全 文 ：2008年第5期 总第150期草业与畜牧 CAOYEYUXUMU
赵小强,马晖玲 *,周万海
(甘肃农业大学草业学院,甘肃 兰州 730070)
草地早熟禾再生体系建立的研究进展
收稿日期:2007-09-27
基金项目:甘肃农业大学草业学院草业科学国家级重点学科
学术骨干科研项目暨草业生态系统教育部省部共建重点实验
室资助项目
作者简介:赵小强 (1985- ),男,甘肃武山人,硕士研究
生,从事草坪草、牧草种质资源及其育种的研究。
*通讯作者
摘 要:在草地早熟禾再生体系建立的过程中,就其影响因素如外植体的选择、培养条件、基因型等方面综述了
国内外草地早熟禾再生体系的研究进展。
关键词:早熟禾;组织培养;再生体系
中图分类号:S688.4 文献标识码:B 文章编号:1673-8403(2008)05-0019-04
草地早熟禾 (PoapratensisL.) 是禾本科早熟禾
属的一种优质冷季型草坪草。在中国栽培历史悠久,
种植面积广泛,主要分布在中国西北和华北地区[1]。
草地早熟禾以其抗性强、适应性广、植株低矮、绿期
长、坪质优美等特性,在绿化、美化城市、运动场建
设、改善生态环境和提高人民生活质量等方面被广泛
应用。但它的抗旱能力不强,遇旱容易变成褐色[2],
且具有兼性无融合生殖特性[3~6],有些品种的无融合生
殖率高达98%以上[4],因此利用传统育种方式改良品
种有一定困难,而利用基因转化手段或体细胞杂交可
获得具有优良性状的植株。目前我国使用的草坪草种
子90%以上从国外进口[7],在很大程度上制约了我国
草坪业的发展,因此,选育自己的品种势在必行。采
用基因工程对草地早熟禾进行品种改良、新品种选育
已成为当前草地早熟禾生物领域研究的重点[3],而改
良与选育的成功关键是再生体系的建立。
组织培养及再生体系的建立应注意的主要环节
有:外植体的选择、外植体的处理、培养条件、基因
型差异等。
1 外植体的选择
外植体的选择是建立再生体系的重要步骤之一。
就草地早熟禾再生体系的建立而言,常采用的外植体
为幼穗、成熟种子、匍匐茎、茎尖分生组织、胚轴、
胚芽鞘、叶片、茎段等。
1984年,McDonnel和 Conger[2]开始研究草地早
熟禾再生体系的建立,他们用成熟种子诱导出了胚性
愈伤组织,试验发现其愈伤组织的植株再生率很低,
最高仅有6%,且从组织解剖学研究上发现草地早熟
禾不是呈体胚发生途径而是呈器官发生途径。
1986年,Boyd和 Dale[10]用成熟种子作外植体,
得到了愈伤组织和再生苗,但分化率很低。
1988年,Pieper和Smith[13]以3个草地早熟禾成熟
种子、温室种子植株1~2cm的匍匐茎、来自微培养植
株的节尖部分为外植体,在对整个植株快速再生繁殖
体系进行研究时,发现前两者的再生频率不如后者高。
1989年,VanderValk等[8]报道了草地早熟禾成熟
种子及幼穗的组织培养结果,试验发现在相同条件
下,采用幼穗作为外植体其再生率高达79%,而成熟
种子只有3%,证明幼穗是草地早熟禾诱导胚性愈伤
组织的最好外植体,并且利用幼穗愈伤组织建立了悬
浮细胞系,分离培养原生质体并得到了白化苗和分化
的根。朱根发等人[9]用草地早熟禾品种Wabash和
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Chalenger的幼穗为外植体,进行了组织培养再生体
系的研究,发现幼穗的愈伤组织分化率高达 72.7%,
从而进一步证实了VanderValk等人的结论。
1993年,Kirsten等[15]以成熟种子为外植体获得愈
伤组织且建立了胚性细胞悬浮系再生体系,获得了再
生植株。
1995年,Jefrey等用成熟种子诱导愈伤组织,该
研究使Baron品种再生率高达46%[11]。四年后,他又
把这个再生体系应用于遗传转化中[12],获得6株转基
因植株。
1996年,ShangiangChiwon[14]以草地早熟禾的胚
芽鞘、叶片、茎段作为外植体诱导愈伤组织,再在相
同的培养基上诱导与分化,胚芽鞘得到的愈伤再生率
达32%,茎段的为12%,叶片的为2%。试验发现不
同的外植体诱导出的愈伤组织结构不一样,且只有结
构紧密、易碎的愈伤组织能够再生出完整的植株,而
结构疏松、水渍状的愈伤组织只能生根而不能发芽成
苗。在再生植株中白化苗占有一定的比例。
1996年,Ke等人[16]以成熟种子的胚芽鞘为外植
体进行试验,认为结构紧密、松散的愈伤组织能再生
出健壮植株。
2003年,余建明等[17]以草地早熟禾成熟种子为外
植体,进行第一次继代时,选取外表干燥、紧密、颗
粒状愈伤组织,观察到此类愈伤组织在以后的继代培
养过程中形态上不会发生逆转现象,且转移到分化培
养基上后愈伤组织仍表现出较高的植株再生能力。
此外,利用原生质体建立植株再生体系也受到研
究人员的青睐。原生质体是除了细胞壁的具有生命力
的裸露细胞,它具有植物细胞的全能性,在适宜的培
养条件下能诱导出再生植株。原生质体最重要的应用
是体细胞杂交,而原生质体培养是体细胞杂交的关键
技术之一。除此之外,原生质体还可作为遗传转化、
基因瞬时表达、细胞壁再生等方面的起始材料[18]。但
是原生质体培养条件较为特殊:在进行酶解时,选用
的胚性细胞一定是比较均匀的小细胞团,且高质量的
酶有利于原生质体的分离;在悬浮培养中选用生长迅
速、色泽鲜黄、分散性好、有旺盛分裂能力的高度胚
性悬浮培养物进行原生质体的分离等[19]。1993年,
Kisten等[20]对草地早熟禾品种Geronimo进行原生质体
培养,培养 10~16个月后,其再生率由 0.004%提高
到 1.5%,共得到 127株再生植株,初步建立了草地
早熟禾悬浮细胞系培养体系。
诱导愈伤组织是禾谷类原生质体的培养成功的首
要条件。草地早熟禾成熟胚愈伤组织的胚胎能力发生
较差,胚轴也很难诱导出具有高分化能力的愈伤组
织。同时提出从幼穗可以诱导出胚性愈伤组织。建立
草地早熟禾胚性悬浮细胞再生体系,分离的胚比整个
种子更容易获得胚性愈伤组织,也更容易建立胚性悬
浮细胞体系[15]。
总之,在草地早熟禾植株再生过程中,幼穗作为
外植体来获得再生植株是迄今为止效率最高的[8],其
次是茎尖分生组织[14]。但幼穗作外植体受季节性影响
较大,一年只能提供一次植物材料,而且接种的时间
很短,一旦错过就会影响试验的正常进行[11];茎尖分
生组织在操作时需要大量的人力,其选择部位也不易
准确把握;幼穗和茎尖分生组织均不能提供大量外植
体遗传转化使用。原生质体培养经过许多复杂的生长
发育过程,遗传稳定性较差,加上其培养周期长、难
度大、再生率低,因此具有一定的局限性[21]。因此,
目前草地早熟禾再生过程多采用成熟种子作为外植体
进行遗传转化。马忠华、张云芳等人以草地早熟禾成
熟种子为外植体,通过基因枪介导法初步建立了草地
早熟禾的基因转化体系[22]。
2 外植体的处理
BaiandQu[23]在以成熟种子作为外植体时,认为对
种子进行切割可以提高高羊茅愈伤组织的诱导率和再
生率。Altpeter[24,25]等人通过试验也认为对成熟种子进
行切割可以抑制种子的萌发而促进愈伤组织的诱导。
但是,H.Salehi和M.Khosh-khui[26]通过试验发现用手
术刀对草地早熟禾种子 Merion进行切割处理对诱导
愈伤组织没有显著的作用,这可能是基因型差异所造
成。
3 培养条件
许多学者为了建立草地早熟禾的高效植株再生体
系,在诱导愈伤组织时,他们对培养基成分(2,4-D、
6-BA、CuSO4、水解酪蛋白和固化剂等)、培养温度
等不同的诱导因子进行了大量的探索性研究。
细胞分裂素和生长素对于离体培养的组织和细胞
的增殖、分裂,芽和根的诱导以及胚状体形成起着关
键的作用。大量的试验证明,较高浓度的生长素单独
使用或与细胞分裂素配合使用可以有效地刺激培养细
胞的增殖和连续生长,形成愈伤组织[18]。
在VanderValk等人[8]采用成熟种子作为外植体建
立再生体系之后,同时表明在培养基中添加6-BA可
以提高草地早熟禾的愈伤组织诱导率,这可能是草地
早熟禾中含有内原细胞分裂素的原因[27]。在相关的草
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坪草的报道中,对愈伤组织的诱导多数选用2,4-D,
质量浓度为 1~5mg/l[28]。Chi等比较了 D′,D′BC2
培养基和DBC3(MS+4.5mg/l2,4-D+2.2mg/l6-BA+
5.0mg/lCuSO4) 培养基诱导成熟种子愈伤组织后,发
现 D′培养基诱导率较高,但再生率低,DBC3培养
基的再生率较高,而诱导率又较低,但比较适合于转
化[29]。此外,研究者对培养基中6-BA[30]、ABA[31]等植
物激素浓度也进行了研究。段碧华等人[32]认为对新歌
来德愈伤组织和继代的最佳培养基配方为MN5+3mg/l
2,4-D+0.2mg/l6-BA。
朱根发等人[9]以草地早熟禾胚轴为外植体诱导愈
伤组织时发现,当2,4-D的浓度低于1mg/l最佳。
马忠华[22]等人的试验中发现随2,4-D浓度的增
加,早熟禾的愈伤组织诱导率不断升高,当2,4-D
的浓度达到7mg/l时,愈伤组织诱导率达到91.1%。
VanderValk[30]等人认为当 2,4-D和 6-BA配合
使用的情况下,愈伤组织诱导率要高于单独使用
2,4-D。
1984年,MrDonnel和 Conger以成熟种子为外
植体,研究了温度对草地早熟禾再生体系的影响,他
们分别比较了在25℃与 15℃黑暗培养条件下,附加
4℃冷处理7d对愈伤组织诱导和对植株再生的影响,
发现15℃黑暗诱导能够提高草地早熟禾的品种RamⅠ
的再生频率[2]。
MrDonnel[2]还发现,较其他植物激素,麦草畏
(dicamba) 和毒莠定 (picloram) 对草地早熟禾的愈
伤组织诱导及再生效果好,并发现降温至 15℃,并
对愈伤组织进行 4℃的冷处理可以提高芽的出生率,
平时常用的25℃并不是最适温度。Grifin[11]提出,在
愈伤组织诱导培养基中麦草畏和6-BA配合使用比单
独使用2,4-D、麦草畏、毒莠定的效果明显,在12
个草地早熟禾北美栽培品种成熟种子诱导产生的愈伤
组织中均获得再生植株,再生率在4%~40%之间。
支月娥等[33]通过试验发现脯氨酸可作为细胞渗透
调节物质缓解渗透胁迫,保护蛋白质和膜结构。通过
添加外源脯氨酸,可促进愈伤组织的诱导、延缓褐
化、提高分化率和生根率 [34]。
固化剂对诱导草地早熟禾愈伤组织的影响也有报
道[31]。王贺飞等[35]通过试验发现固化剂phytage可增强
草地早熟禾佛特纳的愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织
发生率。在草地早熟禾上,相同的愈伤组织在固化培
养基上的再生率比琼脂要高2~2.5倍[31]。
Chi等[29]认为在草坪草的愈伤组织诱导中,通过
添加ABA可使松软无定型、呈果冻状或棉絮状的愈
伤组织转变为结构较为致密的胚性愈伤组织。同时他
们还证明在草地早熟禾品种Kenblue的诱导培养基中
添加0.1umol/l的 CuSO4能显著提高诱导率、生长速
率和胚性愈伤率;而 5umol/l的 CuSO4提高再生率;
AgNO3可明显抑制乙烯产生,促使器官发生及体细胞
胚胎发生,还可防止愈伤组织的褐化。
水解酪蛋白也是组织培养中常用的,它是一种具
有多种氨基酸的混合物,它可促进胚生长,特别是在
分化培养基中,加一定量的水解酪蛋白,可促进胚胎
发生和多胚性出现[36]。在培养基中添加水解酪蛋白有
利于促进胚性愈伤组织的诱导[37]。
刘君等人[38]通过多因子的正交试验,指出诱导
Baron愈伤组织最佳的培养基为 MS+1mg/l2,4-D+
0.1mg/l6-BA+3mg/lCuSO4+1g/l酸水解酪蛋白 (CH)
(影响程度 2,4-D>CuSO4>CH>6-BA);而 Midnight
的最佳的培养基为MS+2mg/l2,4-D+0mg/l6-BA+
3mg/lCuSO4+1g/lCH(影响程度 2,4-D>CH
>CuSO4>6-BA)。
4 不同基因型对再生率的影响
许多学者认为,愈伤组织的诱导率与品种的基因
型密切相关。有些品种有很高的诱导率,有些却很难
诱导出愈伤组织[39]。
基因型的差异导致了草地早熟禾再生体系建立
过程中众多不同的表现形式,如形成胚性愈伤的状
态不同[8],对于基因型产生的差异已有不同程度的报
道[8,10,11],因此,选择适宜的基因型是建立高效、稳定
遗传转化体系的必要条件。
同种草坪草、不同品种间诱导愈伤组织和再生植
株的培养基成分可能差异很大,而且有些品种似乎很
难获得再生植株。即使在相同的培养条件下,也常表
现出很大的差异。VanderValk等[8]在对 15个品种进
行试验时,发现只有Geronimo、Baron、Barblue等能
产生白色、有结构、易于再生的愈伤组织,而
Monopoly、Entopper、Fylking等品种则产生没有极性
的、淡黄绿色的愈伤组织,不易再生。
Boud和Dale[10]对50个供试品种使用相同的诱导
培养基进行诱导愈伤组织,发现有15个品种诱导出
了表现相似的愈伤组织;3个品种愈伤组织形成了叶
的结构,但没能形成再生植株;而其他的一些品种愈
伤组织诱导极少甚至没有。
1995年,Jeferey等[11]对12个品种进行试验,发
现只有Baron的种子植株再生率达到了46%,其他品
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种再生率只有4%～40%。
对于禾本科植物来说,建立高频再生体系是一个
难题,其原因是很难获得胚性愈伤组织。虽然幼胚或
幼穗能够获得胚性愈伤组织,但因为幼胚或幼穗较
小,操作难度大,且取材受季节限制。而利用成熟胚
获得愈伤组织比较简单且污染几率较小,因此建立成
熟胚诱导胚性愈伤组织显得尤为必要。成熟胚是自养
的,所以它的发育在很大程度上受细胞固有因素的控
制[40]。而愈伤组织是植物受伤后在本身内源激素及培
养基中外源激素的共同作用下,细胞反复分裂产生
的[41]。不同的基因型其内源激素是不同的,故基因型
对愈伤诱导有一定的影响。虽然利用成熟胚诱导愈伤
组织比较困难,但对其所用培养基中大量元素、微量
元素的量及激素的配比,应进行大量的摸索,寻找最
佳组合,使其诱导胚性愈伤组织的潜力得到很好的表
达。
以草地早熟禾种子为外植体获得再生植株的技术
体系虽建立,但草地早熟禾成熟胚的愈伤组织绿苗化
频率偏低,且使愈伤组织长期保存后获得植株再生能
力的技术还未得到解决。因此要通过试验不断地完善
此项技术,建立良好的早熟禾再生体系,为下一步的
品种改良和基因转化奠定基础。
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Abstract:Kentuckybluegrassregenerationsystemresearchprogressintheworldweresummarizedinthispaperon
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(上接第22页)
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草地生态
责
任
编
辑
向
锦
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