全 文 ：江西农业学报　2010, 22(12):37～ 40ActaAgriculturaeJiangxi
蝴蝶兰基因工程研究进展
张文惠 ,曾碧玉 ,刘福平
　 　收稿日期:2010-09-03
作者简介:张文惠(1972─),女 ,内蒙古人 ,副研究员,博士 ,研究方向:植物抗逆及遗传育种。
(福建省亚热带植物研究所 ,福建 厦门 361006)
摘　要:蝴蝶兰作为热带和亚热带最重要的观赏花卉之一, 在基因工程的改良上有着诱人的前景。综述了蝴蝶兰遗传转
化的转基因受体材料 、导入的外源基因和克隆的相关基因、抗病毒基因的研究现状 ,展望了蝴蝶兰转基因技术及其应用前景。
关键词:蝴蝶兰;愈伤组织;类原球茎;基因工程
中图分类号:Q943.2　文献标识码:A　文章编号:1001-8581(2010)12-0037-04
ResearchProgressinGeneEngineeringofPhalaenopsisspp.
ZHANGWen-hui, ZENGBi-yu, LIUFu-ping
(FujianInstituteofSubtropicalBotany, Xiamen361006, China)
Abstract:Asagroupoftheleadingflowersintropicalandsubtropicalareas, theplantsinPhalaenopsishavegoodprospectsin
geneengineering.TheresearchprogressingeneengineeringofPhalaenopsisspp.wassystematicalysummarized, includingthetrans-
genicacceptors, theintroducedforeigngenes, theclonedrelatedgenesandanti-virusgenes, thegenetransformationtechniquesand
theirapplicationprospects.
Keywords:Phalaenopsisspp.;Calus;Protocorm-likebody;Geneengineering
　　蝴蝶兰(Phalaenopsis)为兰科蝴蝶兰属兰花 ,原产于
我国台湾省、菲律宾 、印度尼西亚、泰国、马来西亚等地 。
蝴蝶兰花型奇特 ,色彩艳丽 ,花期长久 ,素有“洋兰皇后 ”
的美誉 。基因工程是培育花卉新品种的重要方法之一 ,
也为蝴蝶兰的品种改良提供了广阔的前景 。笔者从蝴蝶
兰遗传转化的转基因受体材料、导入的外源基因和相关
基因的克隆、蝴蝶兰抗病毒基因研究状况 、蝴蝶兰转基因
技术及其应用前景等进行了综述。
1　转基因受体材料
从 1949年 Potor等[ 1]利用无菌培养技术成功诱导蝴
蝶兰花梗休眠发育成完整植株以来 ,经过多年的改良 。
1974年 Intuwong等[ 2]利用蝴蝶兰茎尖作为外植体诱导
类原球茎、再生植株 ,为蝴蝶兰产业化奠定了基础。目
前 ,蝴蝶兰遗传转化主要以原球茎 、类原球茎 、愈伤组织
或幼胚作为受体材料 ,原球茎和类原球茎易被诱导 ,转化
后也易分化成苗 ,但原球茎、类原球茎的幼胚经遗传转化
后易产生嵌合体 ,不利于鉴定筛选 ,且幼胚不容易获
得 [ 3 ～ 7] 。胚性愈伤组织是较好的受体材料 ,遗传转化后
不必经历胚胎发生阶段 ,可直接获得再生植株 ,在此过程
中 ,非转化细胞可以被有效去除[ 6] 。 1990年 , Sagawa
等 [ 8]获得了具有再生能力的蝴蝶兰愈伤组织 ,该愈伤组
织在含 20 g/L蔗糖和 150 mL/L椰汁的改良 VW培养基
上 , 5年后仍保持松脆性 ,胚性无明显下降。 Men等 [ 5]将
蝴蝶石斛兰(D.phalaenopsisBanyanPink)的种子播种在
1/2 MS培养基上 ,待叶子分化后 ,转移到含 1 mg/LBA
的 1/2MS培养基中 ,在萌动芽基部形成了旺盛生长的愈
伤组织和原球茎 ,此混合体成功用于微粒子介导的遗传
转化 。
蝴蝶兰愈伤组织的诱导存在种类和品种的特异性 ,
具有愈伤诱导时间长 ,生长速度较慢 ,继代培养较困难的
特点 。不能满足转基因对外植体 的要求 ,从而成为蝴蝶
兰转基因研究中的主要限制因素 。蝴蝶兰基因转化受体
系统的构建技术日益成熟 ,一个优良基因转化受体系统
要求植物材料具有高效、稳定的再生能力和大量稳定的
外植体来源 ,并且可针对性选择抗生素和农杆菌 。
2　外源基因
外源基因导入蝴蝶兰的途径和方法日益拓展 。其
中谢永祥等以 PDS1000/hE型基因枪 650 psi压力处理
蝴蝶兰幼胚 ,得到 34%的暂时表现转化率;处理 30 d,
GUS基因 DNA可以整合到蝴蝶兰细胞的染色体内 [ 7, 9] 。
Belarmino等[ 10] 以 LBA4404 (pTOK233)和 EHA101
(pIG121Hm)质粒为载体 ,以悬浮细胞系为受体 ,将 GUS
基因与潮霉素磷酸转移酶基因 HPT转入蝴蝶兰 ,并得到
高度表达的再生植株 。Belarmino[ 10] 、Hsieh[ 11] 、Anzai[ 12] 、
Chai[ 13]等也分别运用农杆菌介导法 ,成功将 GUS基因转
入蝴蝶兰中并获得转化植株 。
2004年 ,中国台湾省的 Li-JenLiao等 [ 14]将包含
CymMV-CP-cDNA、玉米泛素(Ubiquitin)启动子及 Nos
终止子的 DNA组件 ,通过粒子轰击而转入蝴蝶兰中 ,经
Southern证实了 CP基因的整合 。尽管 CP-mRNA转录
信号水平比较低 ,也未在转基因蝴蝶兰中检测到 CP基
因 ,但 RT-PCR和 ELISA表明这些转基因蝴蝶兰对病
毒血清的抗性提高;对 T0代株系抗性检测表明 , 13株检
测株系中有 5株显示出抗性 ,经转录后基因分析表明 ,
CymMV抗性是由 RNA介导的。
Su等[ 15]从蝴蝶兰中克隆到类黄酮 -3 , 5 -羟化
酶(F3 5 H)基因的 cDNA,利用基因枪法把它转入蝴蝶
兰 ,转基因的兰花花瓣颜色从粉红色变成品红色。 F3
5 H基因是细胞色素 P450家族之一 ,是合成 3 , 5 -羟
化花色素苷的关键酶 ,是蓝色和紫色花所必需的。
3　相关基因的克隆
近年来 ,从兰花的不同组织中鉴定和分离了许多基
因及其相关基因片段。查尔酮合成酶(又称苯基苯乙烯
酮合成酶 , ChalconeSynthase, CHS)是花色素苷生物合成
的一个重要的关键酶。 Liew等 [ 16]采用同源探针从兰花
cDNA文库中分离得到了 CHS的 cDNA———OCHS3、
OCHS4和 OCHS8,三者的核酸序列同源性大于 97%,氨
基酸序列有 76% ～82%的同源性。 NorthernBlot分析表
明 ,这 3个基因在没有花色素苷的幼叶中有很高的表达
量 ,但在有颜色的花中表达却相对较低 ,而在其它器官中
则不表达。许华欣等 [ 17]研究发现:蝴蝶兰 CHS基因为
多基因家族。白花红唇蝴蝶兰约有 11个 CHS基因 ,而
红花朵丽蝶兰约含有 7个 CHS基因 。采用 poCHS01作
探针 ,对以粉红花蝴蝶兰为母本与白花蝴蝶兰杂交选出
的淡红花、晕红花和白花后代进行 Southern杂交 ,结果表
明:子代的杂交条带与母本相似 ,而与父本完全不同 ,说
明来自白花红唇蝴蝶兰的 poCHS01可能是负责控制红
花或斑点花花色表达的基因 ,而白花亲本可能不存在
p0CHS01基因 ,或者由其他 CHS基因负责控制 。
O Neil[ 18] 等从朵丽蝶兰 (Doritaenopsishybrida
Hort.)柱头 cDNA文库中分离出乙烯生物合成的 ACC
合成酶和 ACC氧化酶的 cDNA,并对授粉及与授粉有关
因子的诱导基因在花各器官间的表达调控进行了初步分
析 。Bui等[ 19]在蝴蝶兰中克隆到了 3种 ACC合成酶基
因(Phal-ACS1、Phal-ACS2、Phal-ACS3),并研究了授
粉后基因的时空表达模式 ,结果表明:这 3种 ACC合成
酶基因主要在兰花不同的时期调节乙烯的合成 ,在蝴蝶
兰授粉后的子房发育中起作用 。
Tsai等[ 20]从蝴蝶兰中分离鉴定得到 4个 B功能基
因 ,包括 PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4、PeMADS5,它们
在植物体内表达的部位各不相同。 PeMADS2主要在尊
片 、花瓣中表达;PeMADS3则主要在花瓣、唇瓣中表达 ,
但两者在蕊柱中均有少量表达;PeMADS4只在唇瓣和蕊
柱中表达;PeMADS5主要在花瓣中表达 ,但在尊片 、唇瓣
和蕊柱中也有少量表达 ,它们可能在兰花形态建成中具
有不同的作用 。
Tsai等[ 21]从蝴蝶兰中分离得到一个 GLOBOSA/PIS-
TILLATA-like基因 ,并对它的功能进行了研究 ,命名为
PeMADS6基因。 SouthernBlot分析表明:PeMADS6基因
在蝴蝶兰基因组中是单拷贝的 ,在花萼、花瓣、唇瓣和花
柱中表达并且参与它们的发育。原位杂交确认了 Pe-
MADS6的表达方式 ,授粉信号可以抑制 PeMADS6在子
房中的表达 ,说明该基因对蝴蝶兰子房或者胚珠的发育
具有抑制作用。作为 B功能基因 , PeMADS6不仅仅是花
器官的特异基因 ,并且在兰花的寿命和子房发育中也起
功能作用。
4　蝴蝶兰抗病毒基因
已报道感染兰科的病毒共有 29种 ,被列为检疫性病
毒的主要有建兰花叶病毒(Cymbidiummosaicvirus, Cym-
MV)、齿兰 环斑病毒 (Odontoglosum ringspotvirus,
ORSV)、建兰环斑病毒(Cymbidiumringspottombusviurs,
CyRSV)、石斛兰花叶病毒(Dendrobiummosaicpotyvirus,
DenMV)、兰花斑点病毒 (Orchidfleckrhabdovirus,
VMV)[ 22] 。 1992年 ,美国 Honolulu实验室 [ 6]完成了对石
斛兰原生质体粒子枪轰击转化 ,用包裹着含 Nos-NPTⅡ
和木瓜环斑病毒(Papayaringspotvirus, PRSV)CP基因
的质粒粒子 ,轰击从 4个杂交种中获得的约 280个原生
质体 ,培养和筛选 21个月后 ,经 PCR和酶切分析 , 2个杂
交种的 13株苗含 Nos-NPTⅡ基因耐卡那霉素 ,其中 1株
整合 PRSVCP基因 。Seoh等 [ 23]设计了一对引物 ,用 RT
-PCR第一次快速检测出 CymMV和 ORSV两种病毒。
Eun等[ 24]用 CymMV和 ORSV两种病毒的 RNA依赖的
RNA聚合酶和 CP基因为靶子 ,合成了 4种 TaqMan探
针 ,检测出相同数量的两种兰花病毒 。
2001年 ,刘志昕等[ 25]对 CymMV运动蛋白基因进行
了克隆和序列分析 ,指出其报道的序列所编码的产物有
可能行使 MP的功能 ,即病毒特定基因编码的蛋白质参
与完成了植物病毒侵染增殖的基本过程。 2005年 ,
Ajikutira等[ 26]报道:CymMV和 ORSV感染的兰科植物
中的运动蛋白和外壳蛋白有互补作用。 CymMVMP基
因中有 3个重叠的开放阅读框 ,被称为 TGB(triplegene
block)。CymMVTGB1的转基因植株能够修复有细胞间
运动缺陷的 ORSV突变株。转入 ORSVCP基因的植株
能够支持 CymMVCP基因有缺陷的突变种的运动系统。
CymMV和 ORSV中的 MP和 CP的互补促进了病毒在植
物中的运动 ,但不支持长距离的病毒运动 。在研究非转
录 RNA能在病毒感染的植物中引发 HR类似反应的实
验中发现 , CyRSVCP基因编码范围内(2666 ～ 3526 nt)
的 860 nt长度的 RNA序列是 HR反应的引物 ,由此引发
的 HR反应可阻止病毒在寄主体内的蔓延[ 27] 。
植物病毒的卫星 RNA是依靠辅助病毒进行复制的
一类 RNA寄生分子 ,包装在辅助病毒基因组编码的外壳
蛋白中 ,现共发现有 26种病毒带有卫星 RNA。卫星
RNA与辅助病毒基因组同源性很小 ,对辅助病毒的复制
38 江　西　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　 　　　　　　22卷
是非必需的 ,但却常常辅助病毒和近种病毒的复制 ,调节
病毒的发病症状 ,绝大多数能减轻症状 [ 28] 。 CyRSV卫星
RNA是天然的多聚体形态 ,且多聚体形态不是 RNA复
制中的一个步骤 [ 29] 。有活性的突变体不像野生型那样
有壳体包被 ,这表明形状和大小也可影响 CyRSV卫星
RNA的存活[ 30] 。CyRSV卫星 RNA的复制与基因组缺
陷干扰 RNA(DIRNA)不同 ,它要求顺式复制的基因表
现出反式复制的锚定[ 31] 。
缺陷型干扰 RNA(DIRNA)是建兰环斑病毒 CyRSV
RNA潜在的遗传媒介[ 32] 。 Kolar等 [ 33]从 T7噬菌体
RNA聚合酶启动子克隆 CyRSVDIRNA并转入烟草中 ,
与花椰菜花叶病毒(CaMV)35 S启动子相联系 ,并合成
有生物活性的病毒 RNA。Dalmay等 [ 34]用 CyRSV有转录
活性的基因和缺损干扰 RNA接种烟草和本珊烟 ,结果得
到新的类似 DIRNA的快速积聚物 ,经克隆和测序证实
此物为 DIRNA完整的二聚体。 Havelda等 [ 35]研究认为 ,
CyRSV基因组和 DIRNA3末端顺式作用区域都可折叠
成由 3个发夹结构和 2个短的非碱基配对区组成的稳定
的径环结构。在不消除 DIRNA感染的情况下 ,任何一
个保守的径环结构都不可被删除。研究表明 , CyRSV病
毒基因组 3末端径环结构对病毒 RNA的复制很重要 ,
这个结构的功能也可能启动 CyRSVDIRNA负链的
合成[ 36] 。
RNA沉默现象被认为是真核生物进化过程中保留
下来的一种抵抗病毒、转基因和转座子等外源核酸分子
寄生生物入侵及在体内迁移的自我防御系统 [ 37 ～ 39] 。研
究表明 ,在病毒感染的细胞中 , p19干扰蛋白介导的 siR-
NA阻塞了 RNA沉默信号系统的传导[ 40] 。 2005年 , Mol-
nar等[ 41]用感染 CyRSV植物的 siRNA进行序列分析 ,
CyRSVsiRNA在病毒基因组上随机分布 ,这表明有 siR-
NA病毒起源的重要位点。与 p19干扰蛋白绑定的
CyRSVsiRNA与序列中的 siRNA有着相同的不对称极性
以及不完整的双链 RNA。
5　蝴蝶兰的转基因技术
目前 ,常用的几种外源基因导入蝴蝶兰的方法 ,如
农杆菌介导转化法、基因枪转化法 、PEG介导转化法和
花粉管道法等 ,并且获得了有转化证据的转基因植株 。
其中 ,农杆菌介导法和基因枪法应用居多 。
农杆菌介导法以蝴蝶兰原球体和类原球体为材料 ,
利用农杆根瘤菌(Agrobacteriumtumefaciens,含 Ti质粒)
和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogene,含 Ri质粒)进行
基因转殖。通常认为 ,农杆菌介导转化法适合于双子叶
植物 ,而在单子叶植物的转化上存在一定的困难。为探
索农杆菌介导转化法是否适合于单子叶植物的兰花 ,
1997年 Hsieh等[ 11]进行了尝试 ,将蝴蝶兰的原球茎和农
杆菌 PMT1一起培养 ,结果表明:不同品种和不同培养时
间的原球茎 GUS基因的表达效率不同 ,用培养 10 d的
Phal.AsianElegancer的原球茎为材料 , GUS基因的表达
效率为 100%;将表现 GUS基因活性的组织接种到含有
100μg/mL卡那霉素的培养基上筛选 30 d,从中获得了
转化体 , GUS基因检测结果表明 ,转化体仍有很强的 GUS
基因活性 ,但外源基因是否已整合到基因组则有待于进
一步研究。
2000年 , Belarmino等[ 7]通过松脆的愈伤组织与农杆
菌共同培养 ,细胞团用附加 20 μmol/LAS的农杆菌侵
染 ,经共培养后 ,潮霉素筛选筛选愈伤组织 ,最后获得了
转基因蝴蝶兰的再生植株。 2002年 ,柴明良等 [ 42]以蝴蝶
兰原球茎为试材 ,与农杆菌共同培养后 ,首先进行增殖 ,
然后对新形成的原球茎状体在含抗菌素的培养基中进行
多代选择 ,获得了 GUS染色反应、PCR和 Southern印迹
证实的稳定转化的蝴蝶兰。可见 ,农杆菌介导转化法在
兰花的遗传转化中应用前景广阔 。
基因枪法又称微弹轰击法 ,利用被放电或机械加速
的金属颗粒对细胞击孔。先将外源 DNA溶液与钨、金等
金属微粒共同保温 ,使 DNA吸附于金属颗粒表面 ,然后
放电加速金属颗粒 ,使之直接射入受体植物细胞 ,外源遗
传物质随金属颗粒进入细胞内部 。基因枪法作为植物遗
传工程中一个比较成熟的技术 ,已在许多植物上得到成
功应用。在兰花的转基因研究中 ,以基因枪法转化成功
的例子也很多 ,如谢永祥等 [ 43]将 GUS基因成功转入到
蝴蝶兰中 ,并获得了转基因植株。 Hsieh等[ 11]也用基因
枪法和花粉管道法分别将 Firefly基因成功转入到蝴蝶
兰中 ,并获得了转基因植株 。
6　小结
作为重要的观赏花卉 ,蝴蝶兰具有很高的经济价值
和广阔的市场前景。虽然蝴蝶兰在基因工程方面取得了
一些进展 ,但在市场应用上还有很大的距离 。
蝴蝶兰组织培养及快繁技术已日趋成熟 ,但还存在
一些问题。首先不同接种方法、培养条件、培养基均会影
响其再生力 ,并伴有嵌合体产生 ,无法提高受体组织的再
生 ,从而影响再生系统的建立。其次 ,兰花转基因大多采
用杂种胚、原球茎或类原球茎为起始试材 ,由于未经过中
间的愈伤组织发生过程 ,往往使大多数对选择药剂有抗
性的再生材料成为嵌合体。采用多代选择的策略有可能
减少嵌合体的产生。但如何进行有效的检测以获得稳定
遗传的转基因植株仍是亟待解决的问题 。
蝴蝶兰生长缓慢 ,这可能与植物光合 、呼吸、能量代
谢等相关基因有关 ,因此 ,加快对这些基因的分离 、克隆
和功能分析将对阐明其生长缓慢的机制有所贡献 ,也能
给生产中加快蝴蝶兰生长提供理论依据 。具有特殊香味
的功能基因和抗病基因转入蝴蝶兰同时进行培育也将是
未来发展的趋势 。随着病原物中诱导蝴蝶兰产生抗病毒
病反应的基因、蝴蝶兰自身的抗病毒基因及抗病毒病信
号传导途径相关基因的发现和克隆 ,研究人员将利用基
39　12期　　　　　　　　　　　　　　　张文惠等:蝴蝶兰基因工程研究进展
因工程技术培育出具有多种防卫反应和抗病力强的蝴蝶
兰新品种。
参考文献:
[ 1] PotorG, SagawaY.AmethodofvegetativepropagationofPhalae-
nopsisstemcutings[ J] .AmerOrchidSocBull, 1949, 18(2):739
～ 742.
[ 2] IntuwongO, SagacusY.ClonalpropagationofPhalaenopsisby
shoot-tipculture[ J] .AmerOrchidSocBul, 1974, 43(5):893
～ 895.
[ 3] GriesbachRJ, HammondJ.IncorporationofGUSgeneintoor-
chidsviaembryoelectrophoresis[ J].ActaHort, 1993, 336(1):
165～ 169.
[ 4] TeeCS, MarziahM, TanCS,etal.Evaluationofdifferentpromot-
ersdrivingtheGFPreportgeneandselectedtargettissuesfor
particlebombardmentofDendrobiumsonia17[ J] .PlantCelRe-
ports, 2003, 21(5):452～ 458.
[ 5] MenS, MingX, WangY, etal.Genetictransformationoftwospe-
ciesoforchidbybiolisticbombardment[ J].PlantCellReports,
2003, 21(6):592～ 598.
[ 6] KuehnleAR, SugiN.TransformationofDendrobiumorchidusing
particlebombardmentofprotocorms[J].PlantCelRep, 1992, 11
(9):484 ～ 488.
[ 7] ChenJT, ChangWC.Directsomaticembryogenesisandplantre-
generationfromleafexplantsofPhalaenopsisamabilis[ J] .Biolo-
giaPlantanm, 2006, 50(2):169～ 173.
[ 8] SagawaY, KimuraT, IchihashiS, etal.Biotechnologyinorchid
[ C].ProcNagoyaInt.OrchidCongress, Nagoyq, Japan, 1990:46
～ 48.
[ 9] HsiehYH, HsuTY, HuangPL.Studiesongenetictransformation
ofPhalaenopsisbymicroprojictilebombardment[ J] .JChinese
SocHortSci, 1995, 4(3):174～ 185.
[ 10] BelarminoM, MMi.Agrobacterium-mediatedgenetictransfor-
mationofaPhalaenopsisorchid[J].PlantCellReports, 2000, 19
(4):435～ 442.
[ 11] HsiehRM, ChenWH, HsuHM, etal.AgrobacteriumTumefa-
cients-mediatedtransformationofPhalaenopsisorchid[J].Rept
TaiwanSugarRes, 1997, 155:41～ 45.
[ 12] AnzaiH, IshiY, SchchinoheM, etal.TransformationofPhalae-
nopsisbyparticlebombardment[J] .PlantTissueCultureleters,
1996, 13:265 ～ 272.
[ 13] ChaiML, XuCJ, SenthilKK, etal.Stabletransformationof
protocorm likebodiesinPhalaenopsisorchidmediatedby
Agrobacteriumtumefaciens[ J] .ScientiaHorticulturae, 2002, 96
(3):213～ 224.
[ 14] Li-JenLiao, I-ChunPan, Yuan-LiChan,etal.Transgenesi-
lencinginPhalaenopsisexpressingthecoatproteinofCymbidium
mosaicvirusisamanifestationofRNA-mediatedresistance
[ J].MolBre, 2004, 13(3):229～ 242.
[ 15] SuV, HsuBD.Cloningandexpressionofaputativecytochrome
P450genethatinfluencesthecolorofPhalaenopsisflowers[ J] .
BiotechnolLet, 2003, 25(22):1933～ 1939.
[ 16] LiewCF, GohCJ, LohCS, etal.Cloningandcharacterization
offul-lengthcDNAclonesencodingchalconesynthasefrom
theorchidBromheadiafinlaysoniana[ J] .PlantPhysiolBio-
chem, 1998, 36(9):647 ～ 656.
[ 17] 许华欣 ,黄鹏林.蝴蝶兰苯基苯乙烯酮合成酶 cDNA之选殖
及分析 [J] .中国园艺 , 1999, 45(1):19～ 35.
[ 18] o NeilSD, NadeauJA, ZhangXS.Interorganregulationof
ethylenebiosyntheticgenesbypolination[J] .PlantCel, 1993,
5(4):419～ 432.
[ 19] BuiAQ, o NeilSD.Three1-aminocyclopropane-1-car-
boxylatesynthasegenesregulatedbyprimaryandsecondarypol-
linationsignalsinorchidflowers[ J].PlantPhysiol, 1998, 116:
419～ 428.
[ 20] TsaiWC, KuohCS, ChuangMH.FourDEF-likeMADSbox
genesdisplayeddistinctfloralmorphogeneticrolesinPhalaenop-
sisorchid[ J] .PlantCelPhysiol, 2004, 45(7):831～ 844.
[ 21] TsaiWC, LeePF, ChenHI, etal.PeMADS6, aGLOBOSA/PIS-
TILLATA-likegeneinPhalaenopsisequestrisinvolvedinpetal-
oidformation, andcorrelatedwithflowerlongevityandovaryde-
velopment[ J] .PlantCelPhysiol, 2005, 46(7):1125 ～ 1139.
[ 22] 张建军 ,谢为龙.兰花病毒病研究进展 [ J] .植物检疫 , 1999,
13(2):109～ 111.
[ 23] SeohML, WongSM, ZhangL.SimultaneousTD/RT-PCRde-
tectionofCymbidiummosaicpotexvirusandOdontoglossumring-
spottobamoviruswithasinglepairofprimers[ J] .ViolMeth-
ods, 1998, 72(2):197 ～ 204.
[ 24] EunAJ, SeohM, WongS.Simultaneousquantitationoftwoor-
chidvirusesbytheTaqManreal-timeRT-PCR[ J] .Virol
Method, 2000, 87(2):151 ～ 160.
[ 25] 刘志昕 ,吴豪 ,潘俊松 ,等.建兰花叶病毒运动蛋白基因克隆
及序列分析 [J].中国病毒学 , 2001, 16(1):51～ 54.
[ 26] AjikutiraP, LohCS, WongSM, etal.Reciprocalfunctionof
movementproteinsandcomplementationoflongdistancemove-
mentofCymbidiummosaicvirusRNAbyOdontoglossumringspot
viruscoatprotein[ J] .JGenVirol, 2005, 86(5):1543 ～ 1553.
[ 27] SzityaG, BurgyanJ.Cymbidiumringspottombusviruscoatpro-
teincodingsequenceactsasanavirulentRNA[ J] .Journalof
Virology, 2001, 75(5):2411 ～ 2420.
[ 28] 柴立红 ,陈集双 ,陈子元.黄瓜花叶病毒致弱卫星 RNA对辅
助病毒含量的影响 [J] .生物化学与生物物理进展 , 2004, 31
(8):752～ 755.
[ 30] DalmayT, RubimoL.ReplicationofCymbidiumringspotvirus
sateliteRNA mutants[ J].Virology, 1995, 206(2):1092
～ 1098.
[ 31] RubinoL, PantaleoV, NavaroB, etal.Expressionoftombusvir-
usopenreadingframes1and2issuficientforthereplicationof
defectiveinterfering, butnosateliteRNA[ J] .GenVirol, 2004,
85(10):3115～ 3122.
[ 32] RurgyanL.Expressionofhomologousandheterologousviralcoat
proteinencodinggenesusingrecombinantDIRNAfromCymbid-
iumringspottombusvirus[ J].Gene, 1994, 138(1 ～ 2):159 ～
161. (下转第 43页)
40 江　西　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　 　　　　　　22卷
3　讨论
高温胁迫下植物体内活性氧(ROS)积累 ,启动膜脂
过氧化作用 ,导致植物体生理失调 。SOD、POD和 CAT能
有效清除植物体内的自由基和过氧化物 。 MDA是膜脂
过氧化产物 ,其含量通常作为膜过氧化程度的指标 ,表示
细胞膜的过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱[ 6] 。
脯氨酸可以降低受到胁迫的细胞内的水势 ,使细胞吸水 ,
增加细胞的渗透调节能力 ,使其免受更深的伤害 [ 7] 。可
溶性糖和可溶性蛋白含量也是重要的渗透调节物质 ,在
一定程度上说明植物在逆境下的受伤害程度和抵抗
能力。
已有研究表明 , NO可提高高温胁迫下小麦的抗氧
化系统能力 ,保护光合机构[ 8] 。本试验结果显示 , 200
μmol/LSNP处理对高温胁迫下半夏植株具有明显的保
护作用 ,包括提高叶片中 SOD、POD、CAT3种保护酶活
性 ,降低膜脂过氧化产物 MDA的生成 ,促进游离 Pro的
累积 ,提高可溶性糖和可溶性蛋白的含量 ,说明适宜浓度
的 SNP能提高高温条件下半夏的抗氧化能力。
Beligni和 Lamatina认为 NO对植物具有双重作
用 [ 9] 。NO在生物胁迫下互相矛盾的效应依赖于其浓度
的不同:低浓度的 NO可以阻止自由基介导的脂质氧化 ,
扮演保护角色;高浓度下 ,它与产生活性氧有协同效
应 [ 10] ,则会对细胞伤害严重 。本研究也发现 ,低浓度
SNP溶液(100、200 μmol/L)对高温下半夏抗氧化能力有
提高作用 ,而高浓度 SNP溶液(1000 μmol/L)处理时对
半夏生长出现抑制作用 ,可能是由于高浓度 SNP诱导细
胞内高浓度的 H2O2积累 ,产生重度氧化胁迫 ,加剧了环
境胁迫伤害 。关于 SNP影响半夏生长的机理还有待深
入研究。
参考文献:
[ 1] 赵志光 ,谭玲玲 , 王锁民 , 等.植物一氧化氮(NO)研究进展
[J] .植物学通报 , 2002, 19(6):659～ 665.
[ 2] 杨亚军 ,李利红 ,赵会杰 ,等.外源 NO对高温强光胁迫下小麦
叶片膜脂过氧化和叶绿素荧光的影响 [ J] .安徽农业科学 ,
2008, 36(29):12571～ 12574.
[ 3] 刘招龙 ,郭团玉 ,孙益林 ,等.外源一氧化氮供体对高温胁迫下
梨叶片膜脂过氧化的影响 [ J].中国农学通报 , 2006, 22(11):
179～ 181.
[ 4] 李合生.植物生理生化实验原理和技术 [ M].北京:高等教育
出版社 , 2000.
[ 5] 张以顺 ,黄霞 ,陈云凤.植物生理学实验教程 [ M].北京:高等
教育出版社 , 2009.
[ 6] 薛建平 ,张爱民 ,方中明 , 等.水杨酸对半夏植株生长的影响
[J] .中国中药杂志 , 2007, 32(12):1134 ～ 1136.
[ 7] 彭兰华 ,丁梁斌 ,胡长效.一氧化氮对玉米幼苗抗盐性的影响
[J] .江西农业学报 , 2006, 18(5):6 ～ 8.
[ 8] 王志勇.外源 NO对高温强光胁迫下小麦叶片光合机构的保
护作用 [J].安徽农学通报 , 2009, 15(5):70 ～ 71.
[ 9] BeligniMV, LamatinaL.Isnitricoxidetoxicorprotective?
[J].TrendsinPlantScience, 1999, 4:299～ 300.
[ 10] 肖强 ,郑海雷.植物中的一氧化氮信号分子 [ J] .生物学通报 ,
2005, 40(11):17～ 18.
(上接第 40页)
[ 33] KolarA,DalmayT, BurgyanJ, etal.DefectiveinterferingRNA
-mediatedresistanceagainstCymbidiumringspottombusvirus
intransgenicplants[J] .JVirol, 1993, 192(2):551 ～ 555.
[ 34] DalmayT.GenerationofdefectiveinterferingRNAdimmersof
Cymbidiumringspottombusvirus[ J] .Virology, 1995, 207(2):
510～ 517.
[ 35] HaveldaZ, DalmqyT, BurgyanJ.Localizationofcisactingse-
quencesessentialforCymbidiumringspottombusvirusdefective
interferingRNAreplication[J] .JGenVirol, 1995, 76(9):2311
～ 2316.
[ 36] HaveldaZ, BurgyanJ, DalmqyT.3 Termimalputativestem-
loopstructurerequiredfortheaccumulationofCymbidiumring-
spotviralRNA[ J] .Virology, 1995, 214(1):269 ～ 272.
[ 37] NapoliC, LenieuxC, JorgensenR.Introductionofachimeric
chalconesynthasegeneintopetuniaresultsinreversibleco-
suppressionofhomologousgenesintrans[ J] .PlantCel, 1990, 2
(4):279～ 289.
[ 38] MatzKeM, MatakeAJ, KooterJM.RNA:guidinggenesilencing
[ J] .Science, 2001, 293:1080～ 1083.
[ 39] 牛宝龙 ,翁宏飚 ,孟智启 ,等.RNA干涉与基因功能研究进展
[ J] .浙江农业学报 , 2005, 15(4):263 ～ 268.
[ 40] LakatosL, SzityaD.MolecularmechanismofRNAsilencing
suppressionmediatedbyp19proteinoftombusviruses[ J] .EM-
BOJ, 2004, 23(4):876～ 884.
[ 41] MolnarA, CsorbaT, LakatosL, etal.Plantvirus-derivedsmal
interferingRNAsoriginatepredominantlyfromhighlystructured
singlestrandedviralRNAs[ J] .JVirol, 2005, 79(12):7812
～ 7818.
[ 42] 柴明良 ,金斗焕.农杆菌介导的蝴蝶兰基因转化系统的建立
[ J] .园艺学报 , 2004, 31(4):537 ～ 539.
[ 43] 谢永祥 ,许聪耀 ,黄鹏林.应用基因枪法于蝴蝶兰基因转殖之
研究 [ J] .中国园艺 , 1995, 41(3):174 ～ 185.
43　12期　　　　　　　　　　　王春艳等:外源 NO对高温胁迫下半夏抗氧化系统的影响