全 文 ：早熟禾再生体系建立的研究现状
丁路明 , 龙瑞军
(甘肃农业大学草业学院 , 甘肃 兰州　730070)
　　摘要:早熟禾是一种重要的禾本科牧草和草坪草 ,具兼性无融合生殖特性 。主要从早熟禾的组织
培养 、再生体系和基因转化方面阐述了生物技术在禾本科牧草中的应用及发展前景 。
关键词:早熟禾;组织培养;再生体系;生物技术;基因
中图分类号:S 54　　文献标识码:A 　　文章编号:1009-5500(2003)02-0006-04
　　牧草和草坪草对生态环境的改善有着重大作用 ,
特别是在目前国家开发西部 ,大力发展西部地区经济 ,
改善恶劣的生态环境 ,退耕还林还草 ,防风固沙 ,防止
水土流失 ,改善土壤条件 ,增加城市绿化等方面有着无
法替代的作用 。但是在许多发展中国家 ,畜牧业生产
长期处于原始放牧利用状态 ,草地退化 ,牧草抗逆性差
等现象极为严重 ,极大地影响了草地畜牧业的发展 。
目前 ,将生物技术应用于植物品种的培育和改良 ,成为
便捷和有效的途径。1985年 ,Vasil在国际草原学大会
上第一次提出利用遗传转化技术将其他来源的特定基
因导入牧草的可行性 ,为应用基因工程技术改良牧草 ,
包括提高产量和利用率 ,增加牧草的抗逆性等奠定了
理论基础 。通过基因工程技术培育出各种优质高产的
牧草和草坪草新品种 ,对促进无污染绿色养殖业和绿
色畜产品的发展 ,以及我国西部地区生态环境建设都
会产生深远的影响。
1　国内外牧草生物技术的研究现状
20世纪 70年代初一些先进国家先后开始了牧草
生物技术的研究 ,1972年美国首先研究苜蓿花药和组
织培养技术 ,与此同期前苏联也进行类似的研究 ,并进
行了百脉根 、红三叶 、红豆草的花培 、组培和细胞培养
技术的研究。80 年代初期 ,美国开始研究禾本科牧
草 ,如鸭茅 、多花黑麦草 、珍珠粟 、象草 、狼尾草细胞和
组织培养技术 。其他各国如澳大利亚 、日本等国和一
些发展中国家相继开展了此项技术的研究[ 1] 。90年
收稿日期:2003-02-04
作者简介:丁路明(1977 ～ ), 男 , 山东省日照市人 , 在读硕
士研究生。
代初 ,国外才开始对早熟禾基因转化的研究工作 ,而且
大多都停留在初级阶段[ 19 ～ 20] 。
在我国 ,由于种种原因 ,牧草生物技术的发展与国
外相比还有很大差距[ 2] 。我国牧草生物技术的研究是
在 20世纪 70年代末开始起步的 , 1979 ～ 1980年黑龙
江畜牧研究所和中国农业科学院草原研究所分别培养
出紫花苜蓿花药植株是一个重要标志 。进入 80年代 ,
我国牧草生物技术得到长足发展。研究重点主要是在
双子叶豆科牧草上。快速繁殖技术已应用到苜蓿 、草
木樨 、黄芪 、百脉根和扁蓄豆等珍贵材料繁殖上和快速
繁殖甘草种苗上 。在牧草基因工程方面 ,我国则是刚
刚起步 ,80年代后期 ,江苏省农科院土肥所把外源基
因导入了多年生黑麦草和狼尾草等获得转基因植
株[ 2] 。复旦大学生物化学系已经进行了早熟禾等禾本
科牧草的基因转化研究[ 3] 。由于禾本科牧草的组织培
养和离体再生体系的建立比较困难 。和双子叶豆科牧
草相比 ,他们又不是农杆菌的天然宿主 ,农杆菌不易侵
染 ,用此种方法 ,结果一直不是很理想。基因枪介导法
是近年来迅速发展起来的转化技术 ,他克服了以原生
质体为受体细胞的缺点 ,可适用于任何植物和材料 ,是
单子叶植物基因转化的最有效方法 ,采用基因离子枪
(particle gun)轰击(bombardment)胚性悬浮细胞系和
胚性组织对禾本科植物进行转化[ 4] 。该方法近几年已
在禾本科植物的转化研究中取得很大进展 ,该方法主
要依赖离子加速(particle acceleration)将基因(一般为
质粒 DNA)打入植物细胞 。该技术成功的关键在于能
够从转化组织再生出可育的植株 ,即所用细胞系的再
生能力。是否具有一个成熟的再生体系是使用该种方
法进行基因转化获得成功的关键因素 。但是应该看
6 Grassland and Turf　　(Quarterly)　　2003　　No.2　　(Sum　No.101)
DOI :10.13817/j.cnki.cyycp.2003.02.002
到 ,该转化技术目前还不成熟 ,外源 DNA 整合的机理
尚不清楚 ,整合的外源 DNA 结构复杂 ,拷贝数较多 ,遗
传稳定性较差等问题 ,尚需进一步完善和深入研究 。
2　禾本科牧草基因转化的研究
禾本科植物的组织培养是在植物组织培养达到成
熟阶段 ,即在 20世纪 60年代末期才逐渐开展起来并
在70 年代末期达到高潮[ 5] 。目前 ,禾本科植物的组
织培养已建立了一套比较完整的技术并正在向纵深发
展:首先是扩大禾本科植物中有重要经济价值植物(包
括野生种植物)的开发和利用;其次是与基因转移技术
联系起来 ,进行植物基因工程研究 ,如细胞器移植 、外
源 DNA 导入等[ 6] 。
目前 ,双子叶豆科牧草再生体系的建立已经比较
成熟 ,但对禾本科牧草来说却是一个难题 。植物体外
再生技术(包括器官发生和体胚发生)是生物技术研究
的前提 ,利用植物细胞的全能性 ,通过随机的体细胞无
性系变异而产生植物的遗传变异 ,或用于直接进行遗
传转化 ,或进行一些优良物种的扩繁[ 7] 。从单个细胞
有效地再生出正常可育的植株是植物分子遗传改良的
一个基本问题 ,但是这一点对禾谷类作物来说是相当
困难的 。因此 ,在离体操作中惰性非常强 。这一困难
已通过利用未成熟胚和未分化的组织和器官(如幼穗 、
幼胚等)作为外植体在一定程度上得以克服[ 4] 。以农
杆菌作为介导在双子叶植物的基因转化上已经很成
功。农杆菌质粒载体转化系统是双子叶植物最理想的
转化方法 ,目前获得的转化成功事例中 80%是采用此
系统 。但是 ,其最大缺点是农杆菌对单子叶植物不敏
感 ,特别是禾本科植物 , 从而限制了应用范围。 PEG
法 、电击法 、微针注射等的最大优点是无宿主范围 ,适
用于各种植物 ,特别是能应用于单子叶植物 。迄今获
得转化成功的水稻 、玉米 、小麦等禾本科作物大多是通
过此种方法实现的 ,也为突破单子叶植物基因转化的
禁区作出贡献。另一个重要特点是通过原生质体转化
获得的再生植株无嵌合体发生 ,有利于生产实践的应
用。但是目前对大多数植物而言 ,原生质体培养仍然
比较困难 ,再生频率低 ,重复性差。单子叶植物的原生
质体培养比双子叶植物更困难 ,因此仍然不是单子叶
植物理想的转化系统[ 3] 。由于单子叶植物不是农杆菌
的有效寄主 ,通过农杆菌对禾谷类作物进行转化是比
较困难的 ,这一困难与种遗传上的限制有关 ,也与禾谷
类作物对农杆菌没有感染与转化反应现象有关。农杆
菌会引起植物冠瘿病和毛根病 ,对植物来说 ,这种细菌
应该是天敌。禾本科植物可能具有自己的基因或机制
来抵抗这类细菌的感染 ,这也是禾谷类作物成为主要
粮食作物的原因 ,因为他们本身可以抵抗由于细菌感
染引起的退化问题[ 4] 。由此推论 ,尽管在这方面已取
得一些进展 ,但只限于一定的基因型;也许通过对农杆
菌转化双子叶植物机理的不断摸索和探讨 ,这一技术
终将也会被广泛应用于转化禾谷类作物。Ti质粒和
Ri质粒可以引起染色体的排除和混乱 ,这也从某种程
度上解释了为什么迄今为止农杆菌介导的遗传转化在
禾谷类作物上难以成功;同时也提醒我们 ,农杆菌介导
的遗传转化研究应谨慎一些 ,以防止物种的急剧退化 。
通过科研工作者对单子叶植物遗传转化工作的研究 ,
已取得了可喜的成果。目前 ,至少在单子叶植物的 6
个科的 13种植物中获得遗传转化[ 8～ 9] 。这说明单子
叶植物也能被农杆菌感染和转化 ,只是转化效率比较
低下 。外植体的选择和感染材料的选择是影响转化效
率的一个重要因素 。
近年来已有报道提供了充足的证据 ,表明农杆菌
介导方法可以成功地用于禾谷类作物的转化[ 11 ～ 13] ,
随着对农杆菌侵染机理的深入研究和揭示 ,采用相应
的技术措施是能够使农杆菌 Ti质粒成为单子叶植物
的一种理想转化载体。
3　早熟禾再生体系的建立及基因转化
的研究
早熟禾属植物是一年生或多年生禾本科牧草和草
坪草 ,是我国重要的传统牧草 ,具有兼性无融合生殖特
性。喜冷湿气候环境 ,生于草甸和沼泽化草甸中 ,局部
能形成单优势种纯群落。在我国栽培历史悠久 ,种植
面积广泛 ,主要分布在我国西北和华北地区[ 10] 。作为
北方的主要草坪草种 ,早熟禾在城镇绿化 、水土保持中
起着重要的作用 ,近年来在我国大量引进种植 ,具有生
长缓慢 、不需频繁修剪 、耐践踏 、坪用性好等优点 ,是建
植运动场和绿地草坪的优质草坪草种。草地早熟禾也
有一些突出的缺点 ,如生长缓慢 、叶量少 、易感病 、不抗
虫 、耐高低温性能差 ,季节变换时易变黄等 ,另外 ,草地
早熟禾的抗旱力不强 ,遇旱变成褐色[ 3] 。这些性状在
一定程度上都可以通过基因转化的手段得到改良 。成
功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建
7草原与草坪　　季刊　　2003年　　第 2期　　总第 101期
立。这种用于转基因的植物受体系统必须具有高频 、
稳定的再生能力 ,能接受外源基因的整合 ,并且外源基
因能够实现转录和翻译 ,完成正常的表达 。植物组织
培养和再生体系的建立是遗传转化的基础 。基因转化
受体系统的建立主要依赖于植物组织培养技术 ,但与
一般植物组织培养相比要求更高。从受体系统建立的
内容来看也比一般组织培养复杂 ,其包括外植体的选
择制备 、高频再生体系的建立 、抗菌素的敏感性实验
等[ 7] 。建立一个成熟的早熟禾再生体系对于早熟禾基
因转化的研究将具有十分重要的意义。
早熟禾遗传转化体系建立的难度较大 ,国内外研
究较少 ,主要是由于早熟禾组织培养和再生体系的不
健全 。草地早熟禾的组织培养 ,国外研究较早 ,但报道
不多。Mc Donnell等人认为 ,草地早熟禾成熟胚愈伤
组织的植株再生能力很低 ,而且多数呈器官发生途径;
麦草畏(dicamba)和毒莠定(piclo ram)较其他植物激素
对草地早熟禾的愈伤组织诱导及再生效果更好 ,并发
现对于冷地型牧草 ,如草地早熟禾 ,通过降温至 15℃,
并对愈伤组织进行 4℃的冷处理可以提高芽的出生
率 ,平时常用的 25℃并不是最适温度[ 14] 。建立草地早
熟禾胚性悬浮细胞再生体系 ,分离的胚比整个种子更
容易获得胚性愈伤组织 ,也更容易建立胚性悬浮细胞
体系[ 15] 。成熟种子同幼胚相比 ,虽然其愈伤组织的芽
分化频率较低 ,但易于获取 ,且不受季节 、植株发育时
期等因素限制 ,具备取材方便 、操作简单等优点。Bai
(2001)比较了高羊茅的成熟种子和未成熟胚愈伤组织
诱导率 ,发现虽然未成熟胚愈伤诱导率比成熟种子高 ,
但其再生率比成熟种子低 ,他认为成熟种子是较好的
外植体。以花序和成熟种子为外植体建立草地早熟禾
再生体系 ,花序比成熟种子更易于形成胚性愈伤组
织[ 16] 。通过早熟禾种子获得再生体系的比率为
14%[ 17] 。混合使用麦草畏和 6-苄基氨基嘌呤(BA)比
起单独使用 2 , 4-D 、麦草畏 、毒莠定 ,对早熟禾苗的再
生具有更好的效果;草地早熟禾的不同品种 ,其再生频
率差别很大 , 有的可达 40%(如 Baron , Fylking ,
Glade), 而有的仅为 1%～ 5%(如 Adelphi , Amazon ,
Kenblue ,Midningt ,Apex)[ 17] 。以成熟种子为外植体诱
导愈伤组织 ,含有 BA 的培养基的诱导频率要高于不
含的 ,不同品种间的诱导频率相差很大 ,通过混合使用
2 ,4-D 和 BA 可大幅度提高体细胞胚和植株的再
生率[ 18] 。
在我国 ,牧草生物技术研究的重点主要是在双子
叶豆科牧草上 。关于早熟禾再生体系的建立和基因转
化的研究报道很少 。朱根发等以草地早熟禾胚轴及幼
穗为外植体 ,研究了其培养条件和分化能力 。研究表
明草地早熟禾成熟胚愈伤组织的胚胎发生能力很差 ,
胚轴也很难诱导出具较高分化能力的愈伤组织 ,二者
均不是理想的外植体;从幼穗中可以诱导出胚性愈伤
组织[ 20] 。马忠华 、张云芳等人以早熟禾成熟种子为外
植体 ,通过基因枪介导法初步建立了早熟禾的基因转
化体系[ 3] 。
4　早熟禾再生体系建立的发展前景
目前 ,双子叶豆科牧草再生体系的建立已经比较
成熟 。但对禾本科牧草来说却是一个难题 。单子叶禾
本科牧草高频再生体系的建立是比较困难的 ,需要进
一步探讨禾本科牧草组织培养的最佳条件 、影响因素
和体细胞的胚胎发生 。禾本科牧草组织培养很难成
功 ,其原因可能正是由于对禾本科牧草外植体在离体
培养过程中 ,所用培养基的大量元素 、微量元素的多少
及其比例关系了解甚少 ,因此禾本科牧草的培养基大
多不能使其外植体得到很好的表达 。另外 ,培养基中
的大量元素 、微量元素对外植体的生长 、分化不仅仅是
起到供给无机营养的作用 ,更大的作用可能是调节作
用[ 13] 。禾本科牧草的组织培养技术是生物技术的主
要组成部分和基础。目前 ,禾本科牧草的组织培养技
术正与基因转移技术联系起来 ,进行牧草基因工程的
研究 ,从细胞和分子水平上 ,开拓新的研究内容。早熟
禾作为重要的禾本科牧草和草坪草 ,建立其高频再生
体系和基因转化体系 ,进行品种培育和改良工作已是
当务之急 。相信 ,随着研究的不断深入 ,通过先进的生
物技术手段 ,建立良好的早熟禾再生体系 ,为其进一步
进行基因转化和品种改良奠定基础 ,培育优良的早熟
禾品种指日可待。
参考文献:
[ 1] 　何茂泰 , 于林清.牧草生物技术的研究及实用化前景
[ J] .生物工程进展 , 1997 , 17(2):63～ 71.
[ 2] 　夏兰琴 , 郭三堆.国外豆科牧草生物技术研究进展———生
物技术在豆科牧草遗传育种研究中的应用 [ J] .生物技
术通报 , 1999 , (4):6～ 11.
[ 3] 　马忠华 , 张云芳 ,徐传祥 , 等.早熟禾的组织培养和基因枪
介导的基因转化体系的初步建立 [ J] .复旦学报 , 1999 ,
38(5):540～ 544.
8 Grassland and Turf　　(Quarterly)　　2003　　No.2　　(Sum　No.101)
[ 4] 　徐子勤.重要禾谷类植物转基因研究 [ J] .生物工程进
展 , 2001 , 21(1):59～ 74.
[ 5] 　丁家宜.经济植物组织培养实用技术 [ M] .南京:江苏科
学技术出版社 , 1988.1～ 14.
[ 6] 　邵宏波.禾本科牧草的组织培养研究及其应用 [ J] .广西
植物 , 1992 , 12(1):42 ～ 58.
[ 7] 　王关林 , 方宏筠.植物基因工程原理与技术 [ M] .北京:
科学出版社 , 1998.
[ 8] 　孙晗笑 , 陆大祥 , 刘飞鹏.转基因技术理论与应用 [ M] .
北京:科学出版社 , 2000.
[ 9] 　安韩冰 ,朱祯.基因枪在植物遗传转化中的应用 [ J] .生
物工程进展 , 1977 , 17(1):18～ 26.
[ 10] 　内蒙古农牧学院主编.牧草及饲料作物栽培学 [ M ] .
北京:农业出版社 , 1978.189 ～ 191.
[ 11] 　贝丽霞 ,王守德 , 史芝文 ,等.用农杆菌将 Bt基因导入水
稻愈伤组织的研究 [ J] .吉林农业大学学报 , 2000 , 22
(4):36～ 40.
[ 12] 　Jean G , Michael D , Osamu H , et al.T ransfo rmation of
Zea mays L.Using Agrobacterium tumefaciens and the
Shoot Apex [ J] .P lant Physio , 1991 , 95:426～ 434.
[ 13] 　Cheng M , Joyce E F , Pang S Z , et al.Genetic transforma-
tion of w heat mediated by agrobacterium tumefaciens[ J] .
P lant Plant Physio , 1997 , 115:971 ～ 980.
[ 14] 　McDonnell R E , Conger B V.Callus induction and plantlet
fo rma tion from mature embryo explants of Kentucky blue-
g rass [ J] .Crop Science , 1984 , 24:573～ 577.
[ 15] 　Nielsen K A , Knudsen E.Regeneration of green plants
from embryogenic suspension cultures of Kentucky blue-
grass(Poa pratensis L.)[ J] .J Plants Phy siol , 1993 , 141:
589～ 595.
[ 16] 　van der Valk P , Creemers-Molenaar J.Somatic embryoge-
nesis and plant reg eneration in inflo rescence and seed de-
rived callus of Poa pratensis L.(Kentucky bluegrass)[ J] .
Plant Cell Repor ts , 1989 , 7:644 ～ 647.
[ 17] 　Griffin J D , Dibble M S.High-frequency plant regeneration
from seed-derived callus cultures of Kentucky blueg rass
(Poa pratensis L.)[ J] .Plant Cell Reports , 1995 , 14:721
～ 724.
[ 18] 　van der Valk P , Ruis F , Tettelear-Schrier A M , et al.
Optimizing plant regeneration from seed-derived callus cul-
tures of Kentucky blueg rass.The effect of benzy ladenine
[ J] .Plant Cell , Tissue and O rgan Culture , 1995 , 40:101
～ 103.
[ 19] 　Ke S , Lee C W.Plant regeneration in Kentucky blueg rass
(Poa pratensis L.)coleoptil tissue culture [ J] .Plant Cell
Report 15(22):882 ～ 887.
[ 20] 　朱根发 ,余毓君.草地早熟禾的组织培养条件和分化能
力研究 [ J] .华中农业大学学报 , 1994 , 13(2):199 ～
203.
Research Progress in Regeneration and Gene
Transformation of Kentucky Bluegrass
DING Lu-ming , LONG Rui-jun
(Pratacultural College , Gansu Agriculture University , Lanzhou 730070)
　　Abstract:Kentucky blueg rass is an impo rtant turf and forage grass w ith facultative apomictic mode of reproduc-
tion.The application and advances of biotechnolog y to this g rass is mainly discussed from tissue culture , regeneration
and gene t ransfo rmation.
Key words:Kentucky blueg rass;tissue culture;regeneration;bio technology;gene
重要声明
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《草原与草坪》编辑部
9草原与草坪　　季刊　　2003年　　第 2期　　总第 101期