全 文 ：第 36 卷第 1 期 通 化 师 范 学 院 学 报(自然科学) Vol． 36 №1
2015 年 2 月 JOUＲNAL OF TONGHUA NOＲMAL UNIVEＲSITY Feb． 201
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5
还阳参内生菌分离与培养
*
刘丽娟，杨 洋，郑春来
(通化师范学院 生命科学学院，吉林 通化 134002)
摘 要:还阳参是民间的常用中草药，广泛用于治疗呼吸系统疾病．为研究还阳参内生菌的组成，采用组织分离法对还阳参
根、茎、叶和花的内生菌进行分离培养，采用革兰氏染色法，对分离出的内生细菌进行鉴别．结果表明:还阳参不同部位分离出来
的内生菌种类和数量不同，叶分离出的内生细菌较多，同一种菌可以在植物的不同部位生长．从还阳参各部位共分离出了 3 种
内生真菌和 20 种内生细菌，内生细菌中革兰氏阳性菌 14 种，均为杆菌;革兰氏阴性菌 6 种，5 种杆菌，1 种球菌．
关键词:还阳参;内生菌;组织分离法
中图分类号:Q939 文献标志码:A 文章编号:1008 － 7974(2015)
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01 － 0016 － 03
还阳参(Crepis crocea (Lam．)Babcock)为菊科
还阳参属植物，俗称屋根草［1］． 一年或多年生草本，
为民间常用的中草药，气味较苦、性质微寒［2］． 全草
入药，止咳，化痰，平喘，补肾壮阳，益气血，健脾胃，
清热降火．用于老年性咳嗽痰喘、喘息型慢性支气管
炎、肺结核性神经衰弱、白带漏下、头昏耳鸣、小儿消
化及营养不良、胃痛［3］． 生于山坡、田边、路旁或荒
地的草丛中［4］，分布于中国东北、华北、西北地区．
还阳参是一种很有研究价值的天然产物，在我国分
布广泛，原料易得，药用价值高，是重要的野生中草
药［5］，还阳参植物中含有多种化学成分，已分离出
还阳参酸苷、伪蒲公英甾醇乙酸酯［6］等．
已报道，内生菌能合成与宿主植物相同或相似
的活性成分［7］，能促进药用植物产生活性成分［8］．
内生菌广泛分布在各种植物中，近年来，从蔬菜、花
卉、药用植物等多种植物中分离到了大量内生
菌［9］．生长在我国东北的还阳参内生菌的分离与培
养尚无相关报道，为了解还阳参内生菌的种类及组
成，采用组织分离法进行还阳参内生菌分离与培养，
以开发新的微生物资源，提高还阳参的药用价值．
1 材料与方法
1． 1 实验材料
2013 年 6 月采于通化师范学院植物园的健康、
无病虫害的野生还阳参植株，用清水洗净表面泥土
后备用．
1． 2 培养基
采用牛肉膏蛋白胨固体培养基分离并培养内生
细菌;采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基分离并培养内
生真菌;采用高氏 1 号培养基分离并培养放线菌，培
养基采用湿热灭菌法灭菌:高压蒸汽灭菌器，121℃
维持 20min．
1． 3 分离与培养
取新鲜健康的还阳参根、茎、叶、花，用清水洗
净，切成长段，滤纸吸干水分，在无菌室用无菌水冲
洗 2 遍，用 75%乙醇浸泡根 3min，茎 2min，叶和花
1min，重复 3 次后，用无菌水冲洗 3 遍，再用 0． 1%
HgCl2 浸泡，根 30s，茎 20s，叶和花 10s，重复 3 次后，
用无菌水冲洗 4 遍． 然后将还阳参的根和茎切成长
2mm的小段，叶切成 3mm × 3mm 小块，接种到无菌
平板，每平板接 4 个外植体，每部位重复 3 次，同时
做空白对照．牛肉膏蛋白胨固体培养基于 37℃恒温
培养 24h，马铃薯葡萄糖琼脂培养基和高氏 1 号培
养基 28℃恒温培养，前者培养 72h，后者培养 120h．
纯化，斜面保存菌种．
1． 4 鉴别
观察各部位分离出的内生菌的菌落形态，通过
·61·
* 收稿日期:2014 － 09 － 10
作者简介:刘丽娟，女，吉林通化人，副教授．
单染色法、革兰氏染色法和压滴法，对分离到的内生
菌进行观察、鉴别．
2 结果与分析
通过对还阳参各部位内生菌的分离，共分离出
3 种内生真菌和 20 种内生细菌，其中内生细菌有 19
种杆菌，1 种球菌．
2． 1 还阳参内生细菌的分离
采用牛肉膏蛋白胨固体培养基分离还阳参不同
部位的内生细菌，由表 1 可知，在此培养基中分离出
的均为细菌，还阳参不同部位分离出来的内生菌种
类和数量不同，茎中分离出 1 种，根、花中各分离出
2 种，叶中分离出 3 种． 叶中内生菌种类较为丰富，
茎中的内生细菌种类较少，这可能是内生菌对宿主
的选择性及适应性所导致的结果．
表 1 牛肉膏蛋白胨固体培养基上细菌菌落特征和细胞形态
部位 菌落形态 细胞形态特征 备注
根
白色，表面干燥，光滑，
边缘较整齐
G +，长杆状，链状 图 1 a
根
白色，表面干燥，光滑，
边缘较整齐
G －，杆状，链状 图 1 b
茎
白色，表面干燥，边缘不
整齐，表面有皱褶
G +，短杆状，单个分
散
图 1 c
叶
暗黄色，表面干燥，边缘
与中间颜色不同
G +，细杆状，链状 图 1 d
叶
乳白色，表面干燥，边缘
较整齐
G －，球杆状，单个分
散
图 1 e
叶
白色，中间褶皱，边缘湿
润
G +，杆状和细小短杆
状，链状
图 1 f
花
白色，表面干燥，边缘不
整齐
G －，球杆状，单个分
散
图 1 g
花
白色，边缘不整齐，中间
褶皱
G －，细杆状，单个分
散
图 1 h
图 1 牛肉膏蛋白胨固体培养基上分离到还阳参内生细菌菌落形态
及革兰氏染色结果
A．菌落形态;B．革兰氏染色结果(放大倍数 100 × 10)
由表 2、表 3 可知，马铃薯葡萄糖琼脂培养基分
离到 7 种内生细菌，高氏 1 号培养基分离到 5 种内
生细菌，这两种培养基是用来分离真菌和放线菌的，
但实验结果却分离出多种细菌，可能是由于外植体
消毒不彻底，导致外源菌混在内生菌之中，从而不能
准确地判断内生菌群组成．
图 2 马铃薯葡萄糖琼脂培养基上分离到还阳参内生细菌菌落形态
及革兰氏染色结果
A．菌落形态;B．革兰氏染色结果(放大倍数 100 × 10)
表 2 马铃薯葡萄糖琼脂培养基上细菌菌落特征和细胞形态
部位 菌落形态 细胞形态特征 备注
茎 黄色，表面湿润，光滑 G －，短杆，单个分散 图 2 a
茎 黄色，表面湿润，光滑 G +，球状，单个分散 图 2 b
叶 白色，表面湿润，光滑
G +，短杆状，单个分
散
图 2 c
叶
白色，表面干燥，光滑，
边缘较整齐
G +，细杆状，链状 图 2 d
叶
淡黄色，表面湿润，光
滑，透明
G +，杆状和球杆状，
链状
图 2 e
花
淡黄色，表面干燥，光
滑，边缘较规则
G －，短杆，单个分散 图 2 f
花 白色，表面较湿润 G +，短杆，链状 图 2 g
表 3 高氏 1 号培养基上细菌菌落特征和细胞形态
部位 菌落形态 细胞形态特征 备注
茎
表面干燥，边缘与中间
颜色不同
G +，杆状和小短杆
状，链状
图 3 a
茎 乳白色，表面干燥，褶皱
G +，粗杆状和短杆
状，单个分散
图 3 b
叶 乳白，表面较湿润，褶皱
G +，细长杆、短杆，单
个分散
图 3 c
叶
透明，表面较湿润，边缘
较规则
G +，粗杆状、杆状，链
状
图 3 d
叶 透明，表面较湿润
G +，细小杆状，单个
分散
图 3 e
·71·
图 3 高氏 1 号培养基上分离到还阳参内生细菌菌落形态
及革兰氏染色结果
A．菌落形态;B．革兰氏染色结果(放大倍数 100 × 10)
2． 2 还阳参内生真菌的分离
表 4 马铃薯葡萄糖琼脂培养基和高氏 1 号培养基上
真菌菌落特征和细胞形态
部位 菌落形态 细胞形态特征 备注
茎
中央黑色，边缘白色绒
毛状
黑色丝状，菌丝有隔，
孢子
图 4 a
茎
中央黄色，边缘白色绒
毛
黄色丝状，菌丝有隔，
孢子
图 4 b
茎
中央粉红色，边缘白绒
毛
粉红色，菌丝无隔 图 5
由表 4 可知，马铃薯葡萄糖琼脂培养基只在茎
中分离出 2 种内生真菌． 可能是由于外植体消毒时
间过长，叶和花中内生菌被杀死，致使得到的内生菌
群不全面，部分内生菌丢失．高氏 1 号培养基在茎中
分离出 1 种内生真菌，且没有观察到孢子形态，这可
能是有些内生真菌离开了植物体就不能产生孢子所
导致的．而分离出的内生真菌也可能是由于外植体
消毒不彻底，引入的外源杂菌．未分离到放线菌可能
是由于培养基配方不适于放线菌生长引起的．
图 4 马铃薯葡萄糖琼脂培养基上分离到还阳参内生真菌菌落形态
及显微镜观察结果
A．菌落形态;B．光镜结果(放大倍数 40 × 10)
图 5 高氏 1 号培养基上分离到还阳参内生真菌菌落形态
及显微镜观察结果
A．菌落形态;B．光镜结果(放大倍数 40 × 10)
3 结语
药用植物内生菌的研究仍处于初期阶段，但研
究的药用植物已经有数百种，并且已经证实药用植
物的某些内生菌能够产生与宿主相似或相同的成
分，对增强宿主植物对环境适应能力具有重要意义．
本试验采用组织分离法对还阳参各部位的内生菌进
行分离培养，共分离出 3 种内生真菌和 20 种内生细
菌，内生细菌中 14 种革兰氏阳性菌，13 种杆菌，1 种
球菌;6 种革兰氏阴性菌，5 种杆菌，1 种球菌．
药用植物特别是中草药是个宝库，内生菌更是
新兴的宝库，研究好药用植物的内生菌，对于解决部
分药用植物匮乏的问题，发现新成分，发现新的替代
成分，对提高药物疗效等问题具有一定的价值与开
发潜力．
参考文献:
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(责任编辑:陈衍峰)
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