全 文 ：中国园艺文摘 2011年第4期
Optimization and Primer Selection of SSR-PCR System on Olive
WU Wen-jun CHEN Wei-qing ZHAO Meng-jiong JIANG Cheng-ying
Abstract: Main factors affecting SSR-PCR system were optimized with the orthogonal design method, and the PCR reaction system
and the detection system of DNA polymorphisms for olive were established. The results showed the optimized SSR-PCR system was
20 ng DNA, 0.15 mmol/L dNTP, 0.15 μmmol/L SSR primer, 1.0 U Taq DNA polymerase in 20 μl content. 24 primer pairs were
selected from100 primer pairs for the SSR analysis based on polymorphisms and clear banding patterns, which could be used for
further olive genetic diversity research.
Key words: olive; SSR-PCR system; primer selection
[4] F. Carriero,G. Fontanazza,F. Cellini,et al.Identifica-
tion of simple sequence repeats (SSRs)in olive[J].The-
or Appl Genet,2002,(104):301-307.
[5] G. Cipriani,M.T. Marrazzo,R. Marconi,et al.Microsatel-
lite markers isolated in olive (Olea europaea L.)are
suitable for individual fingerprinting and reveal
polymorphism within ancient cultivars[J]. Theor Appl
Genet,2002,(104):223-228.
水苦荬婆婆纳无性系建立的研究
李丹妮 孙 艳 赵长吉 张冬艳 姜长阳
(辽宁师范大学生命科学学院，辽宁 大连 116029)
摘 要：为保护野生资源，实现人工栽培，以水苦荬婆婆纳嫩茎为材料，进行愈伤组织诱导和不定芽分化，试管
苗生根、移栽和定植的研究，建立起无性系。结果证明：MS+BA 0. 4 mg/ L+NAA 0. 4 mg/ L+2, 4- D 1. 2～1. 6 mg/ L
是愈伤组织诱导培养的理想培养基；MS+BA 0. 6 mg/ L+NAA 0. 1 mg/ L+AgNO3 0. 3 mg/ L是愈伤组织分化培养和不定
芽分化增殖继代培养的理想培养基；1/ 3 MS+NAA 0. 1 mg/ L+ IAA 0. 3 mg/ L是试管苗生根培养和继代生根增殖培养
的理想培养基。定植的试管苗保持了所有生物学性状，且长势旺盛。
关键词：水苦荬婆婆纳；组织培养；无性系
水苦荬婆婆纳 (Veronica anagallis- aquatixca)又称无
风自动草、水苦荬、北水苦荬，属于玄参科婆婆纳属多年
生草本植物，生长于水边湿地。在我国东北、西北、华北、
华南和西南等地有分布，在辽宁的大连、本溪等地也有分
布[1]。水苦荬婆婆纳全草含苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸等化学
成分，用作中药，具有清热解毒、活血止血等功效，能治
感冒、眼疼、劳伤咳血、跌打损伤、月经不调、痢疾、血
淋、疮肿等疾病[2]。嫩苗可食，也可将鲜茎叶或干粉作为动
物饲料添加剂。据有关人员观察证明，将水苦荬婆婆纳作
为饲料添加剂后，动物疾病明显减少。由于具有重要的中
药价值，多年来人们一直在采收野生水苦荬婆婆纳。而近
年来因发现其作为动物饲料添加剂的防病作用，又极大地
加强了人们对其采收的力度。过度的采挖使分布和数量本
来都很少的水苦荬婆婆纳的野生数量迅速减少。现在在大
连地区，人们几乎采不到野生的水苦荬婆婆纳，使其处于
濒危状态。为保护野生资源，实现人工栽培，研究者对水
苦荬婆婆纳进行了无性系建立的研究，虽然目前已有玄参
科植物组织培养研究的报道[3- 7]，但婆婆纳属植物组织培养
研究的报道迄今未见。
1 材料与方法
1. 1 材料及灭菌
6月上旬，将生长于大连郊区水库边上长势非常旺盛的
第一作者简介：李丹妮（1989－），女，本科；就读于辽宁师范
大学生命科学学院生物技术系。
通讯作者：姜长阳，教授。E-mail:changyangjiang@126.com
项目来源：辽宁省高等教育教学改革资助项目(20090304)；辽宁
师范大学教学改革资助项目(LSJG:20090108)。
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CHINESE HORTICULTURE ABSTRACTS
表2 不同浓度组合的NAA与AgNO3对愈伤组织分化培养的影响
NAA
(mg/ L)
0
0. 1
0. 1
0. 1
0. 1
0. 1
0. 6
0. 6
0. 6
0. 6
0. 6
1. 2
1. 2
1. 2
1. 2
1. 2
AgNO3
(mg/ L)
0
0. 1
0. 3
0. 5
0. 7
0. 9
0. 1
0. 3
0. 5
0. 7
0. 9
0. 1
0. 3
0. 5
0. 7
0. 9
愈伤组织
分化率(%)
0
71
92. 5
42. 5
21
20
0
8
9
2
0
0
0
0
0
0
平均分化
不定芽(块)
0
4. 8
5. 2
2. 2
1. 6
1. 3
0
5. 2
2. 2
1. 6
0
0
0
0
0
0
分化不定芽
长势
-
++
++
+
+
+
-
++
+
+
-
-
-
-
-
-
水苦荬婆婆纳的地上部采回，把叶片、叶柄和嫩茎分别剪
下进行灭菌。详细灭菌方法见文献[8]。
1. 2 培养条件
培养条件详见文献[8]。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 愈伤组织的诱导培养 将无菌叶片剪成长0. 3 cm
左右块、无菌叶柄和嫩茎切成长0. 4 cm左右的叶柄段和嫩
茎段后，分别接种到MS+BA 0. 4 mg/ L+NAA 0. 4 mg/ L
+2, 4- D 1. 2～1. 6 mg/ L的培养基上，进行不同材料愈伤
组织诱导培养。不同材料愈伤组织诱导培养重复3次，每种
处理接种200块材料。
1. 3. 2 愈伤组织的分化培养 把以上诱导培养的愈伤组
织，切割成0. 2 cm左右的块状后，接种到以MS+BA
0. 6 mg/ L为基本培养基，附加NAA与AgNO3不同浓度
组合的培养基上，进行愈伤组织的分化培养。不同材料
愈伤组织诱导培养重复2次，每种培养基处理接种200块
材料。
1. 3. 3 不定芽生根培养 将有不定芽分化增殖继代培养的
不定芽从基部切下，接种到以下3种生根培养基上进行不定芽
的生根培养：1/ 3 MS+NAA 0. 1 mg/ L+ IAA 0. 3 mg/ L、
1/ 3MS+NAA 0. 1 mg/ L+ IBA 0. 3 mg/ L、1/ 3MS+NAA
0. 1 mg/ L+2, 4- D 0. 3 mg/ L。生根培养试验重复3次，
每种培养基接种培养300个不定芽。
1. 3. 4 试管苗的炼苗与移栽 当增殖继代培养的试管苗
长高到3 cm以上、具有3条以上长0. 5～1. 0 cm的根时，
去掉培养瓶棉塞，在温室中炼苗2～3 d后，用镊子将试管
苗取出，洗净根部的培养基，再移栽到湿度90%左右、没
有直射光的温室内上半部为干净河沙的营养钵中，进行
试管苗的移栽试验。移栽试验重复2次，每次移栽400株
试管苗。
2 结果及分析
2. 1 不同材料对愈伤组织诱导培养的影响
接种后50 d统计结果见表1，以叶片为材料，不能诱导
生长愈伤组织；以叶柄为材料也不易诱导生长愈伤组织；
以嫩茎为材料诱导生长愈伤组织的百分率达91. 5%。观察
还表明，以嫩茎为材料培养到12 d时，可见嫩茎切口边缘
形成无色透明状愈伤组织；随后，伴随着愈伤组织的迅速
生长，愈伤组织块的表面逐渐变成嫩绿色，外观上生长旺
盛。培养到50 d时，诱导的愈伤组织生长为直径为0. 6～
1. 5 cm半球状愈伤组织。3次重复试验的结果基本一致。
以上结果说明：MS+BA 0. 4 mg/ L+NAA 0. 4 mg/ L+2,
4- D 1. 2～1. 6 mg/ L培养基是水苦荬婆婆纳嫩茎愈伤组织
诱导培养的理想培养基。
2. 2 不同浓度组合的NAA与AgNO3对愈伤组织分化培
养的影响
接种后45 d统计结果见表2。不同浓度组合的NAA与
AgNO3对愈伤组织分化的影响不同。当NAA的浓度为1. 2
mg/ L与不同浓度的AgNO3组合使用时，培养的愈伤组织不
能分化；当NAA的浓度为0. 6 mg/ L与不同浓度的AgNO3
组合使用时，培养的愈伤组织也不易分化；当NAA的浓度
为0. 1 mg/ L与不同浓度的AgNO3组合使用时，培养的愈伤
组织分化效果较好；其中NAA的浓度为0. 1 mg/ L与浓度
为0. 3 mg/ L AgNO3组合使用时，不仅培养的愈伤组织分
化率为92. 5%、平均每块培养的愈伤组织能分化出5. 2个不
定芽，而且所分化的不定芽长势好。观察也表明，在NAA
浓度为0. 1 mg/ L与浓度为0. 3 mg/ L AgNO3组合使用的培
养基上，培养到第8天时可见在培养的愈伤组织块上分化出
不定芽点，随后不定芽点很快生长为不定芽。接着，伴随
着第1个分化的不定芽生长，在其基部又会分化生长出多个
不定芽。培养到45 d时，1块分化培养的愈伤组织就会分化
培养出一丛高为0. 6 cm的生长旺盛的不定芽。把不定芽从
基部切下，进行不定芽的分化增殖继代，2次重复试验，每
次继代6次结果证明：经过40 d的培养，又会分化生长出一
丛比由愈伤组织分化培养不定芽旺盛的继代增殖培养不定
芽，平均每个继代周期的增殖系数为5. 1。以上结果证明：
MS+BA 0. 6 mg/ L+NAA 0. 1 mg/ L+AgNO3 0. 3 mg/ L
培养基是水苦荬婆婆愈伤组织分化培养和不定芽分化增殖
继代培养的理想培养基。
表1 不同材料对愈伤组织诱导的影响
材料类型
叶片
叶柄
嫩茎
注：++为长势好；+为长势一般；- 为不生长。下同略。
接种数量
200
200
200
愈伤组织诱导率(%)
0
5. 5
91. 5
愈伤组织长势
-
+
++
8
中国园艺文摘 2011年第4期
2. 3 不同培养基对不定芽生根培养的试验及继代生
根增殖培养
接种后30 d统计证明：在进行生根试验的3种培养基
中，1/ 3 MS+NAA 0. 1 mg/ L+ IAA 0. 3 mg/ L的生根效
果最好。3次重复试验平均结果是：生根率93. 4%，每株试管
苗生根7. 2条，具有5. 8个叶片，高度4. 6 cm。从外观上试管
苗生长旺盛、根系嫩白。以上结果证明：1/ 3 MS+NAA
0. 1 mg/ L+ IAA 0. 3 mg/ L培养基是水苦荬婆婆不定芽生
根培养的理想培养基。
将以上由不定芽生根培养的试管苗切成长1. 5 cm左
右、至少具有2个生长点(具有2个叶片)的茎段后，接种到与
不定芽生根培养条件相同的培养基上，进行试管苗的继代
生根增殖培养。共6代继代生根增殖培养，每代培养300株
试管苗。结果如下：26 d为1个继代生根增殖培养周期，每
次的增殖系数为2. 8。所培养的试管苗生长旺盛，几乎没有
无效苗。上述说明：1/ 3 MS+NAA 0. 1 mg/ L+ IAA 0. 3
mg/ L培养基也是水苦荬婆婆纳试管苗继代生根增殖培养的
理想培养基。
2. 4 试管苗的移栽与定植
移栽后10 d左右可见试管苗成活并长出新叶。30 d统
计：平均成活率为94. 1%，移栽容易成活。
把移栽成活的试管苗于5月上旬分2次定植到大连郊区
水库边的湿地上，共定植742株，成活736株，成活率99%。
5月上旬定植的试管苗，与4月中旬播种的实生苗相比，
具有以下特点：定植后前40 d左右生长缓慢、植株较小，
而后生长速度加快，群体整齐，外观上生长非常旺盛，地
下部根系增加1倍左右。试管苗保持了野生水苦荬婆婆纳的
所有生物学性状，但开花时间延迟15 d左右。
3 讨论
本研究定植的试管苗具有野生水苦荬婆婆纳的所有生
物学性状说明，通过组织培养的手段繁殖的后代，能使水
苦荬婆婆纳的遗传性不变，这种技术培养的试管苗可以应
用于野生资源的保护和药用栽培。
本试验能通过不定芽继代增殖培养和试管苗继代生根
增殖培养两条途径达到快速繁殖的目的。前者40 d为1个继
代周期，增殖系数为5. 1，年繁殖量约为230万；后者26 d
为1个培养周期，增殖系数为2. 8，年繁殖量约为180万。从
二者的年繁殖数量看，前者繁殖速度比后者快，应通过不
定芽继代增殖培养进行繁殖，而实际上应通过试管苗继代
生根增殖培养进行繁殖。这是因为虽然后者的繁殖速度慢，
但试管苗生长非常旺盛，几乎没有无效苗。
定植的试管苗长势比实生苗旺盛，产生这种现象由以
下原因引起：(1)用于试验的材料是生长非常旺盛的植株，
本身具有生长非常旺盛的遗传性；(2)在培养中使用一定浓
度的生长素，生长素的后效作用促进旺盛生长；(3)试管苗
根系增加了1倍左右。发达的根系能吸收更多的营养，也促
进了生长。正是由于试管苗的营养生长非常旺盛，从而也
抑制了生殖生长，使其开花延迟15 d左右。
参考文献：
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[2] 南京中医药大学.中医药大辞典(上册)[M].上海:上海科学技
术出版社,2006.
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[J].农业科技通讯,2003,(2):18.
[4] 梁佼,程丽娟,陈莹等.毛地黄组织培养及无性系的建立[J].山
东农业科学,2007,7(6):11-13,20.
[5] 施和平,权宏.紫花洋地黄组织培养和植株再生[J].中草药,
2004,35(3):327-328.
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导的影响[J].西安文理学院学报,2009,12(1):43-47.
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理学通讯,2007,43(1):125-126.
[8] 黄葳,施玉婷,杨微等.小花鬼子针组织培养及无性系建立的研
究[J].中国园艺文摘,2010,(5):9-12.
Establishment of Asexual Line for Veronica anagallis-aquatixca
LI Dan-Ni SUN Yan ZHAO Chang-Ji ZHANG Dong-Yan JIANG Chang-Yang
Abstract: In order to protect wild resources and realize artificial cultivation, the tender stems of Veronica anagallis-aquatixca were
used as the material to research callus induction, adventitious buds differentiation, rooting, and transplanting of tube seedlings, and fi－
nally establish the clone of Veronica anagallis-aquatixca. The results show that the optimum medium for callus induction is MS+BA
0.4 mg/L+NAA 0.4 mg/L+2, 4-D 1.2~1.6 mg/L. MS+BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AgNO3 0.3 mg/L is the optimum medium for callus
and adventitious buds differentiation and proliferation of adventitious buds. 1/3 MS+NAA 0.1 mg/L+IAA 0.3 mg/L is the optimum
medium for tube seedlings rooting and subculture. Colonization of plantlets is maintained for all biological traits and grows strongly.
Key words: Veronica anagallis-aquatixca; tissue culture; clone
9