全 文 ：[ 5] Hsu YL , Kuo PL , Chiang LC , ET AL , involvement of p53 , nuclearfactor
kappab and Fas/ Fas ligand in induction of apoptosi s and cell cycle arrest
by saikosaponind in human hepatoma cell lines[ J] .Cancer-Let t , 2004 ,
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2004 , 25:937.
(收稿日期:2010-05-09)
基金项目:“重大新药创制”科技重大专项(2009ZX09103-323)和大学
生创新计划
＊通讯作者
文章编号:1007-4287(2011)07-1066-04
小飞蓬活性成分对乳腺癌MCF-7细胞的作用
吴珊珊1 ,郭　 1 ,张丽红1 ,邱心如2 ,王医术1＊ ,严铭铭3＊
(1.吉林大学病理生物学教育部重点实验室 , 吉林 长春 130021;2.吉林大学药学院 2009 级 , 3.长春中医药大学)
摘要:目的　通过体外实验研究小飞蓬(Erigeron canadensis L.)活性成分对乳腺癌MCF-7 细胞生长 、凋亡和侵袭的
影响。方法　以 5-氟尿嘧啶(5-FU)作用组为阳性对照组 , 以不加药组为阴性对照组 ,小飞蓬组为实验组作用MCF-7细
胞。采用 CCK8 试剂盒测定药物对MCF-7的生长抑制率。绘制在不同药物浓度作用下的细胞生长曲线。观察不同药
物浓度作用下细胞的形态学变化。利用免疫细胞化学染色技术检测药物作用后MCF-7 细胞 Caspase-3、MMP-9 表达情
况。结果　(1)小飞蓬活性成分可抑制 MCF-7 细胞的生长 , IC50为 0.29 mg·mL-1;(2)生长曲线显示 , 药物作用后的
MCF-7 细胞生长较对照组缓慢 ,形态学观察显示细胞逐渐变为长 ,黏附性减弱;(3)药物作用后的MCF-7 细胞 Caspase-3
的表达强于不加药物组(P<0.001),MMP-9 的表达明显弱于对照组(P<0.001)。结论　小飞蓬活性物质可抑制MCF-
7 细胞生长 、侵袭 , 诱导凋亡。
关键词:乳腺癌;小飞蓬;细胞凋亡;细胞生长
中图分类号:R737.9 文献标识码:A
Inhibitory effect of Erigeron canadensis L.on breast cancer cell 　WU Shan-shan , GUO Jun , ZHANG Li-hong , et al.(Key Lab-
oratory of Pathobiology , Minist ry of Education , Jilin University , Changchun 130021 , China)
Abstract:Objective　To study the inhibitory effect of Erigeron canadensis L.on the growth , apotosis and invasiveness of human
breast cancer cells(MCF-7)in vitro.Methods　The effect s of Erigeron canadensis L.on the growth of MCF-7 cells were detected by
CCK-8 kit.The MCF-7cells treated by 5-FU were used as positive control group and the MCF-7cells without any treatment as negative
control group , the MCF-7cells treated by Erigeron canadensis L.were used as experimental groups.Meanwhile the growth of MCF-
7cells after treated by Erigeron canadensis L.was assessed by cell growth curve.And the morphological changes of MCF-7 cells under
different concent rations of medicine were observed.Immunocytochemical staining was used to evaluate Caspase-3 andMMP-9 expres-
sion level.Results　Erigeron canadensis L.inhibited the growth of MCF-7cells and the value of IC50 was 0.29 mg·L-1.After treat-
ment , the growth of MCF-7 cells slowed , and the cells became longth , adherence decreased.Drugs after the expression of Caspase-3
cells was stronger than without drug group(P <0.001).MMP9 expression was significantly weaker than the control group(P <0.
001).Conclusion　Erigeron canadensis L.inhibit cell growth , invasion and induction of apoptosis。
Key words:breat cancer;ergeron canadensis L.;cell aptosis;cell growth
(Chin J Lab Diagn , 2011 , 15:1066)
　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一 ,在我国
占全体恶性肿瘤的 7%-10%[ 1] ,严重威胁妇女身
心健康甚至危及生命 。而据文献报道 ,中药小飞蓬
除了具有较强的抗氧化 ,抗衰老 ,抗突变 ,调血脂的
药理作用外 ,还具有较强的抗肿瘤作用 。因此 ,本实
验研究小飞蓬活性物质对乳腺癌 MCF-7 细胞的抗
肿瘤作用。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　研究对象　人乳腺癌MCF-7细胞 ,购于上海
中科院细胞研究所 。
1.1.2　主要试剂　CCK-8购至Dojindo 公司;5-氟尿
嘧啶购至天津金耀氨基酸公司;免疫组织化学染色
试剂盒购至福州迈新生物技术公司;MMP-9购至 BD
—1066— Chin J Lab Diagn , July ,2011 , Vol 15 , No.7
公司 ,Caspase-3 购至 Gene 公司;小飞蓬活性物质由
长春中医学院提取提供。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养　MCF-7 细胞培养于含 10%FCS
的H-DMEM 培养基中 。
1.2.2　CCK-8 试剂盒测定药物对细胞生长的抑制
作用 取对数生长期的MCF-7细胞 ,以 2×104·mL-1
加入 96孔板内 ,0.1 mL-1孔。小飞蓬作用组按照浓
度 1.28 、0.64 、0.32 、0.16 、0.08 、0.04 mg.L-1分成 6
组 ,每组设 2 个平行孔;5-FU 为阳性对照 , 按照
0.025 、0.0125 、0.00625 、0.003125 、0.001563 、0.000782
mg·mL-1分成 6组 ,每组亦设 2个平行孔;设 2个不
加药的为阴性对照。常规培养 72 h 后 ,小心吸弃上
清 ,每孔加入含 10 μL CCK-8的 RPMI-1640 0.1 mL。
另设一孔仅加入含 10 μL CCK-8的 RPMI-1640 0.1
mL 为空白对照孔 ,37℃、5%CO2培养 3 h后 ,在 Bio-
red 550酶标仪上以空白对照孔调零后 ,在 490 nm 波
长下测定吸光光度值(A值),计算小飞蓬及 5-FU对
MCF7的生长抑制率 ,求出 IC50。细胞生长抑制率
(%)=(对照孔 A值—加药孔 A值)/对照孔 A值×
100%。
1.2.3　绘制生长曲线　取对数生长期MCF-7细胞 ,
调整细胞浓度为 9×104·mL-1 ,接种。根据 IC50值 ,
小飞蓬组设 3 个浓度组 ,分别为低剂量组(1/2 IC50
值)、中剂量组(IC50值)、高剂量组(2×IC50值),阳性
对照组5-FU浓度为 IC50值 ,阴性对照组不加药(0mg
·mL-1)。每个浓度设 3 个复孔 ,37℃、5%CO2孵育 。
共计数7天 ,绘制生长曲线 。
1.2.4　免疫细胞化学染色　常规细胞爬片(细胞密
度及药物浓度等同于生长曲线)。将爬片水化后 ,
0.3%Triton-X100 40μL ,作用 18m in后 EDTA修复液
修复 ,冲洗后滴加阻断剂 20 min ,血清覆盖 15 min ,
直接加入一抗(稀释比例为 1∶200), 4℃过夜。按说
明滴加二抗 、三抗后 DAB 发色。苏木精复染细胞
核 ,常规脱水透明 ,中性树脂封片。结果判定:Cas-
pase-3 、MMP-9均以胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳
性。每张爬片选5个不同视野采集图像 。统计阳性
细胞的灰度值 ,单位为像素。
1.2.5　统计学处理　计量资料以均数±标准差( x ±
s)表示 。单变量两组资料之间的比较采用 t 检验 ,
多组资料之间的比较采用单因素方差分析 , P<0.05
为差异有显著性。采用 SPSS 14.0 统计软件分析 。
2　结果
2.1　小飞蓬对MCF-7细胞的抑制作用
CCK-8试剂盒检测结果显示 ,小飞蓬对 MCF-7
细胞的生长有抑制作用 ,且抑制作用随小飞蓬浓度
的升高而增大 ,其 IC50值为 0.29 mg·mL-1 , 5-FU对
MCF-7细胞的 IC50值为 0.0022 mg·mL-1 , P <0.05。
结果见表1 、2。
2.2　小飞蓬作用 MCF-7细胞的生长曲线
选择不同药物浓度作用的 MCF-7 细胞绘制生
长曲线 ,结果显示 ,小飞蓬对 MCF-7细胞的生长有
明显剂量依赖性抑制作用 ,与对照组相比差异明显
(P<0.05),与现有阳性对照药 5-FU 相比无显著性
差异(P>0.05)。结果见图 1。
表 1　小飞蓬对MCF-7 细胞的生长的抑制
小飞蓬浓度
(mg·mL-1)
平均值
(n=2)
细胞生长
抑制率(%)
1.28 0.0095±0.0005 99.2339
0.64 0.013±0.003 98.9516
0.32 0.012±0.015 90.3226
0.16 1.0085±0.0004 18.6694
0.08 1.0945±0.0135 11.7339
0.04 1.10±0.0007 10.7419
表 2　5-FU对 MCF-7 细胞的抑制作用
5-FU浓度
(mg·mL-1)
平均值
(n=2)
细胞生
存指数
0.025 0.0835±0.0075 93.2661
0.012 5 0.11±0.004 91.129
0.006 25 0.156±0.006 87.4194
0.003 125 0.3095±0.0115 75.0403
0.001 563 0.7835±0.0485 36.8145
0.000 782 1.10208±0.084 9.184
2.3　MCF-7细胞形态的变化
倒置相差显微镜下观察药物作用后细胞形态改
变:对照组(0 mg·mL-1)细胞 ,呈三角形或多角形 ,粘
附性好 ,折光性强。小飞蓬低剂量组(0.145 mg·
mL-1)细胞呈多角型 ,死亡较少 ,粘附性好 ,折光性较
强 ,状态较好;小飞蓬中剂量组(0.29 mg·mL-1)细胞
变长 ,死亡较多 ,粘附性减弱 ,折光性减弱;小飞蓬高
剂量组(0.58 mg·mL-1)细胞变长 ,死亡更多 ,折光性
差。5-FU在浓度为 0.0022 mg·mL-1时 ,细胞呈不规
则形 ,有部分细胞死亡 ,折光性减弱 。结果见图 4。
—1067—中国实验诊断学　2011年 7月　第 15卷　第 7期
　　图 1　小飞蓬作用MCF-7细胞的生长曲线　　图 2　小飞蓬作用后 24小时后 MCF-7 细胞的状态(×200)
2.4　MCF-7细胞中 Caspase-3的表达
对照组无 Caspase-3表达为阴性 ,小飞蓬组 Cas-
pase-3表达较强 ,随着浓度的增加表达增强 ,5-FU组
为弱表达 ,小飞蓬 2个组 Caspase-3表达高于对照组
(P <0.001),小飞蓬高剂量组(0.58 mg·mL-1)、中
剂量组(0.29 mg·mL-1)Caspase-3 表达与 5-FU(P <
0.01)相近 ,无统计学意义。结果见表 3 ,图 3。
表 3　MCF-7 细胞中 Caspase-3的表达
分组 浓度(mg·mL-1) IOD值
高剂量组 0.58 361356.06±2827.88
中剂量组 0.29 359804.87±8168.59
低剂量组 0.145 1061688.00±15585.00
5-FU组 0.0022 277242.34±1447.37
对照组 0 120674.74±1338.00
2.5　MCF-7细胞中MMP-9 表达情况
MMP-9 免疫细胞化学染色结果提示 , 对照组
MMP-9表达为强阳性 ,小飞蓬组表达弱于对照组 ,
且随着浓度的增高 ,表达下降(P<0.001)。结果见
表4及图 4。
表 4　MCF-7 细胞中MMP-9的表达
分组 浓度(mg·mL-1) IOD值
高剂量组 0.58 287074.00±1354.17
中剂量组 0.29 228515.94±18037.05
低剂量组 0.145 379846.44±197075.17
5-FU组 0.0022 277242.34±1447.37
对照组 0 　886012.00±150496.00
图 3　Caspase-3 在MCF-7 细胞中的表达(×200)
图 4　MMP-9 在MCF-7细胞中的表达(×200)
3　讨论
乳腺癌已成为我国妇女中发病率最高的恶性肿
瘤 ,虽有手术 、放疗 、化疗 、生物疗法等多种方法 ,但
中药的抗癌作用日益受到人们的重视[ 2] 。小飞蓬
(Erigeron canadensis L.)又名祁州一枝蒿 、蛇舌草 、竹
叶艾 、鱼胆草 、苦蒿 ,是菊科飞蓬属的一年生草本植
物 ,广泛分布于中国各地 。有文献记载小飞蓬的药
用有清热利湿 、散瘀消肿 、改善肾的微循环的功效并
且还具有较强抗肿瘤的药理作用[ 3] 。黄酮类成分为
小飞蓬抗氧化 、抗肿瘤 、抗病毒 、治疗心脑血管疾病
的主要有效部位[ 4] 。但迄今为止 ,小飞蓬对 MCF-7
是否有抑制作用未见报道。本研究通过体外实验观
察小飞蓬对 MCF-7细胞生长抑制作用 。本研究应
用 CCK-8 试剂盒测得小飞蓬可以抑制人乳腺癌
MCF-7细胞生长 , IC50 值为 0.29 mg·mL-1;进一步
通过绘制 MCF-7细胞生长曲线观察到 , 小飞蓬对
MCF-7细胞的生长有明显剂量依赖性抑制作用 。形
态学观察发现小飞蓬作用后 MCF-7细胞形态的改
变 ,细胞由多角型 、附壁性好逐渐变长 ,死亡多 ,胞浆
内颗粒增多 ,折光性差 。上述结果均表明小飞蓬可
抑制MCF-7生长 ,并降低细胞粘附性和铺展能力。
Caspase为半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶简称 ,在正常
状态下以无活性的酶原形式存在 。当在凋亡信号刺
激下被激活 ,上游的 Caspase 有次序的激活下游的
Caspase ,形成Caspase 级联反应 ,将凋亡信号传递到
凋亡底物 。1993年首次发现 Caspase 参与细胞凋亡
过程以来 ,大量研究表明 ,Caspase-3在细胞凋亡过程
中处于中心地位 ,是细胞凋亡的主要效应因子[ 5 ,6] 。
Caspase-3蛋白酶是凋亡中最重要的因子 ,其在 Cas-
pase 级联反应中处于核心地位 ,Caspase- 3的剪切活
化是细胞凋亡发生的关键步骤及一切凋亡信号传导
—1068— Chin J Lab Diagn , July ,2011 , Vol 15 , No.7
的共同通路 ,所以该蛋白酶也被称为死亡蛋白酶[ 7] 。
本研究通过免疫细胞化学染色检测 Caspase-3 在
MCF-7细胞中的表达 。研究结果表明 ,小飞蓬作用
细胞后Caspase 3的活性明显强于对照组 ,并呈剂量
依赖 。因而 ,我们得出结论 , 小飞蓬体外对 MCF-7
细胞的生长抑制作用是通过激活 Caspase 3 诱导细
胞凋亡而实现的 。在肿瘤侵袭 、转移的复杂过程中 ,
基质金属蛋白酶(MMPs)起着重要的作用 。而MMP-
2 、MMP-9能降解明胶和 IV 、V 、Ⅶ 、X 型基底膜胶原 ,
允许内皮细胞降解并浸润血管基底膜 ,产生 ECM 降
解产物 ,从而趋化内皮细胞 ,激活并固定 ECM 中的
生长因子[ 8] 。研究者在肿瘤的浸润 、转移方面发挥
着极为重要的作用[ 9] 。闫承慧等在体外培养肺腺癌
细胞系 ,结果发现腺癌细胞产生MMP 的能力与其转
移能力有一定相关性 ,转移能力相对高的细胞系中
MMP-2与 MMP-9的活性均较高 ,而转移能力相对较
低的细胞系中则只表达 MMP-2 ,不表达 MMP-9[ 10] 。
表明MMP-9 的表达与肿瘤高转移能力更为相关 。
本研究体外实验 MMP-9免疫细胞化学染色结果提
示 ,对照组 MMP-9表达为强阳性 ,小飞蓬组表达弱
于对照组 ,且随着浓度的增高 ,表达下降 。说明小飞
蓬在体外可抑制 MCF-7细胞MMP-9的表达 ,从而抑
制其侵袭能力。
参考文献:
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(收稿日期:2010-09-15)
＊通讯作者
文章编号:1007-4287(2011)07-1069-04
新型葡萄糖类似物99TcmN-DGDTC
的药代动力学和显像研究
金仲慧1＊ ,吕忠文2 ,张卫方1 ,张燕燕1 ,盛晓燕1 ,任佳蕾3 ,张俊波3
(1.北京大学第三医院 , 北京 100191;2.吉林大学中日联谊医院;3.北京师范大学化学系)
摘要:目的　探讨[ 99TcmN] 2+间接标记二硫代氨基甲酸脱氧葡萄糖(deoxyglucose dithiocarbamate , DGDTC)药代动力
学特点以及在荷瘤模型小鼠和兔的显像效果。方法　药代动力学研究:标记后的[ 99TcmN] -DGDTC 化合物经耳缘静脉
注射入健康成年新西兰大白兔体内 , 于特定时间点采血测定放射计数 , 以专业软件进行药代动力学计算。动物肿瘤
模型显像:分别以荷瘤 Balb/ C小鼠和新西兰大白兔进行。分别移植 H22鼠肝癌细胞系和 VX2 兔肝癌细胞系于 10 只
小鼠和 5 只兔子皮下 , 待肿瘤成型后静脉注射99TcmN-DGDTC 复合物行显像观察 , 并均以99Tcm-高锝酸盐显像作为对照
研究。扫描方法:采集血流相 、血池相和连续静态图像直至注射后 2-4 h(小时)。结果　药代动力学结果证明99TcmN-
DGDTC 复合物体内分布为二室模型 , 有效半衰期为34.05 min。显像结果证明99TcmN-DGDTC 复合物能充分显示小鼠和
兔肿瘤模型的病变所在 ,注射后 2 h 肿瘤区/周围组织放射计数比值大于 2。结论　药代动力学和显像研究结果充分
证实了99TcmN-DGDTC 作为新的肿瘤代谢显像剂的可行性。
关键词:99Tcm;DGDTC;SPECT;动物模型;肿瘤
—1069—中国实验诊断学　2011年 7月　第 15卷　第 7期