全 文 ：·生物技术· 北方园艺 2008(7):198～ 200
第一作者简介:麻冬梅(1978-),女 ,宁夏贺兰人, 硕士 ,助教 ,现从
事植物抗逆分子生物学研究。 E-mail:yyy y2006@nxu.edu.cn。
通讯作者:许兴。
基金项目:国家“973”资助项目(2006CB100106)。
收稿日期:2008-03-02
草 地 早 熟 禾 高 频 再 生 体 系 建 立
麻冬 梅1 , 杨 亚亚2 , 杨赛飞1 , 许 兴1
(1.宁夏大学农学院 ,宁夏银川 750021;2.宁夏大学生命科学学院 ,宁夏银川 750021)
摘 要:研究了草地早熟禾愈伤组织的诱导和分化的最适培养基 ,建立了早熟禾高频率的再
生体系。结果表明:品种优异的胚性愈伤诱导率最高 ,其中含 2.0 mg/L 2 ,4-D和 0.2 mg/L6-BA
的培养基处理胚性愈伤组织的诱导频率最大 ,可以达到 65.26%。早熟禾品种肯塔基 、午夜 、优异
与新哥莱德最适分化激素浓度与配比分别为 6-BA 1.0+KT 0.2 、6-BA 2.0+2 ,4-D 0.1 、6-BA
1.0+2 ,4-D 0.2 、KT 2.0 ,愈伤组织分化率分别达到27.93%、52.38%、66.67%和 60%。早熟禾再
生芽在 1/2 MS+0.2 NAA培养基上生根率可达到100%。
关键词:早熟禾;愈伤组织;高频再生体系
中图分类号:S 688.403.6 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2008)07-0198-03
草地早熟禾(Poa pratensis L.)为禾本科早熟禾属
多年生草本植物 ,是世界广泛种植的重要草坪草种[ 1] 。
草地早熟禾许多品种是优良的草坪用草 ,既喜光也耐
荫 ,耐寒能力强 ,具有生长速度慢 ,不需经常修剪 、耐践
踏、绿色期长 、秋季保绿性和春季返青性能好 、抗寒能力
强、用途广等优点 ,已是混播草坪的主栽品种 ,但抗旱
性、耐热性 、耐盐能力差 ,易受病 、虫危害[ 2-3] ,这些性状可
通过基因工程手段进行品种改良。植物再生体系建立
是遗传转化的前提工作 ,在草地早熟禾再生体系中 ,存
在着出愈时间长 、愈伤组织诱导率低、基因型限制 、基因
型的再生能力差[ 4-5] 、分化率低[ 6-7]等问题 ,从而延长了遗
传转化的时间 ,降低了遗传转化效率 ,影响了草坪草品
种改良的基因工程研究。因此 ,研究一个草地早熟禾良
好的组织培养条件和高效的植株再生体系仍具有重要
的意义 ,研究旨在建立早熟禾高频率的再生体系 ,为下
一步早熟禾遗传转化和分子育种的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
选用早熟禾主栽品种肯塔基 、新哥莱德 、优异和午
夜的成熟种子为外植体。
1.2 方法
1.2.1 种子发芽试验 选取肯塔基 、新哥莱德 、优异和
午夜各 500粒饱满的成熟种子置于放有湿润滤纸的培
养皿中 ,每皿100粒种子 ,培养温度(25±1)℃,2周后统
计发芽率。
1.2.2 愈伤组织诱导与继代培养 选取饱满成熟的种
子放入三角瓶中 ,加入 50%的浓硫酸 ,在 200 r/min摇床
震荡 2 ～ 3 min 后 ,在 75%酒精中浸泡 1 min ,然后用
0.1%氯化汞消毒 8 ～ 10 min ,最后用无菌水冲洗 5 ～ 7
次。消毒好的种子置于不同激素配比的诱导愈伤组织
培养基中 ,温度(25±2)℃,暗培养1周后去芽 ,以诱导形
成愈伤组织 ,4周后挑取愈伤组织于继代培养基中 ,每2
周继代培养1次。
1.2.3 愈伤组织分化 愈伤组织继代培养 6周后 ,挑取
浅黄色 、紧密、颗粒状胚性愈伤组织于分化培养基中。
1.2.4 再生植株的生根和移栽 分化出1 ～ 2 cm 的芽
转至 1/2 MS +0.2 NAA的生根培养基中。1个月后把
生根的植株移到室外 ,在遮光的50%的自然光下不打开
瓶口练苗 2～ 3 d后移栽至土壤中。
2 结果
2.1 早熟禾种子愈伤组织的诱导
发芽试验中 ,早熟禾种子 3 ～ 5 d萌发 ,5 ～ 8 d长出
小芽 ,2周后统计种子的发芽率达到93%以上。
2.1.1 不同外植体对愈伤组织再生频率的影响 将成
熟种子消毒处理后 ,接到 MS基本培养基中 ,得到无菌
苗 ,取叶片 、根及胚轴接到愈伤组织诱导培养基 ,同时将
成熟种子接到相同培养基。结果表明(见表 1),叶片与
根没有诱导出愈伤组织 ,胚轴愈伤诱导率仅为 7.4%,种
子出愈率为 24.59%～ 35.45%,因此 ,选定种子为诱导
愈伤组织的外植体材料。比较 4个品种愈伤组织的诱
导情况 ,品种优异的胚性愈伤诱导率最高 ,达到35.45%,
该品种的组培再生性略好于品种肯塔基 、午夜与新哥莱
德 ,品种午夜、优异与新哥莱德愈伤组织继代培养 2次
以后愈伤组织多呈浅黄色 、颗粒状 、结构致密 ,品种肯塔
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基的愈伤诱导率最低 ,愈伤组织生长缓慢 ,多呈半透明 、
结构松散。
表 1 不同外植体对草地早熟禾愈伤组织
诱导率的影响 %
品种 叶片 根 胚轴 种子
Kentuky 0 0 3.2 24.59
Midningt 0 0 6.9 27.26
Merit 0 0 7.4 35.45
Nuglade 0 0 5.7 28.68
2.1.2 2 ,4-D和 6-BA对诱导品种愈伤组织的影响 早
熟禾种子在培养基中诱导 30 d左右的愈伤组织透明 、结
构松软 ,在继代培养基继代 2次以后 ,愈伤组织浅黄色 、
干燥 、致密 ,有颗粒状突起。表 2列出了草地早熟禾种
子在不同浓度2 ,4-D和6-BA培养基上愈伤组织诱导的
结果。接种 1周后 ,种子开始发芽 ,并在芽基部出现乳
白色愈伤组织(图1)。试验表明草地早熟禾种子在含有
不同浓度 2 ,4-D和 6-BA的MS 培养基中诱导愈伤组织
差异明显 ,MS 培养基中2 mg/L 的 2 ,4-D和 0.2 mg/ L
的6-BA诱导效果最好。
表 2 2 ,4-D和 6-BA对愈伤组织诱导频率的影响
mg·L -1
处理 激素配比
2 ,4-D+6-BA
愈伤组织
诱导率/ %
愈伤大小
/ mm
愈伤诱导
启动时间/d
1
2
1+0
1+0.1
40.73
42.58
1
1
14
13
3 1+0.2 47.63 2 10
4
5
1+0.3
2+0
37.96
39.08
2
2
10
8
6 2+0.1 43.11 3 8
7 2+0.2 65.26 4 6
8
9
2+0.3
3+0
58.16
47.83
3
3
7
8
10 3+0.1 50.09 2 7
11 3+0.2 64.73 3 9
12 3+0.3 58.41 1 11
2.2 不同基因型和不同浓度激素配比对愈伤组织分化
的影响
光照培养约 14 d后 ,愈伤组织开始分化出白色的根
和少量绿芽(图3),继续培养则长出绿苗(图4)。不同浓
度和配比的 6-BA 、2 ,4-D 、NAA及 KT 对胚性愈伤组织
分化成苗的频率有显著影响 ,早熟禾不同基因型与不同
浓度激素配比对愈伤组织分化的结果见表 3。结果表
明 ,处理 2、4 、6 、9是早熟禾品种肯塔基 、午夜 、优异与新
哥莱德的最适分化激素浓度 ,其促进早熟禾愈伤组织的
分化效果与其它处理相比差异显著 ,分化率低的愈伤组
织只是原来的诱导形成的体细胞的继续生长 ,芽的继续
分化很少 ,有的形成的芽均为白化苗 ,愈伤组织有褐化
现象。
2.3 再生植株的生根和移栽
早熟禾再生芽在 1/2 MS 培养基上培养 20 d左右
生根率可达到100%(图4),根长度达到 3 cm左右即可
进行移栽(图 5)。移栽到花盆中的再生苗在人工气候箱
中 ,温度(25±1)℃,光周期为光照14 h 、黑暗 10 h ,培养
2周即可移栽到大田中。
表 3 不同基因型和不同浓度激素配比的
愈伤组织分化率 %
处理 激素配比/ mg·L-1 Kentuky Midning t Merit Nuglade
1 6-BA 1.0+2 , 4-D 0.1 15.26 17.46 48.00 20.00
2 6-BA 1.0+2 , 4-D 0.2 13.16 16.38 66.67 19.73
3 6-BA 1.0+NAA 0.5 21.73 36.36 37.50 7.69
4 6-BA 1.0+KT 0.2 27.93 18.75 54.55 30.77
5 6-BA 2.0 23.16 27.27 63.64 29.17
6 6-BA 2.0+2 , 4-D 0.1 13.74 52.38 52.38 33.72
7 6-BA 2.0+2 , 4-D 0.2 16.83 32.14 48.00 47.62
8 6-BA 3.0+2 , 4-D 0.1 8.62 9.68 57.14 20.00
9 KT 2.0 19.59 25.93 53.85 60.00
图 1 草坪草的接种和愈伤组织的诱导继代
图 2 继代 2次的愈伤组织 图 3 愈伤组织的分化
图4 草地早熟禾组培再生苗的生根培养
图5 草地早熟禾再生苗的移栽
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3 结论
在植物组织培养中 ,生长素在诱导愈伤组织的形
成、胚状体的产生以及试管苗的生根中发挥着重要作
用 ,其中 2 ,4-D对大多数草坪草诱导愈伤组织起着主要
作用。马忠华等[ 8]发现 3.0 mg/L 2 ,4-D是早熟禾诱导
愈伤组织的最佳浓度组合。结果表明 ,早熟禾愈伤组织
的诱导率随 2 , 4-D 浓度的增加而提高 ,最适浓度是
2.0mg/L ,浓度继续增加愈伤组织的诱导率反而降低。
品种优异的胚性愈伤诱导率最高 ,其中含2.0mg/L 2 ,4-
D和0.2mg/L 6-BA 的培养基中胚性愈伤组织的诱导
频率最大 ,可以达到 65.26%。大多数愈伤组织呈疏松
光滑 、不生长或生长缓慢的非胚性状态 ,无法继续分化
成绿苗 ,挑选浅黄色 、颗粒状 、结构紧密的胚性愈伤组织
进行继代 ,最终形成正常植株。在分化培养基中 2 , 4-D
的浓度很低 ,甚至有的品种只有除去它才可获得再生植
株。皮伟等报道在加有 0.1、0.3 mg/L 2 ,4-D的培养基
上不能长成幼苗 , 2 , 4-D的存在抑制了幼芽的生长[ 9] 。
有些研究报道 0.1 mg/ L 2 ,4-D是诱导肯塔基草地早熟
禾愈伤组织分化的最佳浓度[ 8, 10] ,NAA和 6-BA 配合使
用没有单独使用2 ,4-D 诱导分化效果好。该试验中 ,早
熟禾品种肯塔基 、午夜 、优异与新哥莱德的最适分化激
素浓度与配比各不相同 ,这可能是因为品种间基因型差
异 ,肯塔基、午夜 、优异与新哥莱德的最适分化激素浓度
与配比分别为 6-BA 1.0 +KT 0.2、6-BA 2.0 +2 , 4-
D 0.1 、6-BA 1.0+2 ,4-D 0.2、KT 2.0。早熟禾再生芽在
1/2 MS 培养基上生根率可达到 100%。
参考文献
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Establishment of the High-efficient Plant Regenaration System of Poa pratensis L.
MA Dong-mei1 , YANG Ya-ya2 , YANG Sai-fei1 , XU Xing1
(1.Academy of Agriculture , Ningxia University , Yinchuan , Ningxia 750021 , China;2.Academy of Sciences , Ningxia University , Yinchuan ,
Ningxia 750021 , China)
Abstract:The best culture medium of the callus induction , differentiation w ere studied.The plant regeneration system
has been established.The results showed that embryo callus inducing ratio of Merit was the highest , reached 65.25%on
the modifiedMS medium containing 2.0mg/ L 2 ,4-D and 0.2mg/ L 6-BA.The best callus differentiation medium of Ken-
tuky 、Midningt 、Merit and Nuglade was different due to different genotype , The best callus differentiation medium of
Kentuky 、Midningt 、Merit and Nuglade w as 6-BA 1.0+KT 0.2 ,6-BA 2.0+2 ,4-D 0.1 ,6-BA 1.0+2 ,4-D 0.2 ,KT 2.0
individually , the ratio of callus differentiation of the Kentuky 、Midningt 、Merit and Nuglade was 27.93%、52.38%、66.
67%and 60%.The rate of rooting of Poa pratensis L.on half strength MS medium+0.2 NAA reached 100%.
Keywords:Poa pratensis L.;Callus;High frequency regeneration system
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