全 文 ：收稿日期:2008 -11-27
作者简介:云　岚(1970 -),女 ,在读博士研究生 ,副教授;主要从事牧
草种质资源与育种研究;E-mail:nmg yunlan@ 163.com。
新麦草种子成熟胚高效再生体系研究
云　岚 , 　云锦凤 , 　李俊琴
(内蒙古农业大学生态环境学院 , 　呼和浩特 010018)
摘要:新麦草是一种优良的牧草与生态建设草种 ,为了以种子为外植体建立高效再生体系 , 研究了不同激素 、培养基添加
物对新麦草成熟胚愈伤组织诱导与植株再生的影响 , 结果表明 , 通过外源激素调节抑制胚的萌发 、促进愈伤发生是诱导
成熟胚形成愈伤组织的关键 ,这一过程中 2, 4-D和 ABA起重要作用;而 6-BA对继代培养中胚性愈伤组织的发生和分化
有显著影响。
关键词:　新麦草;愈伤组织;继代;分化
中图分类号:　Q943.1;　S543　　　文献标志码:　A　　　文章编号:　1001-4705(2009)03-0055-03
STUDYonHigh-frequencyPlantRegeneration
fromMatureEmbryoofPsathyrostachysjuncea
YUNLan, YUNJin-feng, LIJun-qin
(ColegeofEcologyandEnvironmentalScience, InnerMongoliaAgriculturalUniversity, Huhhot010018, China)
Abstract::Russianwildryegrass(Psathyrostachysjuncea)isanimportantforageforagegrassandecological
constructionspecies, Inordertoestablisheficientexplantseedforregenerationsystem, thestudyresearchon
diferenthormones, culturemediumfornewadditivesprewetingmatureembryocalusinductionandplantre-
generation.Theresultshowedthatexogenoushormonesregulatedinhibitionthroughtheembryocalusgermina-
tion, promoteformationisthekeytoinducematureembryocalus, inthisprocess, 2, 4-DandABAplayedanim-
portantrole, And6-BAhadasignificantinfluencetoformembryogeniccalusanddiferentiationinsubculture.
Keywords:　russianwildrye;calus;subculture;regeneration
　　新麦草 (Psathyrostachysjuncea(Fisch.)Nevski)
又称俄罗斯野黑麦(Russianwildrye),主要分布于欧亚
地区的草原及半荒漠 ,在我国主要分布于新疆和青藏
高原等地区 [ 1] 。适于干旱半干旱地区种植 ,是一种多
年生 、长寿命的丛生禾草 ,具密集的基生叶 。因其抗寒
耐旱性强 ,且在夏秋季节保持较高的营养价值 [ 2] ,是
优良的牧草与生态建设草种。在北美西北部大平原广
泛种植 [ 3] 。新麦草是小麦族 (Triticeae)新麦草属
(Psathyrostachys)中唯一具有饲用价值的草种[ 4] 。也
是被认为遗传很稳定 ,进行基因改造的物种之一 [ 5] ,
建立高效组培与再生体系是在细胞水平进行遗传改良
的前提 。国内外新麦草组织培养与再生方面 ,孙震晓
等 [ 6]研究了不同培养时间幼胚愈伤组织染色体的变
化 。王淑强 [ 7]对新麦草幼穗愈伤组织诱导和再生进
行了探讨 , Z.Wang等[ 8]利用悬浮培养胚性细胞获得
了再生植株 。而以成熟胚为外植体进行愈伤组织诱导
并建立再生体系的研究未见报道。虽然成熟胚培养较
幼胚和幼穗更困难 ,但成熟胚培养的优势在于以成熟
种子为外植体 ,取材时间不受限制 ,较幼穗和幼胚更易
于获得 ,是理想的外植体材料。建立高效的成熟胚再
生体系可为新麦草遗传改良奠定基础 ,使其在我国西
北干旱半干旱地区能得到更好的利用 。
1　材料与方法
1.1　材　料
实验材料为当年收获后贮存 1个月的新麦草成熟
种子。品种为中国农大草地所选育的山丹新麦草。
1.2　方　法
1.2.1　成熟胚愈伤组织诱导
选取籽粒饱满 、大小一致的成熟新麦草种子 ,在
10 ℃下无菌水中浸泡 36 ～ 48 h,拨去内外稃 ,用 70%
乙醇表面消毒 30 s, 0.1%HgCl2浸泡 4 min,无菌水冲
洗 4 ～ 5遍。用解剖针挑出完整的成熟胚接种在愈伤
诱导培养基上 , 25 ℃左右暗培养 14天后转入光照培
养 。诱导愈伤采用 MS(MurashigeandSkoog1962)为
基本培养基 ,添加 2、4、6 mg/L2, 4-D;筛选出的最佳培
养基添加 0.3、0.5、0.7mg/LABA;筛选出最佳培养基
再添加 30 0mg/L和 500mg/LCH。以上培养基均附
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研究报告　　云　岚 等:新麦草种子成熟胚高效再生体系研究
DOI :10.16590/j.cnki .1001-4705.2009.03.055
图 1　新麦草成熟胚培养与植株再生
加 3.0%(w/v)的蔗糖 ,以 7.0%(w/v)的琼脂固化。
1.2.2　愈伤组织的继代改造与植株再生
诱导出的愈伤组织转入继代培养 ,继代培养基为
MS附加 1、2、 3 mg/L2, 4-D和 0.2、0.4、 0.6 mg/L
6-BA,所有继代培养基均附加 300 mg/LCH、3.0%
(w/v)的蔗糖 ,以 7.0%(w/v)的琼脂固化 ,于 25 ℃下
光照 24 h/d培养 ,光照强度为 3 000 ～ 4 000 lx, 20 ～ 25
d继代一次。继代 2 ～ 3次后转入分化培养 ,分化培养
基为 MS附加 0.3 mg/LNAA和 4.0 mg/L6-BA,在 25
℃下以每日光照 16 h和黑暗 8 h的周期进行培养。当
芽长到 4 cm左右时转入生根培养基 ,生根培养基为不
添加激素的 1 /2MS或添加 0.5 mg/LNAA的 1/2 MS。
分化幼苗转到生根培养基上 ,当每株可长出 5条以上
根 ,根长为 3 ～ 4 cm,再培养一周植株健壮 ,叶色浓绿
时移栽 。去掉封瓶膜 ,瓶中加入适量自来水 ,室温炼苗
2 ～ 3 d,再用自来水将再生植株根部培养基冲掉 ,移栽
到培养钵中(内含 1∶1混合的园土和细沙)。在温室中
相对湿度为 60%的环境下生长 。
2　结果与分析
2.1　新麦草成熟胚愈伤组织诱导
不同激素配比对新麦草成熟胚愈伤组织诱导产生
了不同影响 , 2, 4-D对愈伤组织诱导率影响程度最大 ,
在未添加 2, 4-D的培养基上成熟胚难以脱分化 , 92%
的胚直接萌发 ,仅有少量发生愈伤;而接种到含 2, 4-D
的培养基上 ,成熟胚在黑暗条件下培养 4 ～ 5 d后开始
膨大 , 7 ～ 12 d逐渐形成无色半透明的愈伤组织(图
1A)。 2, 4-D浓度为 2mg/L时 ,诱导愈伤效果最好(表
1),愈伤发生率高 ,愈伤组织较干燥致密。随着 2, 4-D
浓度的升高 ,大于 4 mg/L时诱导愈伤率显著降低 ,愈
伤组织质量也有所下降 ,而且对愈伤组织以后的分化
产生不利影响。在 2 mg/L2, 4-D基础上再添加 0.3
mg/LABA,对愈伤组织发生有显著的促进作用 ,胚的
直接萌发受到抑制 ,添加 ABA浓度高于 0.5 mg/L时 ,
不仅诱导率显著下降 ,且愈伤组织生长缓慢。
在诱导培养基中添加 300 mg/L和 500 mg/L的
CH,均具有促进成熟胚愈伤组织生长的效果 ,二者无
显著差异。生长在添加了 CH培养基上的愈伤组织体
积明显增大 ,愈伤诱导率也较未添加 CH时有一定提
高 。但 CH对愈伤诱导的促进作用必须以培养基中存
在 2 , 4-D为前提 ,仅 CH单独作用反而促进胚的直接
萌发 ,在仅添加 CH而无其它激素的 MS培养基中成熟
胚几乎全部萌发 ,而且没有愈伤组织发生 。
表 1　2, 4-D和 ABA激素配比对成熟胚愈伤组织诱导的影响
培养基 2, 4-D(mg/L)
ABA
(mg/L)
CH
(mg/L)
出愈率
(%)
萌发率
(%)
0 0 0 11.56 92.00
2 0 0 71.67 33.33
4 0 0 67.27 27.27
6 0 0 56.36 18.18
MS 2 0.3 0 87.08 4.92
2 0.3 300 90.16 6.20
2 0.3 500 89.03 6.50
2 0.5 0 58.00 12.42
2 0.7 0 70.10 11.67
　　注:出愈率为发生愈伤组织的胚数 /接种成熟胚总数;萌发率为萌
发出芽胚数 /接种成熟胚总数。
2.2　成熟胚愈伤组织继代改造
由成熟胚诱导形成的初生愈伤组织大部分生长慢
且质量较差 ,为质地湿软的白色半透明状团块。初生
愈伤组织经过 2次或 3次的继代培养 ,部分愈伤组织
可转化为淡黄色 、较干燥 、质地致密 、颗粒状的胚性愈
伤组织(图 1 C)。
培养基中不同激素浓度对成熟胚初生愈伤组织改
造有一定影响。在诱导培养基基础上 ,添加 6-BA明
显促进了胚性愈伤发生 ,统计 2次继代后愈伤改造情
况(表 2),添加6-BA0.4 mg/L的继代培养基对愈伤组
织的改造效果明显好于添加 6-BA0.2 mg/L和 0.6
mg/L继代培养基 。因此 ,添加适宜浓度 6-BA对成熟
胚胚性愈伤组织的发生具有促进作用。 2, 4-D浓度比
诱导愈伤时降低一倍至 1mg/L时 ,成熟胚继代改造效
果最佳。试验中以附加 1 mg/L2, 4-D和 0.4 mg/L
6-BA的继代培养基对愈伤组织的改造效果最好 , 2次
继代培养后胚性愈伤组织转化率为 41.37%。
2.3　愈伤组织分化与植株再生
MS附加不同浓度 NAA、6-BA的分化培养基上。
未改造过的成熟胚愈伤组织尽管继代多次 ,在各种激
素配比的分化培养基中只有极少数能分化出植株;而
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第 28卷　第 3期　2009年 3月　　　　　 　　　　　　种　子　(Seed)　　　　　 　　　　　　Vol.28　No.3　Mar.　2009
经改造后质地较好的胚性愈伤组织在含有适宜浓度
NAA、6-BA的培养基上 ,能很快分化出绿色芽或叶片 ,
同时也有少量的白化苗形成 。NAA和 6-BA对愈伤组
织的分化均存在显著影响;经比较分化培养基以附加
0.3mg/LNAA和 4.0 mg/L6-BA最为适合 ,分化率达
85%以上(图 1 D、E)。
表 2　不同继代培养基对成熟胚胚性愈伤发生的影响
培养基 2, 4-D(mg/L)
6-BA
(mg/L)
胚性愈伤改造
率(%)
1 0.2 14.85
0.4 41.37
0.6 37.60
MS 2 0.2 16.88
0.4 36.49
0.6 33.33
3 0.2 16.21
0.4 24.80
0.6 25.37
当芽长到 4 cm左右时 ,取健壮的植株转到生根培
养基上 ,在 1/2 MS培养基中 12 ～ 15天后开始生根 ,所
有的分化苗都能生根形成完整小植株 ,在 1 /2MS培养
基中加入 0.5 mg/LNAA则加快了生根的速度 ,大约
一周即开始诱导出根 。移栽后 30天统计成活率达
90%以上。
3　讨论与小结
成熟胚是已经发育完善的胚胎 ,在培养基上易于
直接萌发成苗 ,诱导愈伤组织的关键是通过激素调节
抑制胚的萌发 ,促进胚脱分化形成愈伤 。这一过程中
2, 4-D起到关键性作用 ,低浓度 ABA也具有抑制成熟
胚萌发 、促进其脱分化的效果 。脱落酸(ABA)是一种
具有全面生理功能的内源激素 。它能抑制植物细胞伸
长和分裂 ,诱导种子休眠 ,防止过早萌发 ,在植物对逆
境应答过程中起重要作用 [ 9] 。外源 ABA在植物组织
培养中的作用已在多种植物中有研究报道 ,一些研究
结果表明 , ABA对植物体细胞胚的发生与发育具有重
要作用 ,如在继代培养基中添加 ABA能改善水稻愈伤
组织状态 ,提高分化率 [ 10] ,小麦愈伤组织诱导中 ABA
可以有效抑制胚发芽 ,并有助于胚性愈伤组织的形
成 [ 11] 。本试验中 ABA对抑制新麦草成熟胚萌发 、促
进愈伤组织形成具有明显作用 ,与以上研究结果一致。
同时添加 300 ～ 500 mg/L水解酪蛋白(CH)对愈
伤生长有促进作用。 MS培养基中只有甘氨酸作为有
机氮源 ,在暗培养过程中植物愈伤组织自身不能合成
有机物 ,需要培养基的提供才能保证细胞正常生长和
分裂。据报道 MS培养基中添加 CH,可有效提高烟草
愈伤诱导率及提高愈伤组织质量[ 12] , CH是氨基酸 、多
肽 、蛋白质等的混合物 ,本试验中主要作为有机氮素的
补充对愈伤生长产生促进作用 ,而对成熟胚脱分化过
程无直接影响。
成熟胚初生愈伤组织大部分质量较差 ,因此获得
高效成熟胚再生体系的另一关键步骤是对愈伤组织进
行继代改造 ,使愈伤组织产生更多胚性细胞 ,进而分化
成苗 ,在继代培养中 ,添加 6-BA对胚性愈伤组织的发
生具有显著促进作用 ,经比较附加 1 mg/L2, 4-D和
0.4mg/L6-BA的继代培养基对胚性愈伤的改造效果
最好。
新麦草一旦形成胚性愈伤则较易于分化 ,在附加
0.3mg/LNAA和 4.0 mg/L6-BA的培养基上分化速
度最快 。分化的幼苗也易于在 1 /2MS培养基中生根 ,
添加 0.5 mg/LNAA可以加快生根的速度 。
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研究报告　　云　岚 等:新麦草种子成熟胚高效再生体系研究