗寒、
抗病虫、耐瘠薄及宿根性强等特点，成为甘蔗育种的重要基因资源，在甘蔗育种中具有较为特殊的育种价值
和应用潜力[1－2]，在甘蔗育种研究中倍受关注，人们希望把斑茅的优良性状基因导入甘蔗栽培种，改良栽培种
的抗逆性、适应性和宿根性。目前利用斑茅杂交已经获得了杂种后代并育成新品种。然而在斑茅杂交的利用
过程中，我们发现其后代的可育性差、真实杂种的鉴定难等一系列问题[3]。 随着基因重组技术的出现，斑茅抗
性基因挖掘和分离、染色体加倍和细胞融合等就成为了利用斑茅培育新品种的新途径。 云南省农科院甘蔗
研究所依托国家甘蔗种质资源圃的资源优势，保存了 2000多份甘蔗种质资源材料，其中斑茅约 200份[4]。 而
在国内还未见有适宜于斑茅的组织培养高频再生体系的相关报道。 笔者以多份斑茅材料的幼叶为外植体，
研究在不同的培养基上诱导斑茅的愈伤组织及继代培养愈伤组织，进而建立组织培养高频再生体系，以期
为利用愈伤组织或悬浮细胞培养进行细胞加倍或细胞融合等的研究打下一定的基础 [5]。
1 材料与方法
1.1 材料
以云南省农科院甘蔗研究所国家甘蔗种质资源圃内保存的云南 83-197、云南 95-14、四川 79-1-2 三份
斑茅资源为实验材料。
1.2 方法
1.2.1 基本培养基的筛选和愈伤组织的诱导 取回斑茅的顶端分生区约 50cm 长， 第一次剥开部分老的叶
鞘，保留材料下端（顶芽部分）完整，切除多余的老叶鞘，约 25～30cm，以 75%乙醇溶液消毒表面，放入超净工
作台中，剥去老叶鞘，在无菌报纸上切去老的叶鞘剩下 10cm 长的幼嫩叶鞘，此时能在材料的上端看到两片
叶脉，外表面无毛，离材料下端 2～3cm处有一个叶鞘与叶片连接的肥厚带，即材料已经剥到位，将材料切片，
置于培养基上培养。
将外植体分别接种在 MS+2，4-D 3.0mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L； SH+2，4-D 3.0mg/L+6-BA
0.2mg/L+NAA 0.5mg/L；B5+2，4-D 3.0mg/L +6-BA 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L 培养基上， 观察不同基本培养基对
愈伤组织诱导的影响，选出最优基本培养基。
以 MS为基本培养基，6-BA、2，4-D、NAA、KT不同梯度浓度进行愈伤组织诱导、愈伤组织继代和愈伤组
织分化培养 3种培养基，培养基中蔗糖质量浓度均为 30g/L，琼脂 0.4%，pH 均为 5.8。 愈伤组织诱导、愈伤组
织继代均为暗培养，温度均为 25±2℃。分化培养则在光照度为 1000~2000lx的光照条件下，25±2℃培养。设计
18 种不同激素组合的诱导培养基（见表 1），每种组合 10 皿，每皿接种外植体约 16 块（分别来自 3 个不同的
斑茅材料）， 暗培养 15~25d 观察生长情况， 全部材料一皿换一皿继代 1 次观察并统计诱导愈伤的情况，分
好、较好、中、不好四类统计结果。
1.2.2 愈伤组织继代培养基的筛选 选取长势好的愈伤组织，在以 MS+3.0mg/L 2，4-D 为基本培养基，添加
不同量的 NAA、6-BA。 继代培养接种量约为 2g/块，接种约 10块，连续继代 3 次，每次 15d 继代 1 次，15d 后
取样称重，每个处理 3次重复，结果取平均值。
收稿日期：2012－01－28
基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-20-1-1）。
作者简介：吴转娣（1982-），女，广东省江门市人，研究实习员，主要从事甘蔗基因工程育种研究，E-mail：judith1123@126.com。
通信作者：吴才文，E-mail：gksky_wcw@163.com
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1.2.3 愈伤组织的分化培养 取连续继代 3 次，质地疏松易碎的愈伤组织，接种于 MS+KT 0.5mg/L+ 6-BA
1.0mg/L培养基中分化培养，观察苗分化的情况，并记录。
2 结果与分析
2.1 不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响
叶片外植体在 3 种基本培养基上均能诱导出愈伤
组织，以 SH培养基启动最快，培养 5d 的材料组织膨大，
呈淡黄色，褐化材料不多，15d生长较好的叶片外植体周
围长出淡黄色的愈伤组织， 生长较差的叶片外植体变
黑，约 20d 继代 1 次，愈伤生长加快愈伤生长量增加，愈
伤鲜黄继代后 15d统计诱导结果显示， 在 MS基本培养
基上诱导率最高，为 78%，且出愈伤时间最短，约 15d，
而 B5、SH 基本培养基上的诱导率偏低， 分别为 52%和
32%，褐化比较严重，出愈伤时间分别在 18d 和 22d。 因
此我们采用 MS培养基为基本培养基。
2.2 不同激素组合对愈伤组织诱导的影响
以 MS培养基为基本培养基， 观察不同激素组合对
斑茅叶片愈伤组织诱导培养的影响（激素组合见表 1）。 结果发现，以 2，4-D 3.0 mg/L 诱导效果最好，其中
2，4-D 3.0 mg/L+ BA 0.4 mg/L 的激素组合中愈伤的生长情况最好。
2.3 不同激素对愈伤组织继代培养的影响
以 MS+2，4-D 3.0 mg/L 为基本培养基，
继代培养 3 次， 每 15d 换 1 次培养基， 观察
6-BA 和 NAA 的添加量对斑茅愈伤组织继代
培养的影响 （激素添加情况见表 2）。 结果发
现， 与添加了 NAA 或 6-BA 的培养基相比，
不添加的培养基更加适合于继代培养。 以
MS+2，4-D 3.0 mg/L 的培养基中继代培养的
诱导效果最好，愈伤的生势好，愈伤质地松，呈淡黄色颗粒状。
2.4 愈伤组织的分化培养情况
将在 MS+2，4-D 3.0 mg/L 培养基中继代过 3 次，质地疏松易碎的愈伤组织，接种于MS+KT 0.5mg/L+ 6-
BA 1.0mg/L培养基中进行分化培养，结果显示：愈伤组织的分化能力强，在分化培养过程中没有出现褐化死
亡的现象，具有较强的分化能力。
3 讨论
斑茅是甘蔗育种研究中重要的野生资源，其生物量大，抗性强，是甘蔗品种活力和抗逆性基因源的主要
提供者，因此建立斑茅的组织培养高频再生体系具有重大的研究意义。 在对斑茅进行组织培养过程中，发现
斑茅材料在第一次愈伤诱导过程中褐化严重，因此本实验在愈伤诱导时均添加了 40mg/L PVP。 不同 2，4-D
浓度对斑茅材料的影响较大，在继代培养时不宜改变 2，4-D的浓度，同时在继代培养过程中不要继代多于 5
次，否则愈伤组织的活力不强，影响后续的实验。
（下转第 14页）
图 1 斑茅幼叶愈伤组织培养、继代培养及分化培养
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距离是 0.3945，平均遗传相似系数是 0.6740。 通过 UPGMA 方法进行聚类分析，在遗传距离 0.20 处，可把供
试材料分为 5大类群。试验结果表明，48份东北区甜菜单胚品系骨干材料遗传多样性较丰富，利用各类不育
系做亲本，将可获得杂交优势好的杂交组合。
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Genetic Diversity Analysis of Sugarbeet Monogerm Genotypes in the Northeast
Region by SRAP Molecule Marker
LI Bo1，WANG Mao-qian1，2，3，WANG Hua-zhong1，2，3
（1.The Key Laboratory of Sugarbeet Genetic Breeding/Institute for Crop Research，Heilongjiang University，Harbin 150080, China；2.
Sugarbeet Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150080，China；3.The Key Laboratory of North
Sugar Crop Resource and Utilization，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150080, China）
Abstract：SRAP molecule marker was used to test the genetic diversity of 48 monogerm genotypes of sugarbeet
in order to research the genetic basis and divide class group of monogerm sterile lines in the northeast of China.
21 of 60 pairs primer were obtained on basis of availability. A total 366 unambiguous bands were obtained，196
of total were polymorphic. The average ratio of polymorphic bands was 53.6%，Compute over-all mean showed
that genetic distance was 0.3945，genetic similarity coefficient among varieties was 0.6740. The materials were
divided into five cluster groups based on cluster analysis by MEGA3.1. The genotypes of 48 materials showed
high level of genetic diversity，with the sterile lines as parents，and good hybrid combinations could be obtained.
Key words：sugarbeet；SRAP molecule marker；monogerm lines；genetic diversity
（上接第 10页）
参考文献：
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Establishing High Frequency Regeneration System of Related Genera of
Saccharum（Erianthus arundinaceus）
WU Zhuan-di，LIU Jia-yong，LU Xin，ZHANG Min，LIN Xiu-qin，ZHAO Pei-fang，WU Cai-wen
（Yunnan Province Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement
/Sugarcane Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kuaiyuan 661600，China）
Abstract：The young leaves of Erianthus arundinaceus were used to study the effects of basic media and the
phytohormone combination （2, 4-D、NAA、6-BA） on callus induction as well as subculture of the callus, and to
screen out the best cultural formula for high frequency regeneration system of Erianthus arundinaceus. The results
showed that most suitable medium for callus induction was MS with 3.0 mg/L 2, 4-D and 0.4 mg/L 6-BA. MS
with 3.0 mg/L 2, 4 -D was as the best subculture medium formula，the callus was loose and had stronger
differentiation ability under those conditions. The purpose of the experiment was to establish a high frequency
regeneration system of Erianthus arundinaceus，and provided a reference for the Erianthus arundinaceuss
research，as the cell suspension culture，chromosome doubling and cellular fusion.
Key words：Erianthus arundinaceus；tissue culture；high frequency regeneration system
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