全 文 ：２０１３年４月 甘　肃　农　业　大　学　学　报 第４　８卷
第２期７４～７９ ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＧＡＮＳＵ　ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ 双 月 刊
草地早熟禾愈伤组织诱导和分化中内源
激素水平分析
张媛媛，马晖玲，俞玲，赵媛
（甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，中－美草地畜牧业可持续
研究中心，甘肃 兰州　７３００７０）
摘要：以草地早熟禾‘午夜２号’、‘新格莱德’、‘橄榄球２号’成熟种子为材料，进行愈伤组织的诱导和分化培
养，利用高效液相色谱法对愈伤组织在不同培养期中的内源激素生长素（ＩＡＡ）、脱落酸（ＡＢＡ）、玉米素（ＺＴ）进行测
定和分析．结果表明：愈伤组织诱导率与成熟种子中ＩＡＡ和ＡＢＡ水平呈正相关．３个品种种子中的ＩＡＡ水平相对
较高，分别为０．５７４、０．３９３和０．４１５μｇ／ｇ，内源激素ＡＢＡ的含量微小，分别为０．１５７、０．０８８和０．１２３μｇ／ｇ，ＺＴ含
量在３个品种间差异不大；在供试材料愈伤组织的继代培养和分化阶段，ＩＡＡ含量在‘午夜２号’中始终处于较高
的水平，分别为０．４２５μｇ／ｇ和０．５５４μｇ／ｇ，变化幅度不大，在愈伤组织生长旺盛和分化成芽期最高，分别为
０．４９５μｇ／ｇ和０．６２９μｇ／ｇ，ＡＢＡ 和ＺＴ含量在愈伤组织培养和分化过程中一直处于较低水平，ＡＢＡ 分别为
０．１２０μｇ／ｇ和０．１４１μｇ／ｇ，ＺＴ分别为０．１１１μｇ／ｇ和０．２０２μｇ／ｇ，二者在胚性愈伤组织形成期含量逐渐升高，在愈
伤组织分化能力强的时期也有升高趋势，对胚性愈伤组织的形成和分化出芽有促进作用；高ＺＴ∶ＩＡＡ 和高
ＡＢＡ∶ＩＡＡ有利于愈伤组织的生长发育，并促进胚性愈伤组织的形成，高ＡＢＡ∶ＩＡＡ有利于愈伤组织分化形成芽．
关键词：草地早熟禾；愈伤组织；生长素；脱落酸；细胞分裂素
中图分类号：Ｓ　５４３　　　　文献标志码：Ａ　　　　　文章编号：１００３－４３１５（２０１２）０６－００７４－０６
第一作者：张媛媛 （１９８８－），女，硕士研究生，研究方向为牧草种质资源及育种．Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｙｙｓ．ｓ＠１６３．ｃｏｍ
通信作者：马晖玲，女，博士，教授，博士生导师，研究方向为牧草种质资源及育种．Ｅ－ｍａｉｌ：ｍａｈｌ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
基金项目：国家自然科学基金：草地早熟禾种间体细胞杂交的研究（３１１６０４８２）．
收稿日期：２０１２－０４－１６；修回日期：２０１２－０４－２６
Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ｃｈａｎｇｅ
ｏｆ　Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ
ＺＨＡＮＧ　Ｙｕａｎ－ｙｕａｎ，ＭＡ　Ｈｕｉ－ｌｉｎｇ，ＹＵ　Ｌｉｎｇ，ＺＨＡＯ　Ｙｕａｎ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇａｎｓｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ　Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｉｎｏ－Ｕ．Ｓ．Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ
Ｇｒａｚｉｎｇｌａｎｄ　Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ　Ｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ　ａｐｏｍｉｃｔｉｃ　ｓｐｅｃｉｅｓ　Ｐｏａ　ｐｒｅｔｅｎｓｉｓ　Ｌ．，ｃｖ．
‘Ｍｉｄｎｉｇｈｔ　ＩＩ’，ｃｖ．‘Ｎｕｇｌａｄｅ’ａｎｄ　ｃｖ．‘Ｒｕｇｂｙ　ＩＩ’，ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅｉｒ　ｍａｔｕｒｅ　ｓｅｅｄｓ　ａｓ　ｔｈｅ　ｅｘｐｌａｎｔ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｗｅｒｅ
ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅｓ（ＩＡＡ，ＡＢＡ，ＺＴ）ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ
ｃａｌｕｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔａｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｂｙ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｌｕｓｔｒａｔｅｄ
ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃａｌｕｓ　ｈａｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＩＡＡ　ａｎｄ　ＡＢＡ　ｉｎ　ｍａ－
ｔｕｒｅ　ｓｅｅｄｓ．Ｔｈｅ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＩＡＡ（０．５７４μｇ／ｇ，０．３９３μｇ／ｇ，０．４１５μｇ／ｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）ａｍｏｎｇ　ａｌ　ｓｅｅｄｓ
ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ａｎｄ　ｆｅｗｅｒ　ａｍｏｕｎｔｓ　ｏｆ　ＡＢＡ （０．１５７μｇ／ｇ，０．０８８μｇ／ｇ，
第２期 张媛媛等：草地早熟禾愈伤组织诱导和分化中内源激素水平分析
０．１２３μｇ／ｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ，ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ＺＴ　ａｍｏｎｇ　ａｌ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ａｎｄ
ｔｈｅ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｌｅｖｅｌ　ｓｈｏｗｅｄ　ｒａｎｄｏｍ　ｐａｔｔｅｒｎｓ．Ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｕｓ　ｏｆ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｔｈｅ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ＩＡＡ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｖ．‘Ｍｉｄｎｉｇｈｔ　ＩＩ’ｗａｓ　ｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ
ｈｉｇｈｅｒ　ｌｅｖｅｌ（０．４２５μｇ／ｇ，０．５５４μｇ／ｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ），ａｌｓｏ　ｉｔ　ｆｌｕｃｔｕａｔｅｄ　ｗｉｔｈｉｎ　ａ　ｓｍａｌ　ｒａｎｇｅ　ａｎｄ　ｒｅａｃｈｅｄ　ｔｈｅ
ｃｌｉｍａｘ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｅｒｉｏｄ　ｏｆ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｂｕｄ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｕｓ．Ｔｈｅ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｂｏｔｈ　ＡＢＡ（０．１２０
μｇ／ｇ，０．１４１μｇ／ｇ）ａｎｄ　ＺＴ（０．１１１μｇ／ｇ，０．２０２μｇ／ｇ）ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｌｏｗ　ｌｅｖｅｌ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｔａｇｅ
ｏｆ　ｃａｌｕｓ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｒｍ　ｃａｌｕｓ，ｔｈｅｓｅ　ｈｏｒｍｏｎｅ
ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｒａｉｓｅｄ　ｇｒａｄｕａｌｙ　ａｓ　ｗｅｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｕｓ，ｔｈｉｓ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｔｈｏｕｇｈｔ
ｔｏ　ｃｏｎｆｅｒ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｇｅｒｍ　ｃａｌｕｓ．Ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｒａｔｉｏ　ｖａｌｕｅｓ　ｏｆ　ＺＴ／ＩＡＡ　ａｓ　ｗｅｌ　ａｓ　ＡＢＡ／ＩＡＡ　ｗｅｒｅ　ｂｅｎｅｆｉ－
ｃｉａｌ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｃａｌｕｓ　ａｎｄ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｒｍ　ｃａｌｕｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ＡＢＡ　ｅｖｅｎ　ｈａｖｅ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｒｒｅｃ－
ｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｕｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｏａ　ｐｒｅｔｅｎｓｉｓ；ｃａｌｕｓ；ＩＡＡ；ＡＢＡ；ＺＴ
　　植物体的生长和发育受许多因素的影响，是植
物体内外各种因素综合作用的结果．在植物愈伤组
织的培养中，外植体的选择、培养基ｐＨ 值、不同外
源激素配比、光照、培养温度等均对愈伤组织的形成
和分化有着一定的影响［１－６］．其中，外源激素起着传
递遗传物质的脱分化、再分化等发育信号的作用，而
外源激素的作用效果与外植体以及愈伤组织本身内
源激素的种类和水平有密切关系，外源激素必须通
过内源激素才能发挥作用［７］．很多研究表明，内源激
素对植物愈伤组织生长和分化有调控作用．植物内
源激素水平在植物的整个生长发育阶段处于一种动
态的变化状态，从而对植物不同生理阶段产生不同
的影响［８－１０］．目前，有关草地早熟禾组织培养过程中
内源激素含量及其对植株再生调控的研究报道还很
少．本研究在以往工作的基础上，利用高效液相色谱
法测定并分析草地早熟禾愈伤组织在诱导、分化和
再生苗的过程中生长素（ＩＡＡ）、脱落酸（ＡＢＡ）、玉
米素（ＺＴ）含量的动态变化，旨在探索和了解内源激
素在草地早熟禾愈伤组织诱导和分化过程中的调控
作用和最佳效应值．
１　材料与方法
１．１　试验材料
以草地早熟禾‘午夜２号’、‘新格莱德’、‘橄榄
球２号’成熟种子为材料．
１．２　主要仪器和试剂
Ａｇｉｌｅｎｔ　１１００Ｓｅｒｉｅｓ液相色谱仪、ＶＷＤ 检测
器、旋转蒸发仪、紫外分光光度计、０．４５μｍ有机系
针头式过滤器．
ＩＡＡ、ＡＢＡ、ＺＴ标准品均购于兰州科迈实验耗
材经营部国产分装产品；甲醇、乙腈为色谱纯产品；
其他试剂均为分析纯产品；实验用水均为超纯水．
１．３　试验方法
１．３．１　愈伤组织的诱导及植株再生　从草地早熟
禾‘午夜２号’、‘新格莱德’、‘橄榄球２号’诱导产生
愈伤组织并进行植株再生试验［１１］．挑选不同培养时
期的愈伤组织，经液氮速冻后放入－８０℃超低温冰
箱，保存待用．
１．３．２　样品处理及其 ＨＰＬＣ分析　参照郭敏敏
等［１２］的方法，稍作修改．准确称取预先冻存的愈伤
组织各１．０ｇ，加入１０ｍＬ预冷的８０％甲醇溶液冰
浴研磨成匀浆，４℃冰箱中避光浸提２４ｈ，４℃、
５　０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液，残渣再加入
４ｍＬ　８０％的冷甲醇溶液避光振荡摇匀数小时，相
同条件离心１０ｍｉｎ，合并上清液用旋转蒸发仪蒸
至原体积的一半，经 Ｃ１８胶柱分离纯化后用氮气
将其吹干，用流动相定容至１ｍＬ，分别经０．４５μｍ
有机系针头式过滤器过滤，并取２０μＬ进行 ＨＰＬＣ
分析．
１．３．３　 色谱条件 　 色谱柱：ＺＯＲＢＡＸ　Ｅｃｌｉｐｓｅ
ＸＤＢ－Ｃ８（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，５μｍ）；流动相：乙腈∶
甲醇∶０．６％的乙酸（５∶５０∶４５）；柱温：２５℃；流速：
１ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长：２５４ｎｍ；进样量：２０μＬ；定量
方法：外标峰面积法．
５７
甘 肃 农 业 大 学 学 报 ２０１３年
２　结果与分析
２．１　色谱条件的选择
２．１．１　检测波长的确定　将配制好的３种激素标
准溶液在紫外分光光度计上进行光谱扫描，结果表
明，２２１、２１９、２１８ｎｍ处出现ＩＡＡ、ＡＢＡ、ＺＴ的第
一吸收峰，２５０～２６０ｎｍ附近为第二吸收峰区域．
在２１８ｎｍ附近三者吸光度均较大，但在此波长下
检测时，受溶剂甲醇的影响较大（甲醇的紫外截止波
长为２１０ｎｍ，样品检测波长应至少大于所用溶剂截
止波长２０ｎｍ以上），不宜选择；选择第二吸收峰区
域的波长进行检测，结果发现２５０～２６０ｎｍ范围内
检测效果差异不大，均衡３种激素的检测效果，最终
选择２５４ｎｍ作为检测波长．
２．１．２　流动相的选择　采用上述色谱条件，发现用
甲醇∶水（５５∶４５）［１３］做流动相时，色谱图拖尾严重且
峰形不好，加入少量０．６％的乙酸，峰形有所改善，
再加入少量乙腈，峰形得到进一步改善，灵敏度也有
所提高．综合考虑，最终确定流动相为乙腈∶甲醇∶
０．６％的乙酸为５∶５０∶４５［１４］．５ｍｉｎ内完全分离３个
组分，标准品的色谱图如图１．将分离出的样品进行
ＨＰＬＣ分析，得到的色谱图如图２．
图１　标准样品色谱图
Ｆｉｇ．１　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ
２．１．３　线性关系的测定　将配制好的３种激素标
准品系列浓度梯度溶液，按所选择的色谱条件进样
２０μＬ，获得不同浓度时ＩＡＡ、ＡＢＡ、ＺＴ的峰面积．
用峰面积（ｙ）对标准品浓度（ｘ）绘制线性回归曲线．
得到的线性方程和相关系数见表１．各激素的线性
相关性均较好．
２．２　草地早熟禾不同品种愈伤组织内源激素水平
及其对愈伤组织诱导率的影响
以３个品种成熟种子为外植体，进行愈伤组织
图２　样品色谱图
Ｆｉｇ．２　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｓａｍｐｌ
表１　回归方程和相关系数
Ｔａｂ．１　Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
内源激素 回归方程 相关系数
ＩＡＡ　 ｙ＝７０．４４５ｘ＋２５．８０６　 ０．９８３　１
ＡＢＡ　 ｙ＝１９５．５１ｘ－７．８７４　３　 ０．９９９　９
ＺＴ　 ｙ＝８３．４０３ｘ－７．９７１　４　 ０．９９８　６
诱导试验，取外植体分离提纯内源激素并测得不同
品种内源激素含量，诱导率以及内源激素含量如图
３．在愈伤组织诱导试验中发现，３个品种成熟种子
愈伤组织诱导率从高到低依次是‘午夜 ２ 号’
（３９．８％）、‘橄榄球２号’（３０．５％）、‘新格莱德’
（２５．４％）．结果显示，愈伤组织诱导率较高的‘午夜
２号’的成熟种子中，内源激素ＩＡＡ和ＡＢＡ的含量
均高于‘橄榄球２号’和‘新格莱德’，说明愈伤组织
的诱导率与ＩＡＡ和ＡＢＡ水平呈正相关（相关系数
分别为０．９４０　２和０．９１１　９）；并且３个品种外植体
中的ＩＡＡ水平相对较高，说明高水平的ＩＡＡ有利
于愈伤组织的形成，在愈伤组织形成过程中起主导
作用；内源激素ＡＢＡ和ＺＴ在成熟种子中的含量微
图３　内源激素与草地早熟禾愈伤组织
诱导率的关系
Ｆｉｇ．３　Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ
ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏａ　ｐｒｅｔｅｎｓｉｓ
６７
第２期 张媛媛等：草地早熟禾愈伤组织诱导和分化中内源激素水平分析
小，ＺＴ含量在３个品种间差异不大，分别为０．０３９、
０．０４４和０．０２９μｇ／ｇ，含量水平无一定规律，说明
ＺＴ在愈伤组织诱导中起着非关键作用，与诱导率
并无相关性．
２．３　不同培养时期草地早熟禾愈伤组织中内源激
素含量的动态变化
为了研究草地早熟禾愈伤组织在培养过程中内
源激素的变化特点，接种约６周，当‘午夜２号’成熟
种子上形成愈伤组织后，将愈伤组织转移至继代培
养基上继续培养，每隔１５ｄ采样，进行色谱测定，将
测定结果换算成原样中各内源激素的含量．结果表
明，随着愈伤组织培养时间的不同，３种内源激素的
含量及其比值都发生明显的变化．如图４－Ａ所示，
在‘午夜２号’愈伤组织继代培养中，０～３０ｄ为快速
生长期，３１～６０ｄ生长速度变缓，６０ｄ以后愈伤组
织出现了老化并伴有褐化现象．在整个继代培养过
程中，ＩＡＡ与其他激素相比含量最高，在０．３７３～
０．４９５μｇ／ｇ之间，始终处于较高的水平，变化范围不
大；内源激素ＺＴ在整个愈伤组织培养过程中的含
量较低，在０．０４７～０．１９９μｇ／ｇ变化范围内呈现先
升高后降低的趋势，继代培养０～３０ｄ是愈伤组织
生长快速期，并且是胚性愈伤组织形成时期，在这一
阶段ＺＴ含量呈上升趋势，在３０ｄ时达到最大值，为
０．１９９μｇ／ｇ，３０ｄ后愈伤组织生长缓慢，ＺＴ含量显
著下降；内源激素 ＡＢＡ含量在愈伤组织培养过程
中一直处于较低水平，为０．０６７～０．１９７μｇ／ｇ，在胚
性愈伤组织形成期含量逐渐升高，为０．１９７μｇ／ｇ，
之后显著下降，说明 ＡＢＡ含量对胚性愈伤组织有
促进作用．培养６０ｄ后，愈伤组织开始老化，伴随不
良的生长状态出现，如水渍化以及褐化现象，此时３
种内源激素都呈下降趋势．
由图４－Ｂ可知，高ＺＴ∶ＩＡＡ及ＡＢＡ∶ＩＡＡ有利
于草地早熟禾愈伤组织的生长发育，并能促进胚性
愈伤组织的形成．
图４　草地早熟禾愈伤组织培养过程中内源激素含量变化
Ｆｉｇ．４　Ｃｏｎｔｅｎｔ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｃａｌｕｓ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　Ｐｏａ　ｐｒｅｔｅｎｓｉｓ
２．４　草地早熟禾愈伤组织分化过程中内源激素含
量的动态变化
从‘午夜２号’成熟种子诱导出的胚性愈伤组织
转移到分化培养基上进行分化培养，每隔５ｄ采样，
测得内源激素含量如图５所示．
分化培养约２０ｄ时，愈伤组织开始形成绿色芽
点（体细胞胚），２０～３０ｄ为分化最强的时期，持续
５０ｄ左右，便可长出完整的植株．内源激素ＩＡＡ在
整个分化过程中依然保持较高的水平，在０．５０９～
０．６２９μｇ／ｇ之间变化，０～２５ｄＩＡＡ含量逐渐增高，
第２５ｄ含量达到最高值，为０．６２９μｇ／ｇ．这与已报
道的水稻愈伤组织分化时所测到的结果一致［９］，说
明内源激素ＩＡＡ在愈伤组织的分化时期可能也起
着主导作用；ＺＴ含量呈先上升后下降的趋势，在愈
伤组织分化最强的第 ２０ｄ 时达到最大值，为
０．２７７μｇ／ｇ．此时体细胞胚开始产生，表明内源激素
ＺＴ的水平是影响愈伤组织分化产生体细胞胚的关
键因子；在愈伤组织分化的５～１５ｄ内，内源激素
ＡＢＡ水平较低，呈下降趋势，而在愈伤组织分化能
力较强的第１５～２５ｄ期间急剧上升，并保持较高水
平，随后又下降，说明高含量的内源激素ＡＢＡ在愈
伤组织分化时期有一定的促进作用．
在草地早熟禾愈伤组织分化前期，ＺＴ∶ＩＡＡ比
值逐渐升高，２０ｄ时达到最大，之后急剧下降；ＡＢＡ
∶ＩＡＡ相对比值在１～１５ｄ内比较低，而且呈下降趋
势，在出芽时期明显上升并处于较高水平，较高的
ＺＴ∶ＩＡＡ和ＡＢＡ∶ＩＡＡ比值有利于愈伤组织分化形
成芽．
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甘 肃 农 业 大 学 学 报 ２０１３年
图５　草地早熟禾分化培养过程中内源激素含量的变化
Ｆｉｇ．５　Ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　Ｐｏａ　ｐｒｅｔｅｎｓｉｓ
３　讨论与结论
３．１　利用高效液相色谱法测定内源激素ＩＡＡ、
ＡＢＡ、ＺＴ
利用高效液相色谱法测定草地早熟禾愈伤组织
培养及分化过程中内源激素变化的研究还十分少
见．利用高效液相色谱法进行测定时色谱条件的确
定至关重要，色谱条件涉及流动相、检测波长、流速
以及柱温等关键因素．以不同体积分数甲醇水溶液
为流动相，其色谱图峰形不好且拖尾严重［１５］．ｐＨ值
会影响植物激素的离解，从而对色谱分离度有一定
影响［１６］，史作安［１７］和陈建华等［１８］研究发现，甲醇水
溶液中加入一定量的冰乙酸，使色谱分离得到改善，
并减少拖尾，并且峰形与酸含量比例有关．在此基础
之上，加入一定量的乙腈，发现色谱分离效果有所改
观［１９］．本研究利用乙腈∶甲醇∶０．６％乙酸（５∶５０∶４５）
作为流动相（ｐＨ约为３．５）进行标准品的色谱测定，
发现色谱分离效果良好．对标准品溶液进行了光谱
扫描，发现２１０～２２０ｎｍ附近为ＩＡＡ、ＡＢＡ、ＺＴ的
第一吸收峰区域，２５０～２６０ｎｍ附近为第二吸收峰
区域，基于样品检测波长应大于所用溶剂的截止波
长２０ｎｍ以上，因此将检测波长确定在第二吸收峰
范围内，兼顾色谱效果和灵敏度最终确定检测波长
为２５４ｎｍ，灵敏度由高到低分别为ＡＢＡ、ＺＴ、ＩＡＡ．
３．２　愈伤组织诱导培养中内源激素水平与诱导率
的相关性
付凤玲等［２０］，Ｃｅｎｔｅｎｏ等［２１］分别以玉米、猕猴
桃为研究对象，结果表明愈伤组织诱导能力强的幼
胚ＩＡＡ和ＡＢＡ含量比较高．王秀红等［２２］在其研究
中也指出外植体生长素含量较高而细胞分裂素含量
较低时，有利于愈伤组织诱导．本研究发现诱导率较
高的草地早熟禾品种成熟种子中ＩＡＡ和ＡＢＡ含量
高于其他品种，其愈伤组织诱导率与内源激素ＩＡＡ
和ＡＢＡ水平呈正相关．有研究表明，利用幼胚做外
植体，其愈伤组织诱导率明显高于成熟胚［２３－２４］，而且
已有学者发现这其中最明显的特征就是幼胚中内源
激素ＡＢＡ 水平高于成熟胚［２５］，这说明内源激素
ＡＢＡ是启动愈伤形成的关键，本研究也证实内源激
素ＡＢＡ对胚性愈伤组织的形成有促进作用；细胞
分裂素类ＺＴ的水平很低，与愈伤组织的诱导率无
一定的相关性．
３．３　内源激素水平对愈伤组织生长和分化的影响
ＩＡＡ的主要作用是促进细胞的有丝分裂，促进
细胞和器官的生长［２６］，愈伤组织的诱导过程是生长
素不断升高的过程，并且这个过程需要高水平的生
长素进行维持［９－１２］；ＺＴ对细胞分裂、愈伤组织的增
值有促进作用，主要是使细胞扩大，而不是伸长［２７］，
ＺＴ含量的变化趋势和此时愈伤组织生长发育状态
密切相关．本研究结果显示，在草地早熟禾愈伤组织
前期生长旺盛期，ＩＡＡ、ＺＴ水平较高，以维持细胞的
快速生长和分裂．ＩＡＡ在愈伤组织培养的整个过程
中保持很高水平，当愈伤组织进入缓慢生长期时，
ＩＡＡ含量有所下降并趋于平缓．同样，ＺＴ水平在愈
伤组织缓慢生长期时也相应地降低．ＡＢＡ有利于胚
性愈伤组织的形成［２２］，本试验结果也印证了这点，
在愈伤组织培养前期，ＡＢＡ以及ＡＢＡ∶ＩＡＡ相对比
值均呈上升趋势，此时也是胚性愈伤组织形成时期，
愈伤组织胚性较好，当培养进入后期，愈伤组织水渍
化现象发生，丧失胚性，此时的ＡＢＡ含量呈显著下
８７
第２期 张媛媛等：草地早熟禾愈伤组织诱导和分化中内源激素水平分析
降趋势，说明 ＡＢＡ可能是保持愈伤组织胚性的关
键因子．
草地早熟禾愈伤组织进入分化阶段，ＩＡＡ水平
依然保持较高水平，表明愈伤组织分化也需要高水
平ＩＡＡ维持．ＺＴ含量较愈伤组织培养阶段大幅增
加，并且在体细胞胚形成期呈上升趋势，这与刘清
等［９］的研究结果相类似，说明ＺＴ水平可能在整个
分化阶段起主导作用，并且是促进体细胞胚发生的
关键因子．进入愈伤组织分化阶段后，内源激素
ＡＢＡ含量有所下降，但在体细胞胚形成期又逐渐上
升，并且ＡＢＡ∶ＩＡＡ相对比值在此阶段仍然处于较
高水平，说明高ＡＢＡ∶ＩＡＡ比值有利于体细胞胚的
形成．
３．４　外源生长调节剂与内源激素的协同效应分析
关于外源生长调节剂对内源激素水平的影响以
及外源激素是否必须依赖内源激素发生作用的相关
报道还不多，二者相互作用机制尚不明确．胡国强
等［２８－３０］的研究表明，外源生长素对黄芩内源激素含
量有一定的影响．俞良亮等［２９］研究结果证实，在杂
交鹅掌揪生根过程中设置不同组合的外源激素处
理，发现所有外源激素组合对内源激素 ＡＢＡ含量
无影响，ＮＡＡ＋ＢＡ的组合降低了ＩＡＡ质量分数并
显著增加了ＺＲｓ质量分数．郭敏敏等［１２］在对棉花的
研究中指出，不同的外源激素组合对内源激素的影
响各不相同，对ＩＡＡ、ＺＴ的影响都较大．本研究在
进行草地早熟禾愈伤组织诱导试验中，并未在培养
基中添加外源激素，以排除外源激素对内源激素可
能存在的影响，从单一的方面摸清内源激素对草地
早熟禾愈伤组织诱导和分化的影响及其适宜的效应
值．有关外源激素与内源激素的协同效应需进一步
探索．
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（责任编辑　赵晓倩）
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