全 文 ：• 3790 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2014年12月第29卷第12期 CJTCMP , December 2014, Vol . 29, No. 12
一点红 Emil ia sonch i fo l ia（L .）DC为菊 科
（Compositae）一点红属植物，又称红背叶、叶下红、
羊蹄草，分布于我国云南、贵州、广西、湖南、山西等
地区。该植物全草入药，味苦性凉，具有清热解毒、
一点红HPLC指纹图谱研究及咖啡酰奎宁酸类
成分的含量测定
沈寿茂1,2，沈连钢1，张晶1，李广志1，张艳华3，陆晖3，斯建勇1
（1中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2盐城师范学院药学院，盐城 224002；
3广西壮族自治区花红药业股份有限公司，柳州 545007）
摘要：目的：研究一点红的HPLC指纹图谱，并测定该药材中新绿原酸①、绿原酸②、隐绿原酸③这3个咖啡
酰奎宁酸类的含量，为其质量控制提供参考。方法：采用Phenomenex C18色谱柱（250mm×4.6mm，4μm），0.1%
甲酸乙腈-0.1%甲酸水为流动相，梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长326nm，柱温为30℃。对10批不同产地的
一点红药材的HPLC图谱进行相似度评价。采用外标法，利用①-③的混合对照品测定其在10批药材中的含量。结
果：确定该10批不同产地的一点红药材具有18个共有峰，10批药材的相似度范围为0.851-0.992；测定了10批一点
红中的3个咖啡酰奎宁酸类成分的含量，结果显示，不同产地一点红中3个成分的含量差异明显。结论：HPLC指
纹图谱方法与3个成分的含量测定方法准确、稳定、简单，可为一点红质量控制提供参考。
关键词：一点红；高效液相色谱法；指纹图谱；咖啡酰奎宁酸类；新绿原酸；绿原酸；隐绿原酸；含量测定
基金资助：国家“重大新药创制”科技专项（No.2011ZX09307-002-01，No.2012ZX09301-002-001）
Study on HPLC fingerprints of emilia sonchifolia and content determination of
caffeoylquinic acids
SHEN Shou-mao1,2, SHEN Lian-gang1, ZHANG Jing1, LI Guang-zhi1, ZHANG Yan-hua3,
LU Hui3, SI Jian-yong1
( 1Institute of Medicinal Plant Development, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences,
Beijing 100193, China; 2School of Pharmacy,Yancheng Teachers’ University, Yancheng 224002, China;
3Guangxi Zhuang Autonomous Region Huahong Pharmaceutical Co. Ltd., Liuzhou 545007, China )
Abstract: Objective: To establish an HPLC method for fingerprint analysis of emilia sonchifolia and simultaneous
determination of three caffeoylquinic acids (neochlorogenic acid①, chlorogenic acid② and cryptochlorogenin acid③) so as to
provide a scientific basis for the quality control. Methods: The separation of HPLC was performed on a Phenomenex C18 column
(250mm×4.6mm, 4 μm) with 0.1% formic acid acetonitrile-0.1% formic acid as the mobile phase in a gradient elution at a flow
rate of 1.0mL/min. The detection wavelength was set at 326nm, and the column temperature was set at 30℃. The similarity of
10 batches of emilia sonchifolia from different fields was appraised by the similarity evaluation system. By using the external
standard method and mixture reference substance, their contents of the 10 batches of herb were determined. Results: 18 peaks were
identified as the characteristic fingerprints of the 10 batches of emilia sonchifolia, and the similarity was from 0.851 to 0.992. The
contents of neochlorogenic acid①, chlorogenic acid② and cryptochlorogenin acid③ in emilia sonchifolia from different habitats
were different from each other. Conclusion: The method is accurate, stable and simple, which could be used for quality control of
emilia sonchifolia.
Key words: Emilia sonchifolia; HPLC; Fingerprint; Caffeoylquinic acids; Neochlorogenic acid; Chlorogenic acid;
Cryptochlorogenin acid; Content determination
Fund assistance: New Medicine Development of National Science and Technology Major Project (No.2011ZX09307-002-01,
No.2012ZX09301-002-001)
通讯作者：斯建勇，北京市海淀区马连洼北路151号中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，邮编：100193
电话：010-57833299，E-mail：jysi@implad.ac.cn
·论著·
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散瘀消肿的功效[1]。现代药理学研究表明，一点红具
有细胞毒、抗菌抗炎、抗氧化、镇痛等活性[2-4]。一点
红中含有黄酮、生物碱、甾体及其他类型的化学成
分[5-7]。目前，一点红药材的质量多以黄酮或生物碱
的含量作为评价依据[8-9]。然而中药的疗效可能是多
成分协同作用的结果，单一或几个成分含量难以全
面反映药材内在质量。中药指纹图谱因其具有整体
性、模糊性和可以量化等特点，能够较全面地反映
中药的整体质量，已成为国际上公认的控制中药质
量的有效手段[10]。本研究采用高效液相色谱法（high
performance liquid chromatography，HPLC）建立广西9
个地区10批一点红药材的HPLC指纹图谱，并计算相
似度。此外，同时测定了10批一点红药材中3个咖啡
酰奎宁酸类成分新绿原酸①、绿原酸②、隐绿原酸
③的含量，为一点红药材的质量控制提供参考。
材料
1. 仪器与试剂 美国Waters 600液相色谱仪
（Waters2489紫外分光光度计，Empower色谱工作站）。
乙腈、甲醇（色谱纯，Honeywell公司），水（娃
哈哈公司），甲酸（色谱纯，天津光复精细化工研究
所），其他试剂均为分析纯。
2. 药材 一点红药材（见表1）均由广西壮族
自治区花红药业股份有限公司提供，经中国医学科
学院药用植物研究所张本刚研究员鉴定为菊科一
点红属植物一点红Emilia sonchifolia（L.）DC的全
草，各标本存于中国医学科学院药用植物研究所。
对照品新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸均由成都瑞
芬思生物科技有限公司提供（批号分别为X- 014 -
130126，L-007-121018，Y-067-120825），经检测纯
度均>98.0%。
表1 10批一点红药材的基本信息
编号 批号 产地 编号 批号 产地
1 Y26-20120501 广西象州 6 Y26-20120804 广西宜州
2 Y26-20120601 广西象州 7 Y26-20120805 广西富川
3 Y26-20120701 广西恭城 8 Y26-20120806 广西武鸣
4 Y26-20120801 广西全州 9 Y26-20121001 广西柳州
5 Y26-20120803 广西柳城 10 Y26-20120501 广西南宁
方法与结果
1. 色谱条件 色谱柱：Phenomenex C18色谱柱
（250mm×4.6mm，4μm）；流动相：0.1%甲酸乙腈
（A）-0.1%甲酸水（B）为流动相，梯度洗脱（0-7
min，5%→8%A；7-17min，8%→15%A；17-45min，
15%→30%A；45-55min，30%→50%A；55-60min，
50%→100%A），流速1.0mL/min，检测波长326nm，
柱温为30℃；进样量10μL。
2. 供试品溶液的制备 精密称取一点红药材
粉末（过40目筛）1.000g置于250mL烧瓶中加50mL
50%甲醇，水浴加热回流提取2h，滤过，回收溶剂，
得残渣，用50%甲醇溶解残渣并定容至10mL容量瓶
中，摇匀，静置，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续
滤液，待用。
3. 方法学考察
3.1 精密度试验 取供试品溶液（样品3），连续
进样6次，分别对共有峰的保留时间和峰面积进行考
察，结果表明，各共有峰保留时间的RSD<1.0%，峰
面积的RSD<3.0%，表明仪器精密度良好。
3.2 稳定性实验 取供试品溶液（样品3），分别
在0、2、4、8、12和24h进行分析，考察共有峰的保
留时间和峰面积，结果表明，各共有峰保留时间的
RSD<1.0%，峰面积的RSD<3.0%，表明供试品溶液
在24h内稳定性良好。
3.3 重复性试验 取同一批号的供试品（样品
3）6份，按照供试品溶液的制备与检测方法进行试
验，分别对共有峰的保留时间和峰面积进行考察，
表明各共有峰保留时间的RSD<1.0%，峰面积的
RSD<3.0%，表明重复性良好。
4. 指纹图谱与相似度分析 按“2.”项下供试品
制备方法处理，“1.”项下色谱条件，分别记录10批一
点红药材的HPLC图谱。将所得图谱导入国家药典委
员会“中药指纹图谱相似度评价软件A”（2004版），
以样品1为参照图谱，经多点校正，数据匹配，以中位
数法生成对照指纹图谱R，见图1，确定了18个共有
特征峰，可作为判别一点红药材质量的群体特征峰，
其中峰1、3、4分别为对照品①、②、③的峰。18个共
有峰保留时间RSD<1.0%，说明各产地药材共有峰保
留时间一致。10批不同产地一点红的HPLC指纹图谱
共有模式样品指纹图谱见图2，10批样品的指纹图谱
与对照图谱R相比，其相似度范围在0.851-0.992之间
（见表2）。
图1 软件生成的10批一点红药材对照指纹图谱R
注：1. 新绿原酸；3. 绿原酸；4. 隐绿原酸。
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表2 不同产地一点红药材的相似度评价
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
产地 象州 象州 恭城 全州 柳城 宜州 富川 武鸣 柳州 南宁
相似度 0.902 0.983 0.851 0.986 0.992 0.986 0.972 0.947 0.984 0.938
5. 含量测定
5.1 含量测定色谱条件 同“1.”项。各相邻色谱
峰的分离度均>1.5，理论塔板数均>3 000。见图3。
A
B
图3 对照品溶液（A）、一点红药材（B）的HPLC色谱图
注：1. 新绿原酸；2. 绿原酸；3. 隐绿原酸。
5.2 含量测定对照品溶液的制备 分别精密
称取上述3个咖啡酰奎宁酸类对照品适量，加50%
甲醇分别制成对照品的储备溶液（①0.884mg/mL；
②1.744mg/mL；③1.014mg/mL）。分别精密吸取各对
照品储备液各2.00mL，制成每1mL含化合物①、②、
③分别为176.80、348.80和202.80μg的混合对照品
储备液。
5.3 含量测定供试品溶液的制备 同“2.”项。
5.4 含量测定的方法学考察
5.4.1 标准曲线、定量下限和检测下限：分别精
密吸取混合对照品溶液0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、
3.20mL，加50%甲醇稀释至5.0mL，共得7个（包括
母液）不同浓度的对照品溶液，按“3.1”项下进行测
定，记录峰面积。以峰面积A对质量浓度C（μg/mL）
进行线性回归，得到各成分的线性回归方程和线性
范围。逐步稀释对照品溶液，按信噪比10和3分别测
定各成分的定量下限（LOQ）和检测下限（LOD），见
表3。
5.4.2 含量测定的精密度：精密吸取“3.4.1”项
同一混合对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，
连续进样6次，记录峰面积。1-3峰面积的RSD值均为
1.1%，说明仪器精密度良好。
5.4.3 含量测定的重复性：精密称取同一批号一
点红（样品3）6份，按“3.3”项下方法制备供试品溶
液，分别测定3个化合物的含量。结果①-③的平均
质量分数分别是0.077mg/g（RSD=2.2%），0.390mg/g
（RSD=2.0%），0.119mg/g（RSD=1.9%）。
5.4.4 含量测定的稳定性：精密吸取同一供试品
溶液（样品3）10μL，分别于0，2，4，8，12和24h各测
定一次。结果6次峰面积值RSD分别为1.3%，0.8%和
1.6%，说明供试品溶液至少在24h内稳定性良好。
5.4.5 含量测定的加样回收率：精密称取6份已
测定含量的供试品（样品3）0.500g，分别精密加入
每mL含新绿原酸40.00μg，绿原酸192.00μg和隐绿
原酸61.00μg的混合对照品溶液1.00mL，按上述方
法制备供试品溶液，测定，计算加样回收率。结果
①-③的平均回收率（n=6）分别是100.30%，98.29%
和99.62%；RSD分别为1.8%、2.6%和1.8%，表明实验
方法准确度良好。
5 . 5 含 量 测定的 结果 分 别 称 取10 批一点
红药材1.0 0 0g，按“2 .”项下方 法制备 供试品溶
液，分别 精密吸取供试品溶 液各10μL，注 入液
相色谱 仪，按“1.”项 下色谱 条 件 测定，以外标
法计 算 3 个 咖 啡 酰 奎 宁酸 类 成 分 的质 量分 数，
见 表 4 。1 0 批一点 红 药 材 中 ① 、② 和 ③ 的 含 量
表3 3个咖啡酰奎宁酸的回归方程、定量下限和检测下限
成分 回归方程 r值 线性范围（μg/mL） 定量下限（μg/mL） 检测下限（μg/mL）
1 A=28 463C-25 215 0.9999 3.54-176.80 0.036 0.011
2 A=27 461C-21 491 0.9999 6.98-348.80 0.035 0.011
3 A=25 254C-47 879 0.9999 4.06-202.80 0.041 0.013
图2 10批不同产地一点红的HPLC指纹图谱共有模式
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分别为0.036 - 0.128mg /g，0.123- 4.0 94mg /g和
0.060-0.231mg/g。
表4 10批一点红的3个咖啡酰奎宁酸成分含量测定结果（mg/g）
编号 新绿原酸含量 绿原酸含量 隐绿原酸含量 总含量
1 0.068 0.123 0.098 0.289
2 0.042 0.328 0.067 0.437
3 0.077 0.390 0.119 0.586
4 0.062 0.276 0.105 0.443
5 0.059 0.476 0.099 0.634
6 0.048 0.391 0.081 0.520
7 0.060 0.915 0.101 1.076
8 0.040 0.214 0.071 0.325
9 0.036 0.191 0.060 0.287
10 0.128 4.094# 0.231 4.453
注：# 为超出线性范围6.98-348.80μg/mL，但该数据不影响样
品10中绿原酸含量的趋势走向。
讨论
本研究以50%甲醇加热回流提取一点红药材，采
用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相进行梯
度洗脱，HPLC指纹峰得到较好的分离。新绿原酸、
绿原酸和隐绿原酸的紫外最大吸收波长（326±2）
nm[11-12]，且在326nm处样品中各峰分离良好，特征性
强，峰数目较多，故选择326nm为检测波长。
10批不同产地一点红药材HPLC指纹图谱整体
相貌基本相同，特征指纹峰的保留时间一致。除了样
品3（批号：Y26-20120701）外，其余9批药材的HPLC
指纹图谱与对照图谱相似度均>0.90，表明这些产地
一点红所含化学成分的组成基本上是一致的。样品
3在40-50min之间比其余样品明显多出一些化学成
分，结合“3.3”项下样品3的重复试验，可以推断样品
3的成分差异并不是由于操作过程中样品污染产生。
前期研究结果[13]及参考文献[14]的报道，一点
红含有咖啡酰奎宁酸类成分，该类成分多具有抗
菌、抗炎的功效[15]。本实验选取了该类成分的新绿
原酸、绿原酸和隐绿原酸进行多指标成分测定，结
果10批不同产地一点红药材的新绿原酸、隐绿原
酸、绿原酸的RSD分别为43.2%、47.4%、162.1%，说
明产地对一点红中的咖啡酰奎宁酸类成分的含量
影响较大。
参 考 文 献
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