全 文 ：收稿日期:2003-12-31;修回日期:2004-04-15
基金项目:国家转基因植物研究与产业化专项项目
(J2002-B-006)和国家 863项目(2001AA244082)资助
作者简介:信金娜(1980-), 女 ,河北邢台市人 , 2001
年本科毕业于河北农业大学 ,北京林业大学在读研究生 ,主
要从事草坪草育种工作.
草地早熟禾愈伤组织诱导及植株再生
信金娜 , 韩烈保 , 刘　君 , 罗　莉 , 李　雪
(北京林业大学草坪研究所 ,北京　100083)
摘要:以成熟种子和胚轴为外植体诱导草地早熟禾愈伤组织 ,比较草地早熟禾四个品种的愈
伤诱导情况和不同 6-BA 浓度 、愈伤年龄等因素对愈伤组织分化能力的影响。结果表明:成熟种
子的出愈率与胚性愈伤诱导率均高于胚轴;MS+2 , 4— D(2mg/ L)+6-BA(0.1mg/ L)培养基为草
地早熟禾 Mardona品种较为合适的愈伤培养基 , 其诱导率为 58.3%;MS+BA(3mg/L)+KT(0.2
mg/ L)为较为适合的分化培养基 , 再生率高达 70%;随着继代次数的增加 , 草地早熟禾分化能力能
够继续保持。选择致密 、易碎 、生长迅速的愈伤继代能够保持草地早熟禾的胚性 ,可以为遗传转化
提供长期良好的植物材料。
　　关键词:草地早熟禾;愈伤;分化
　　中图分类号:S688.4　　文献标识码:A　　文章编号:1000-6311(2004)04-0046-05
Study on Callus Induction and Plant Regeneration System of Poa pratensis .XIN Jin_
na , HAN Lie_bao , LIU Jun ,LUO Li , LI Xue(Institute of Turfgrass Science ,Beij ing
Forestry University , Beijing 100083 , P.R .China):Grassland of China , No.4 ,
2004 ,pp.46 ～ 50.
Abstract:The tissue culture responses of mature seeds and radicel w ere compared.Callus
induction w ere studied in four cultivars of Poa pratensis L .Effect of 6-BA concentra-
tio n , callus_age and other factors on dif ferentiation ability w ere studied.Results show ed
that mature seed as explants had higher appearance rate than radicel;MS medium , sup-
plemented with 2mg/L 2 , 4-D and 0.1mg/L BA was the best medium for cultivar
`Mardona of Poa pratensis L., callus induction rate was 58.3%;MS medium , supple-
mented wi th 3mg/L BA and 0.2 mg/L KT was suitable for differentiation medium , re-
generation rate was 70%;w ith subculture times increased , it still keep differentiation a-
bility.Selecting compact , f riable and g row n rapidly callus subculture , can alw ays provid-
ed good plant material for gene t ransfer for long term.
Key words:Poa pratensis L.;Callus;Dif ferentiations
　　采用基因工程对草地早熟禾 (Poa
pratensis L.)进行品种改良 、新品种选育已成
为当前草地早熟禾生物技术领域研究的重
点。草地早熟禾遗传转化已有成功报
道[ 1 ～ 3] ,但是转化效率较低 。草地早熟禾组
—46—
第 26卷　第 4期　　　　　　　　　　　　中　国　草　地　　　　　　　　　　　　2004 年 7 月
Vol.26　No.4 　 　　　　　　　　　　　Grassland of China　　　　　　　　 　　　　Jul .2004
织培养开始于 80年代[ 4] ,之后 ,不同的草地
早熟禾组培再生体系相继建立起来[ 5 ～ 15] ,但
还存在再生频率较低 、维持愈伤胚性困难等
不足 。本文从不同激素水平 、基因型 、继代时
间研究了草地早熟禾再生体系 ,建立了相对
稳定高频的再生体系 ,可为下一步遗传转化
工作提供基础材料。
1　材料与方法
1.1　植物材料
草地早熟禾 `Mardona 、`Oxforad 、
`Compact 品种种子均由丹麦丹农种子公司
提供 ,`Baron 由荷兰百绿集团提供。
1.2　外植体的获得
采用成熟种子与胚轴作为外植体 ,胚轴
来源于刚萌发的种子。成熟种子浸入 70%
酒精 30s ,无菌水冲洗 2 ～ 3次 , 25%次氯酸
钠溶液消毒 1h ,无菌水清洗 5 ～ 6次 。
1.3　培养基
培养基为 MS 基本培养基 ,附加不同量
的植物激素 、30g/ L 蔗糖 、8g/L 琼脂 , pH 值
5.8。愈伤组织诱导与继代使用相同 PD培
养基:MS +2 , 4-D(2mg/ L)+6-BA(0.1
mg/L)。愈伤组织分化和生根培养基:MS+
KT(0.2mg/L)+6-BA(不同浓度)。
1.4　培养方法
愈伤组织诱导时每个培养皿 40个外植
体 ,4 个重复 ,一个月继代一次 ,愈伤组织诱
导和继代在黑暗中进行。愈伤组织分化与生
根条 件为 16h 光 照 , 8h 黑 暗 , 光 照度
2000Lx ,温度均为 25±1℃。
1.5　数据统计及分析方法
出愈率=愈伤数/外植体数×100%;胚
性愈伤诱导率=胚性愈伤数目/外植体数×
100%;再生率 =长苗愈伤数/愈伤总数 ×
100%;绿苗率 =绿苗愈伤数/愈伤总数 ×
100%;白化率=白化苗愈伤数/愈伤总数×
100%。
1.6　再生植株的移栽
将再生的植株敞开瓶口 ,注入清水 ,室温
下炼苗 3 ～ 4d后 ,冲洗干净根部的培养基 ,移
栽入花盆中 ,花盆中基质为砂土∶壤土=2∶1 。
2　结果与分析
2.1　基因型对愈伤组织诱导的影响
将草地早熟禾 4个品种接种到 PD 培养
基中诱导愈伤组织 ,接种到培养基中的种子
第3d开始发出小芽 ,同时伴随着愈伤的形
成。15d即可出现带有颗粒状突起的愈伤组
织 ,呈淡黄到白色 ,呈胚性愈伤状态 。不同品
种诱导愈伤的结果见表 1。
表 1　不同品种诱导愈伤比较
Table 1　Callus induction dif ference of four cultivars
品种名称 外植体数目 出愈数 出愈率(%)
胚性愈伤诱导率
(%) 愈伤状况
Baron 180 69 38.30 6.7 愈伤质量较次 ,多数呈褐色 ,生长缓慢
Mardona 180 105 58.30 20　 愈伤质量较好 ,呈现淡黄色到白色,生长迅速
Compact 180 77 42.80 10　 愈伤质量一般 ,大部分为黄色 ,颜色发暗
Oxforad 180 69 38.30 8　 愈伤质量一般 ,深黄色 ,生长缓慢
—47—
信金娜　韩烈保　刘 　君等　草地早熟禾愈伤组织诱导及植株再生
　　由表 1 看出 ,不同基因型在相同的 PD
培养基表现不同 。从出愈率和愈伤生长状况
来看 , Mardona 品种表现最好 ,出愈率达到
58.3%,且胚性愈伤出现较多 ,这表明 PD培
养基是 Mardona 品种的最适愈伤诱导培养
基。后面实验中采用的均为 Mardona 品种
PD培养基上诱导出的愈伤组织。
2.2　不同外植体诱导愈伤的影响
采用成熟种子与长 1cm 的胚轴诱导愈
伤 ,结果见表 2。
表 2　胚轴与种子诱导愈伤比较
Table 2　Callus induction difference between radicle and mature embryo
外植体种类 外植体总数 出愈数 出愈率(%)
胚性愈伤诱导率
(%)
胚　　轴 74 38 51.40 15
成熟种子 70 41 58.60 20
　　由表 2可见 ,成熟种子作为外植体的出
愈率与胚性愈伤诱导率均较胚轴高 ,两者获
得的胚性愈伤结构均很好且增殖较快 ,考虑
到操作的简便性 ,采用成熟种子作为外植体。
2.3　不同 6-BA浓度对再生的影响
Mardona品种诱导 4 个月的愈伤组织 ,
放入含有不同 6-BA 浓度的分化培养基中
培养 ,每瓶 10块 ,每个处理 4瓶。观察可见 ,
愈伤组织在 20d出现绿色芽点 , 1个月后转
入新鲜的相同培养基中 , 40d便可形成完整
植株。在形成绿苗的同时 ,产生不同程度地
白化苗 ,结果见表 3。
由表 3可以看出 ,6-BA浓度为 0时 ,愈
伤组织分化率为 0;在 6-BA 浓度大于 1
mg/ L时 ,随着浓度增大愈伤组织分化率也增
加 ,同时白化率也呈增加趋势;6-BA 浓度
为0.1mg/ L 时 , 虽然愈伤分化率最高 , 为
30%,但是其白化率也最高。总体上看 ,6-
BA为 3mg/L 时 ,愈伤组织分化绿苗率最高。
所以 , MS+6-BA(3mg/L)+KT(0.2mg/L)
为愈伤组织分化最为合适的培养基 。
2.4　不同愈伤年龄对分化的影响
Mardona品种在 PD 培养基上诱导出的
愈伤组织 ,在相同培养基中继代培养后 ,显微
表 3　6-BA 浓度对再生的影响
Table 3　Regeneration state on different
concentrations of 6-BA
培养基
名　称
6-BA
(mg/ L)
愈伤分化率
(%)
白化率
(%)
绿苗率
(%)
KT1 0　 0　 0 　 0 　
KBT 0.1 30　 20 　 10 　
KB1 1　 10.7 10.7 0 　
KB2 2　 25　 10 　 6.25
KB3 3　 29.2 18.75 12.5
镜下观察可见两种典型的类型(图 1 、图 2),
第一种类型中的愈伤生长迅速 ,呈颗粒状结
构 ,形状有球形 、心形 ,有些呈现体细胞胚发
育的早期形态[ 5] ;第二种愈伤组织为水状 ,
生长缓慢 ,颜色暗淡 ,分化只能形成毛状根 ,
不能形成植株。选择颗粒状愈伤继代培养 ,
把不同继代年龄的愈伤组织转入 KBT 分化
培养基中 ,实验结果见表 4 。愈伤组织继代 5
个月再生率最高 ,达 74%,同时白化苗现象
较明显 ,达到 33%。愈伤年龄 7.5个月的时
候 ,绿苗率最高达 60%。随着愈伤时间增
加 ,愈伤分化呈波浪型曲线。但从总体上看 ,
在 8个月内草地早熟禾愈伤没有因为继代次
—48—
中国草地　2004 年　第 26卷　第 4期
数增多而胚性下降 ,这与 McDonnell等人报
道[ 4 ,10]有所不同 。对于草地早熟禾而言 ,采
用诱导出的胚性愈伤或者继代产生的胚性愈
伤继代 , 能够保持胚性 ,进一步证实了余见
明[ 3]的结论。
表 4　不同年龄愈伤分化情况
Table 4　Differentiation state of different aged callus
愈伤年龄
(月) 愈伤总数
再生率
(%)
绿苗率
(%)
白化率
(%)
2.5 40 40 32.00 8.0
3.5 47 61 38.30 22.7
4　 58 31 12.10 19.0
5　 39 74 41.00 33.0
5.5 40 50 23.30 26.7
7.5 40 70 60.00 10.0
图 1　第一类愈伤组织
Fig.1　Callus with good appearance
图 2　第二类愈伤组织
Fig.2　Callus with bad appearance
2.5　再生植株的生根与移栽
愈伤组织培养产生的再生植株如图 3。
对于没有生根的再生苗 ,放在相同分化培养基
中 ,可以形成毛状根(图 4),生长 2个月的再
生植株 ,移栽到花盆中能够100%成活(图5)。
图 3　草地早熟禾再生植株
Fig.3　Plant regeneration of Poa pratensis`Mardona
图 4　草地早禾熟禾生根
Fig.4　Rooting of Poa pratensis `Mardona
图 5　移栽后的再生苗
Fig.5 Regeneration shoots after transfer to po ts
3　结论与讨论
3.1　基因型的差异导致了草地早熟禾再生
体系建立过程中众多不同的表现形式 ,如形
成胚性愈伤的状态不同等[ 5] ,对于基因型产
生的差异已有不同程度的报道[ 5 , 7 , 13] ,选择
适宜的基因型为遗传转化的材料是建立高
效 、稳定遗传转化体系的必要条件 。实验用
的Mardona品种具有高的胚性愈伤诱导率 、
高的再生频率 ,其胚性愈伤可以作为遗传转
—49—
信金娜　韩烈保　刘 　君等　草地早熟禾愈伤组织诱导及植株再生
化的受体材料。
3.2　建立草地早熟禾体细胞胚离体培养再
生体系研究中 ,幼穗由于组织幼嫩 、分生能力
强 、再生频率高 , 被认为是理想的外植体材
料[ 5 ,10] 。但幼穗取材的季节性较强[ 8] ,本次
实验没有采用 ,在今后的遗传转化过程中 ,建
议采用幼穗诱导胚性愈伤 ,作为遗传转化的
受体材料 。
3.3　建立良好的体细胞胚胎发生体系必须
满足的条件之一是体细胞胚能很好地维持下
来或快速繁殖 ,遗传上稳定 ,而维持愈伤组织
胚性常成为单子叶植物组培中难以解决的问
题[ 16] 。对于草地早熟禾`Mardona 品种而
言 ,采用相同的诱导培养基继代 ,能够让继代
6次的愈伤保持较高的再生频率 ,这对于遗
传转化是非常有利的 。Chi 等人用生长 10
个月的愈伤组织作为基因枪转化的受体材
料 ,得到 10株转基因植株[ 2] ,进一步证实了
采用长时间继代的愈伤组织作为遗传转化受
体的可行性。
3.4　采用成熟种子为外植体建立草地早熟禾
再生体系的研究中 , `Baron 是迄今为止报道的
再生频率最高的品种 ,其再生频率为 45%[7] 。
而在本次实验中 ,Baron品种在 PD培养基上诱
导率为最低 ,这与培养基成分有关。
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