全 文 ：蝴蝶兰组织培养与基因工程育种研究进展
王云惠1 ,2 ,陈雄庭1＊　(1.中国热带农业科学研究院生物技术研究所 ,海南海口 571102;2.海南职业技术学院 ,海南海口 570216)
摘要　综述了利用种子、花梗芽作为外植体通过愈伤组织、体细胞胚、PLB、原生质体途径再生植株技术以及基因枪和农杆菌介导的遗传
转化体系建立的研究成果。
关键词　蝴蝶兰;组织培养;基因工程育种
中图分类号　S 682.31　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2007)16-04827-04
Research Achievements of Tissue Culture and Gene Engineering Breeding in Phalaenopsis spp.
WANG Yun-hui et al　(Institute of Tropical Biological Sciences , Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences , Haikou , Hainan 571102)
Abstract　 This paper reviews achievements of plant regeneration from flower stalk buds and seed of Phalaenopsis through callus , somatic embryogenesis ,
protocorm-like bodies(PLB), protoplasts and genetic transformation by particle bombardment and Agrobacterium-mediated were establishment.
Key words　 Phalaenopsis spp.;Tissue culture;Gene engineering breeding
　　蝴蝶兰(Phalaenopsis)又称蝶兰 ,为兰科蝴蝶兰属花卉 ,
其花形酷似蝴蝶 ,花色丰富艳丽 ,花期持久 ,在国内外花卉市
场深受欢迎 ,被誉为“兰花皇后” , 是兰科植物中栽培最广泛 、
最普及的种类之一 ,具有较高的观赏价值和经济价值 。近年
来蝴蝶兰的国内外市场需求持续上升 ,世界各国在进行大规
模商品化生产的同时 , 对蝴蝶兰的快速繁殖和新品种选育
技术进行了广泛 、深入的研究 ,取得了重要进展 。笔者结合
多年研究实践 ,对近年来国内外在蝴蝶兰组织培养和基因工
程育种方面的研究进展进行综述 ,旨在为蝴蝶兰的深入研究
提供参考。
1　蝴蝶兰组织培养研究
组织培养技术是进行蝴蝶兰大规模商品生产和新品种
选育的关键 。从 1949年Potor利用无菌培养技术成功地诱导
蝴蝶兰花梗休眠芽发育成完整植株以来[ 1] ,经过多年研究改
良 ,到 1974年 Intuwong等利用蝴蝶兰茎尖作为外植体诱导类
圆球茎 、再生植株 ,为实现蝴蝶兰工厂化生产奠定了基础[ 2] 。
截止 2006年底 ,已报道的蝴蝶兰再生途径包括源于种子的原
球茎愈伤组织再生途径[ 3] 、原球茎体细胞胚再生途径[ 4] 、叶
片体细胞胚再生途径[ 5] 和源于花梗腋芽和花梗休眠芽茎尖
PLB再生途径[ 6-7] 、茎尖胚性愈伤组织再生途径[ 8] 、茎尖愈伤
组织原球茎再生途径[ 9] 、茎尖愈伤组织原球茎再生途径[ 10] 、
叶片PLB愈伤组织再生途径[ 11] 、叶片 PLB再生途径[ 12] 、叶片
体细胞胚再生途径[ 13] 、芽生芽再生途径[ 14] 、愈伤组织原生质
体再生途径[ 15] 。源于花梗休眠芽或花梗腋芽外植体的芽生
芽途径获得的后代不但植株变异很少 ,性状比较整齐 ,而且
成苗速度也较其他方式快 ,是目前商品化种苗生产中主要采
用的繁殖途径。
1.1　外植体的种类　由于蝴蝶兰是单轴气生花卉 ,分株繁
殖率较低。为满足蝴蝶兰消费市场不断扩大的需要 ,近年来
国内有大量关于蝴蝶兰组织培养方面的报道 ,所用外植体包
括种子[ 16-18] 、根段[ 19] 、花梗苗根尖[ 20] 、花梗腋芽[ 21] 、茎
尖[ 22] 、叶片[ 23-25] 、胚[ 26] 、花葶节间[ 27] 、花梗节或花梗节间切
段[ 28] ;国外近期关于蝴蝶兰组织培养方面的研究报道 ,主要
集中在源于种子[ 3-5] 、花梗休眠芽和花梗腋芽[ 6-15]的植株再
作者简介　王云惠(1968-),女 ,云南昭通人 ,在读硕士 ,副教授 ,从事园
艺作物遗传育种和栽培技术研究。 ＊通讯作者。
收稿日期　2007-03-08
生等方面。
1.2　源于种子的再生体系　蝴蝶兰种子无菌培养技术是蝴
蝶兰杂交育种的关键步骤 ,日本 、韩国和台湾糖业研究所对
此进行了多年研究 ,技术比较成熟。
1.2.1　原球茎愈伤组织再生途径。2000年 ,ChenY C等用蝴
蝶兰 Nebula自花授粉 120 d的种子作为外植体 ,采用 1/4
MS[ 29]无机盐+1.0g/L蛋白胨+2.0g/L AC+50.0 g/L香蕉
泥+100.0mg/L 肌醇+20.0 mg/L蔗糖+3.0 g/L Gelrite(pH
值=5.2)为诱导培养基 ,在 10 μmol/(m2.s)、光/暗为 16 h/8
h 、25 ℃的条件下培养约 1个月形成原球茎。试验表明 ,适宜
增殖的材料是培养 2个月的原球茎 ,适宜的培养基是1/2MS
(MS培养基中大量元素和微量元素减半)+100mg/L肌醇+
0.5 mg/L 烟酸+0.5 mg/L VB6 +0.1 mg/L VB1 +2.0 mg/L
glycine+1.0g/L蛋白胨+170mg/L NaH2PO4 +20.0 g/L蔗糖
+2.2mg/L Gelrite+1.0mg/L TDZ(pH值=5.2),在该培养基
上暗培养 2 个月 ,可诱导出大量的愈伤组织;而在 28 ～ 36
μmol/(m2·s)、光/暗为 16 h/8 h 、(26±2)℃的条件下培养 ,则
增殖出大量PLB。要长期保持愈伤组织不分化 ,适宜的培养
基配方是 1/2MS+0.5mg/L TDZ +0.5 mg/L 2 ,4-D(pH值=
5.2),每月转接 1次 ,可以较长时间(12个月以上)保持不分
化;将愈伤组织转接到不添加激素的诱导培养基中培养 ,就
可再生形成植株。试验发现 ,光照条件不同 ,诱导产物不同;
在愈伤组织诱导培养基中添加TDZ比BA更有效[ 3] 。
1.2.2　原球茎体细胞胚再生途径。2004年 Chen J T等用蝴
蝶兰 amabilis自花授粉后 3个月的种子作为外植体 ,采用 1/2
改良MS(MS培养基中大量元素和微量元素减半)+100mg/L
肌醇+0.5mg/L烟酸+0.5 mg/L VB6 +0.1 mg/L VB1 +2.0
mg/L glycine +1.0 g/L蛋白胨+170mg/L NaH2PO4 +20.0 g/L
蔗糖 +2.2 g/L Gelrite(pH 值 =5.2)培养基 , 在 28 ～ 36
μmol/(m2·s)、(26±1)℃、光/暗为 16 h/8 h 的条件下诱导原
球茎 ,培养时间约为 45 d;在上述培养基中添加 3.0mg/L TDZ
对晶胚的诱导最有效 ,经过 50～ 60d的培养 ,可诱导出大量
的晶胚;将晶胚/原球茎转入不含激素的上述培养基中培养 ,
4～ 6周后可形成带有 5 ～ 6片叶 、3 ～ 4条根的小苗[ 4] 。在培
养基中添加NAA对晶胚的形成有抑制作用[ 4] 。
笔者近期用杂种蝴蝶兰(图 1)自花授粉后培养 120 d的
种子(图 2)作为外植体 ,用MS+0.5mg/L BA+1.0mg/L NAA
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2007, 35(16):4827-4830, 4868　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　陈娟　责任校对　胡先祥
+1.0g/L AC+20.0g/L蔗糖+5.8g/L琼脂(pH 值=5.8)的
培养基 ,在 10μmol/(m2·s)、光/暗为 12 h/12 h 、(26±1)℃的
条件下培养 1个月 ,获得肉眼可见的PLB(图 3);将PLB转移
到 1/3MS+3.0mg/L BA+0.3mg/L NAA+1.0g/L AC+15%
CW+30.0g/L蔗糖+5.8 g/L琼脂(pH 值=5.8)的培养基
上 ,在 28～ 36μmol/(m2·s)、光/暗为 16 h/8 h、(26±1)℃条件
下继续培养 2周 ,可观察PLB迅速分化形成小苗(图 4);试验
还发现 ,光照强度不但影响外植体的诱导产物 ,也与生长速
度密切相关 。
图1　白花紫斑蝴蝶兰杂种　　　　图 2　蝴蝶兰蝴杂种果夹
图3　种子培养1个月后的发育情况　图4　PLB转移到培养基上1个月
1.2.3　叶片体细胞胚再生途径 。2006年 ,Chen等用蝴蝶兰
amabilis自花授粉 3个月后的种子为外植体 ,用 1/2改良MS
+100 mg/L肌醇+0.5 mg/L烟酸+0.5 mg/L VB6 +0.1 mg/L
VB1+2.0 mg/L glycine+1.0 g/L蛋白胨+170 mg/L NaH2PO4
+20.0 g/L蔗糖+2.2 g/L Gelrite(pH值=5.2)培养基诱导小
苗 ,在 28～ 36μmol/(m2·s)、(26±1)℃、光/暗为 16h/8 h的条
件下经过 180 d的培养(2个月转接 1次),获得带有 3 ～ 5片
叶 、2～ 4条根的小苗;切取叶片为外植体 ,研究TDZ和NAA 2
种不同的激素对叶片诱导体细胞胚的影响 ,结果表明用 1 cm
长的叶片作为外植体 ,直接诱导体细胞胚最有效的激素是
3.0mg/L的TDZ[ 5] 。
1.3　源于花梗的再生体系　用花梗腋芽和花梗休眠芽作为
外植体经过芽生芽途径再生植株是国内外应用最广泛的蝴
蝶兰商品苗生产途径 。用同样的外植体经过茎尖 PLB、茎尖
胚性愈伤组织 、茎尖愈伤组织原球茎 、叶片 PLB愈伤组织 、叶
片PLB 、叶片体细胞胚 、愈伤组织原生质体等途径再生植株
则是实现蝴蝶兰细胞育种 、分子育种的基础。
1.3.1　茎尖PLB再生途径 。1993年Ken T等用 8个不同蝴
蝶兰品种的花梗芽诱导的带有 1 ～ 2片叶的茎尖作为外植
体 ,比较了 1/2MS 和NDM 2种基本培养基对茎尖诱导 PLB
的影响 ,发现 NDM基本培养基+0.1mg/L NAA+1.0 mg/L
BA+20g/L蔗糖+8.0g/L琼脂粉(pH值=5.4)比 1/2MS培
养基效果更佳 ,在 33 μmol/(m2·s)、(23 ±1)℃、光/暗为
14 h/10 h的条件下培养 1年(半年后每个月转接 1次),可从
1条花梗上的几个芽扩增出 10 000多个 PLB。相同条件下 ,
将PLB转接到不含激素的上述培养基上就可分化出植株[ 6] 。
对植株的细胞学检测发现 ,该方法的变异率小于 6%。
1995年ChenYQ等用杂种蝴蝶兰花梗腋芽作为外植体 ,
经芽生芽或茎尖PLB途径再生植株[ 7] 。试验发现 ,在培养基
中添加TDZ的诱导效果明显好于 BA ,最适宜的TDZ浓度是
2.3mg/L;用VW基本培养基[ 30] +15%CW +2.3mg/L TDZ +
10.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂粉(pH 值=5.3)诱导花梗芽萌
发 ,在 12μmol/(m2·s)、(23±1)℃、光/暗为 12 h/12 h条件下
培养 2个月 ,可得到带有 2片叶以上的小植株;将再生植株
花梗切离 ,转接到不加激素的同样培养基中 ,7周后可得到带
根苗[ 7] 。
1.3.2　茎尖胚性愈伤组织再生途径。2001年 Ken T等用 9
个不同表现型的蝴蝶兰花梗芽诱导的茎尖为材料 ,发现
NDM[ 6] +0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L BA+10.0 g/L蔗糖+2.0
g/L gellan gum(pH =值 5.4)培养基 ,在(23 ±1)℃、33
μmol/(m2·s)、光/暗为 14 h/8 h条件下诱导胚性愈伤组织效
果最好;用NDM+0.7mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖的液体培养
基以 80 r/min在往返式振荡培养箱中悬浮振荡培养 3个月 ,
可实现愈伤组织大量增殖;将培养基中的蔗糖浓度减少到
10.0 g/L ,在(23±1)℃、35μmol/(m2·s)、光/暗为 14 h/8 h条
件下继续培养 ,愈伤组织可经过 PLB途径分化成小苗。对此
途径再生的植株进行细胞学检测表明 ,植株变异率低于
10%。试验表明 ,培养基中的蔗糖浓度直接影响诱导结果 ,
当蔗糖浓度为10.0g/L时 ,诱导产物为PLB;当蔗糖的浓度增
至 20.0g/L时 ,诱导产物为愈伤组织[ 8] ,与 Ishii Y等[ 10]所得
结果一致。
1.3.3　茎尖愈伤组织原球茎再生途径。2003年Ken T等用
蝴蝶兰花梗芽诱导的茎尖作为外植体通过细胞悬浮培养诱
导愈伤组织形成原球茎再生植株 ,比较了在NDM 基本培养
基中添加葡萄糖 、麦芽糖 、果糖 、蔗糖 、山梨醇 、乳糖等 6种不
同碳源对体胚诱导的影响。结果发现 ,10.5 g/L的葡萄糖浓
度对诱导PLB的形成效果最佳;20.0 g/L的蔗糖诱导愈伤组
织增殖的能力与葡萄糖相同 ,但不能诱导PLB的形成;添加
适量的干酵母可促进愈伤组织的增殖 、抑制 PLB的形成;低
浓度的 BA(0.09 mg/L)对愈伤组织的增殖有微小的促进作
用 ,但抑制 PLB的形成 。Ken T等用NDM+0.09mg/L NAA+
1.0 mg/L BA+10.0g/L蔗糖+2.0 g/L gellan gum (pH 值=
5.3)的培养基在(23±1)℃、33μmol/(m2·s)、光/暗为 14 h/10
h的条件下诱导花梗芽出苗。用幼苗茎尖作外植体 ,将培养
基中蔗糖的浓度增加到 20.0 g/L诱导愈伤组织 ,3个月后将
形成的愈伤组织接种到液体培养基中增殖 ,相同条件下以 80
r/min的速度振荡培养 ,结果表明NDM+0.09mg/L NAA+1.0
mg/L BA+10.5 g/L葡萄糖+(0.1 ～ 1.0)g/L干酵母培养基
具有最高的PLB增殖率 , 20.0 g/L的蔗糖具有最高的愈伤组
织增殖率[ 9] 。
1.3.4　叶片PLB愈伤组织再生途径。1998年 Ishii Y等用蝴
蝶兰`Santa Cruz的花梗芽诱导的 2 cm长的叶片作为外植体
再生植株 ,试验表明 ,用叶片诱导PLB到愈伤组织比用叶片
直接诱导愈伤组织容易 ,仅需在VW培养基中添加 40.0g/L
的蔗糖和 200 ml/L的椰子水就可取得很好的诱导效果(与添
4828 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2007年
加BA和 2 , 4-D的培养基相比)。试验还发现 ,用 gellan gum
作为凝固剂诱导愈伤组织比用琼脂粉更好;保持愈伤组织不
分化要用VW+40 g/L蔗糖+200 ml/L CW+0.1mg/L 2 ,4-D
+0.01mg/L BA+2.0g/L gellan gum(pH值=5.3)培养基 ,愈
伤组织在不添加糖的培养基上 ,于 28 ～ 36μmol/(m2·s)、25
℃、光/暗为 16 h/8 h的培养条件下可分化 PLB ,将PLB接种
到生长培养基上就可分化成完整植株 。对所得的再生植株
进行细胞学检测和形态观察 ,未发现染色体和形态变异[ 10] 。
1.3.5　叶片PLB再生途径 。2000年Park S Y等用生物反应
器系统再生植株 ,实现了蝴蝶兰的大规模增殖。用带条纹的
粉红色蝴蝶兰杂种花梗芽(2 cm长)作为外植体 ,用添加 3.0
mg/L BA和 45g/L蔗糖的MS固体培养基诱导花梗芽萌发 ,
待新芽长出叶片后切成 5 mm×10 mm 的小块 ,用MS +45.0
g/L蔗糖+15.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA+7.0 g/L琼脂粉
(pH值=5.7)培养基诱导PLB。8周后 ,将长出的 PLB横切 ,
按 0.5 g/瓶的标准接种到装有 100 ml液体培养基的长颈瓶
(250 ml)中 ,培养基的成分为改良花宝培养基[ 31](6.5N-4.5P-
19 K 1 g/L+20 N-20 P-20 K 1 g/L)+1%土豆泥 +活性炭
0.5%(pH 值=5.7),在 60μmol/(m2·s)、(25±2)℃的培养条
件下 ,于水平振荡仪上按 100 r/min振荡培养 8周 ,得到大量
PLB。试验比较了MS 、KC[ 32] 、VW 、LM[ 33] 、改良花宝等 5种不
同培养基的 PLB增殖效率 ,发现改良花宝培养基是最适宜类
原球茎生长的液体培养基[ 11] 。
2002年Park S Y等用花梗芽诱导的叶片作为外植体再
生植株 ,选择蝴蝶兰杂交种“Taisuco Hatarot”(粉红花品种)、
“Annie”(白花品种)、“Golden star”(黄花品种)、“Annie”(白花
紫斑品种)带有 2～ 4个芽的花梗作为外植体(切成 2 cm长带
1个芽的段),用MS+4.6mg/L BA+45 g/L蔗糖+7.0g/L琼
脂粉(pH值=5.7)的培养基诱导花梗芽萌发 ,将花梗芽诱导
出的叶片作为外植体 ,用 1/2 MS+20.0mg/L BA+1.0 mg/L
NAA+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂粉(pH值=5.7)培养基 ,
在(25±1)℃、10μmol/(m2·s)、光/暗为 16 h/8 h条件下诱导
PLB ,经过 12周的培养 ,形成最大量的 PLB ,将这些PLB转入
改良花宝培养基+2.0 g/L蛋白胨+3%土豆泥+0.05%AC
+30.0 g/L蔗糖(pH=5.2)中进行纸桥培养 , 8周后 ,实现大
量增殖。PLB转接到改良花宝固体培养基上培养 6周 ,可分
化形成小苗 。试验比较了 1/2MS、VW 、KC 、LM 4种不同基本
培养基诱导叶片分化 PLB的效果 ,结果显示 1/2 MS 是最适
宜的基本培养基[ 12] 。
1.3.6　叶片体细胞胚再生途径。2005年Kuo H L等用蝴蝶
兰` LITTLE STEVE的花梗芽诱导的无菌叶片(1 cm×1 cm)为
外植体再生植株 ,用 1/2改良MS培养基为基本培养基 ,比较
在培养基中添加 2 ,4-D 、Kt 、BA 、TDZ 4种不同激素的效果 ,发
现TDZ对叶片诱导体细胞胚的发生最有效;1/2改良MS+
1.0mg/L TDZ+20.0g/L蔗糖+2.2 g/L Gelrite(pH值=5.2)
是诱导叶片产生体细胞胚最适宜的培养基;叶片正面朝上接
种到培养基上暗培养 2个月 ,可在叶片近轴端和伤口区域产
生大量体细胞胚 ,将其转移到 28 ～ 36 μmol/(m2·s)、(26±1)
℃、光/暗为 16 h/8 h的条件下继续培养 45 d ,体细胞胚变绿
并形成芽;再转移到不含 TDZ的 1/2 MS改良培养基上继续
培养约 2个月 ,形成带 3 ～ 4片叶和几条根的小苗。仅用 4.5
～ 5个月的时间 ,就从叶片经过体胚途径实现了植株再生 。
在适宜的培养条件下 ,一块外植体(1 cm×1 cm)最多可长出
15株小苗[ 13] 。
1.3.7　芽生芽再生途径。2004年Polonca KO IR等用花梗休
眠芽作为外植体诱导丛生芽再生植株(芽生芽)。他们认为 ,
除激素外 ,基本培养基中的大量元素和微量元素也是影响再
生速度的关键因子 。他们用 8个不同品种的蝴蝶兰杂交种
作为试验材料 ,比较了 5种不同培养基对花梗节休眠芽诱导
丛生芽再生植株的效果 , 发现最有效的外植体诱导培养基
为P 6793(Sigma商用培养基)+ 20g/L蔗糖+2.0 mg/L BA
+0.5 mg/L NAA +2.6 g/L gellan gum(pH 值=5.2),在 34
μmol/(m2·s)、(24±1)℃,光/暗为 16 h/8 h条件下培养 ,仅需
2个月就可诱导形成大量丛生芽;丛生芽壮苗生根最适宜的
培养基是B5培养基 ,在 B5 培养基上整个再生过程仅需 4个
月[ 14] 。芽生芽再生途径是目前所有报道中再生速率最快的
方法 ,是一条快速而高效的蝴蝶兰种苗商品生产途径 。
1.3.8　愈伤组织原生质体再生途径。2007年 Shrestha B R等
用愈伤组织原生质体途径再生植株。试验用蝴蝶兰
“Wataboushi”花梗芽诱导植株茎尖为外植体 ,用Ken T等报道
的方法诱导愈伤组织 ,用原生质体经过愈伤组织诱导产生
PLB再生植株。对成苗进行细胞学检测 ,未发现后代变异 。
试验表明 ,山梨醇是经原生质体途径再生植株中最适宜的碳
源 ,不同的凝固剂对原生质体再生也有一定影响。这一再生
途径的研究成功 ,为蝴蝶兰育种提供了新途径[ 15] 。
1.4　其他相关研究　1998年 Chen W H等报道 ,经PLB途径
再生的蝴蝶兰植株 ,开花前在外形上完全没有差异 ,但到开
花期可以看到部分植株出现表现型变异 ,用组织和染色体检
测发现 ,仅有 1.5%的植株出现基因型变异[ 34] 。Tsu H等报
道 ,在蝴蝶兰 PLB增殖过程中 ,用NP[ 35]作为基本培养基时 ,
用海藻糖作为碳源比用蔗糖作碳源增殖效果更好[ 36] 。
2　蝴蝶兰基因工程育种研究进展
市场上销售的蝴蝶兰大部分是用杂交育种方法培育而
成。但常规杂交育种存在育种周期长 、受亲缘关系局限 、新
品种培育速度慢 、育种目标不易实现等缺点 ,因而基因工程
育种技术应运而生。
Anzai H 等最先开始用基因枪法转化蝴蝶兰[ 37] 。Be-
larmino M M等用农杆菌 LBA4404(pTOK233)介导法将GUS基
因导入蝴蝶兰愈伤组织 ,获得含有GUS标记基因的植株 。该
研究认为 ,在农杆菌侵染液中加入 200μM的乙酰丁香酮 , 28
℃、30 r/min侵染 10 h;共培养时在培养基中加入 500μM的乙
酰丁香酮 ,共培养 3 d(暗培养),对提高侵染效率有明显促进
作用;适宜的潮霉素筛选浓度是 50 mg/L;头孢噻肟(cefo-
taxime)抑菌浓度为 300 mg/L[ 38] 。Chai M L 等用农杆菌
LBA4404(pTOK233)介导 ,成功地将 GUS 基因导入蝴蝶兰
PLB ,获得含有GUS标记基因的蝴蝶兰植株。该研究认为 ,将
PLB横切成 2份浸染 30 min ,在培养基中加入 100μM的乙酰
丁香酮共培养 2 d ,延迟筛选 6周 ,可以有效提高转化效率 。
开始筛选时潮霉素的适宜筛选浓度是 3.0 mg/L。经过 4个
筛选周期(4个月)培养后再生的类原球茎如要继续筛选 ,潮
482935卷16期　　　　　　　　　　　　　　　　王云惠等　蝴蝶兰组织培养与基因工程育种研究进展
霉素的浓度应降为 1.5mg/L[ 39] 。Li J L等用基因枪转化法将
带有抗CymMV病毒基因的载体转入蝴蝶兰中 ,出现转基因
沉默[ 40] 。Mishiba K I 等用农杆菌 EHA101(pIG121Hm)介导 ,
将GUS基因导入蝴蝶兰原球茎中。该研究认为 ,下列措施有
助于提高转化效率:用种子在液体NDM 培养基中培养 21 d
时的原球茎做转化材料;侵染前将蝴蝶兰原球茎转入含有
100μM乙酰丁香酮的新鲜培养基中预培养 2 d ,预培养后的
培养液中按 10∶1(V/V)的比例加入(OD600≈0.6)农杆菌菌液 ,
浸染 7 h;用 5 mg/L的美洛培南(meropenem)进行抑菌 ,共培
养1周 ,用 20mg/L的潮霉素筛选进行筛选 ,筛选培养 2个
月 ,恢复培养 1个月。在含有 20mg/L潮霉素的培养基中 ,直
至分化成苗[ 41] 。Chan Y L等用 UBI启动子 ,用农杆菌介导将
抗 Mosaic病毒(CymMV)和 Erwinia carotovora 的 CP 基因和
Pflp基因相继转入蝴蝶兰中 ,得到了具有广谱抗病性的蝴蝶
兰植株[ 42] 。Rinaldi S 等以 CaMV35S 为启动子 ,用农杆菌
EHA101(pEKH-WT)介导将抗病 wasabi 基因导入蝴蝶兰
`Wataboushi愈伤组织中 ,获得了抗软腐病等多种细菌性病害
的蝴蝶兰植株。该研究对Belarmino and Mii所用方法进行了
改进 ,将浸染时间由 10 h缩短为 2 h ,用 10 mg/L浓度的美洛
培南代替 500mg/L浓度的头孢噻肟抑菌 ,效果更好[ 43] 。
3　问题与展望
我国有世界上最丰富的兰花资源和最广阔的兰花消费市
场。从文献报道看 ,国内在蝴蝶兰生物技术应用研究和产业化
方面远滞后于欧美和其他东南亚国家与地区 ,在研究的连续
性 、目的性、研究机构的重视程度等方面都存在较大差距 ,很少
拥有自主知识产权的产品。如何充分利用现有资源 ,拓展研究
思路 ,用市场需求调控研究方向 、研究成果推动产业发展 ,利用
基因工程育种技术 ,从花色 、花型 、花香、抗逆性等方面开展研
究 ,尽快培育一批有自主知识产权的产品占据市场 ,是国内蝴
蝶兰乃至整个兰花产业当前面临的紧迫任务。
自 20世纪 60年代以来 ,生物技术的应用促进了兰花组
织培养技术的研究 ,进而在兰花细胞工程 、基因工程等生物
技术的研究方面取得了重要进展 ,并在全世界范围内带动了
高效益 、大规模的兰花产业发展 。通过体细胞胚发生途径 、
愈伤组织途径 、原生质体途径再生植株技术的成功 ,农杆菌
介导的各种遗传转化体系的建立和优化 、基因枪转基因技
术 、多倍体诱变技术等生物技术的成功使用 ,为蝴蝶兰利用
细胞工程和生物技术育种提供了有利条件 ,不同科 、属 、种间
的种质交换成为可能 ,通过体细胞融合 、转基因技术 、诱变育
种等途径培育和改良蝴蝶兰品种 ,基础工作已日趋完善 ,前
景十分广阔 。
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4830 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2007年
肠道微生态自我调节完成的 。双歧杆菌等有益菌可将肠道
中的糖类转变成 SCFA和乳酸 ,降低肠道 pH 值 ,而低 pH值环
境又阻止了病原菌及腐败菌在肠内的定植[ 5] 。ENP通过促
进单胃动物理想肠道微生物菌的增殖 ,增加了动物机体对外
源性病原菌的抵抗作用 。该研究表明 , 0.3%的 ENP添加量
能显著促进仔猪盲肠中双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖 ,抑制盲
肠中大肠杆菌和梭菌的增殖 ,这说明肠道微生态在一定程度
上具有自我调节能力 。
血清TP 、ALB、GLO含量反映机体蛋白质的吸收和代谢
状况。CHO 、TG3 含量的高低反映脂类的吸收状况;HDL 、
LDL 、VLDL反映脂类在体内的分解和转运状况;同时可以反
映肝脏脂肪代谢状况[ 6] 。该研究发现 ,添加 ENP使仔猪血清
TP 、GLO 、CHO和 TG3 含量明显提高 ,通过血液转运的 CHO和
TG3提高 ,肝脂肪含量下降 ,抗脂肪肝的效果较强 ,加强了脂
类在血液循环中的运转以及在肝脏 、脂肪组织 、心脏 、肌肉组
织中的利用 。结合 GPT活性指标的提高 ,仔猪在生长阶段 ,
体内蛋白质代谢加强 ,氨基酸利用率提高 ,表现为生长速度
的加快[ 7] 。同时仔猪分泌GH、IGF-I 、T3 和 T4 等激素的作用
增强 ,意味着机体通过神经-内分泌途径使 TP 、GLO在生长
期增加 ,以增强能量动员和体液免疫功能[ 8] 。
3.2　ENP对仔猪免疫功能的影响　细胞内环磷酸腺(cAMP)
含量取决于腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶(phosphodiesterase-
PDE),cAMP活化蛋白激酶 A通过PKAC 亚基选择性的刺激
mRNA转录促进某些蛋白质的合成;细胞内环磷酸鸟苷
(cGMP)含量取决于鸟苷酸环化酶(GC)和PDE , cGMP通过依
赖 cGMP蛋白激酶的激活 ,使底物蛋白质的磷酸化 ,或者调节
离子通道 ,刺激或抑制 cAMP分解 ,参与生物体内多种功能的
调节[ 9] ;血浆 cAMP主要受交感-肾上腺髓质释放的儿茶酚
胺的影响 ,而 cGMP主要受到副交感神经释放的乙酰胆碱影
响。cAMP/cGMP对调节细胞功能具有重要作用 ,并且与植物
性神经功能有密切关系。Gddbery等将 cAMP/cGMP对机体调
节作用与中医的“阴阳学说”相联系 ,认为 cAMP/cGMP在医
学上有重要意义。该试验结果表明 ,ENP可显著提高仔猪血
液中 cAMP的含量及 cAMP/cGMP的比例 ,这对于促进仔猪的
免疫功能有重要意义 。
所有哺乳动物都有 IgG 、IgM 、IgA 。IgG有抗菌 、抗病毒作
用 ,在体液免疫中最为重要;IgM在机体受病原感染后与补体
结合 ,溶解病原体的作用很强 ,在抗感染中起“先锋”作用;IgA
随分泌液排出至粘膜表面 ,发挥抗菌 、抗病毒作用 ,在消化道
及呼吸道内作用尤为明显[ 10] 。该研究发现 ,添加 ENP使仔
猪血清 IgG 、IgM水平明显提高 ,表明 ENP能增强机体体液免
疫功能。此外 , IgG还具有防止败血症的作用 ,可作为仔猪对
外界刺激免疫反应的发动剂 ,是一种重要的肠道保护型抗
体[ 11] 。因此 ,仔猪阶段血清 IgG 、IgM和 IgA水平的提高 ,在一
定程度上可以减少仔猪腹泻的发生。从白细胞数量及分类
也可看出 ,ENP可以刺激仔猪非特异性的免疫功能 ,使其体
液免疫功能有较大改善。
补体是特异性免疫的主要组成部分 ,担负机体非特异性
抗感染作用。该研究发现 ,添加 ENP使仔猪血清C3 、C4 水平
明显提高 。表明在仔猪阶段 ,补体处于较高水平 ,可协助抗
体和吞噬细胞杀灭病原微生物。由于体液免疫功能的改善 ,
抵抗力提高 ,仔猪腹泻发病率降低 ,从而促进仔猪生长 。
Klasing等认为 ,因各种免疫原的刺激而使机体免疫系统激活
后 ,可导致采食量下降 、饲料利用率降低 ,从而抑制动物生
长[ 12] 。笔者在 ENP组方中加入了具有免疫增强作用的中草
药 ,能改善机体的体液免疫功能 ,提高饲料利用率和仔猪抵
抗力 ,降低腹泻发生率 ,从而促进了仔猪生长 。
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