全 文 ：◎基础研究 ◎ 中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办
CN 34-1206 R , ISSN 1009-2501
E-mail:ccpt96@21cn.com
2009 Sep;14(9):1036-1039
2009-06-15收稿　2009-09-19修回
甘肃省教育厅资助科研项目(No:013-01)
罗慧英 ,女 ,博士 ,副教授 ,硕士生导师 ,研究方向:中药药理。
Tel:0931-8765348 　 E-mai l:louria@vip.sina.com
甘西鼠尾草注射液与丹参注射液
对 PC12细胞 H2O2 损伤保护作用比较研究
罗慧英1 ,程体娟2
1甘肃中医学院药理教研室 , 2兰州大学药学院药理教研室 ,兰州 730000 ,甘肃
摘要　目的:比较甘西鼠尾草注射液与丹参注射
液对 PC12细胞 H2O2 损伤的保护作用 。方法:采
用细胞株培养的方法 ,建立 PC12细胞 H2O2 损伤
模型 ,通过MTT 法和流式细胞分析仪检测细胞存
活率和凋亡率;采用免疫细胞化学染色法检测
PC12细胞 bcl-2和 bax 表达 。结果:PC12 细胞经
H2O2损伤后 ,细胞存活率降低 、凋亡率增加 ,甘西
鼠尾草注射液与丹参注射液处理组均可有效缓解
上述改变(P <0.05);两药均使 bcl-2表达增加(P
<0.05),bax 表达减少(P <0.05)。结论:甘西鼠
尾草注射液与丹参注射液对PC12细胞H2O2 损伤
具有明显保护作用。其机理可能与增强凋亡抑制
因子 bcl-2表达 、抑制凋亡促进因子 bax 表达 ,进
而抑制细胞凋亡有关 。
关键词　甘西鼠尾草注射液;丹参注射液;PC12;
H2O2;bcl-2;bax
中图分类号:R965.2
文献标识码:A
文 章 编 号:1009-2501(2009)09-1036-04
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)注射液对脑缺
血再灌注损伤的保护作用 ,近年来国内外已有大
量报道 ,但对同属植物甘西鼠尾草(Salvia przewal-
skii Maxim)的药理作用研究却很少 。在前期的实
验中 ,采用永久阻断大鼠大脑中动脉模型 ,证实了
甘西鼠尾草和丹参注射液对大鼠急性脑缺血均有
明显的保护作用 ,其作用基本相同 ,两药都是通过
降低丙二醛(MDA)含量 ,抑制脂质过氧化 ,降低全
血黏度 、全血还原黏度 、红细胞压积 、红细胞聚集
指数 、红细胞刚性指数 ,抑制血小板聚集 ,清除体
内羟自由基来发挥作用的 ,而甘西鼠尾草注射液
对羟自由基的清除作用明显强于丹参注射液[ 1] ;
我们的实验还证实丹参注射液和甘西鼠尾草注射
液对化学性缺氧小鼠的能量代谢均有改善作用。
两药均可延长缺氧小鼠存活时间 ,降低脑组织乳
酸(LD)含量 ,提高 ATP 酶活力 ,且甘西鼠尾草注
射液在提高 ATP 酶活力方面优于丹参注射液[ 2] 。
同时甘西鼠尾草注射液与丹参注射液还可改善缺
血再灌注损伤大鼠神经功能缺损 ,降低脑组织中
NOS 、NO含量 , 降低脑血管通透性 ,对脑水肿也有
一定的缓解作用[ 3] 。在体外缓解大鼠大脑皮层神
经细胞谷氨酸损伤方面 ,丹参注射液和甘西鼠尾
草注射液都表现出了良好的效果[ 4] 。本研究旨在
通过建立 H2O 2损伤 PC12细胞模型 ,对两药的作
用做进一步的比较。
1　材料与方法
1.1　H2O2损伤 PC12细胞模型的建立　PC12细
胞株(中国药科大学提供)在 DMEM 培养基中按
常规方法培养 ,待呈对数生长后加入不同浓度的
甘西鼠尾草注射液与丹参注射液 ,37 ℃、5%CO2
培养箱 继续培养 1 h , 然后加入 终浓度为
200 μmol L 的H2O2 继续培养 2 h ,造成损伤模型 。
1.2　MTT法　将处理过的细胞消化成细胞悬液
(3×105)接种到 96孔板 ,每孔 100μL ,每组 4个
·1036·
复孔 ,以不含细胞的 1640培养液为调零组 ,未做
处理的细胞为空白对照 ,常规培养 48 h 后加MTT
10 μL 孔 ,继续培养 4 ～ 6 h 后弃上清液 ,加 DMSO
100 μL 孔 , 充分震荡 , 酶联免疫检测仪(波长为
570 nm)测每孔的光密度值(OD值)。计算细胞的
存活率。
存活率(%)=(实验组 OD值 对照组 OD 值)×
100%
1.3　流式细胞仪检测细胞凋亡 　收集并调整
PC12细胞浓度至 2×106 , PBS 液洗涤两次 , 用
70%的预冷乙醇 4 ℃ 固定过夜 , PBS 液洗涤两
次 ,加入 RNA酶 ,PI(100 μg mL)均匀染色 ,流式细
胞仪检测细胞周期及凋亡率。
1.4　免疫细胞化学染色法测 bcl-2和 bax表达　
PC12细胞接种于放有盖玻片(于前一天用鼠尾胶
原处理)的培养皿中 ,按上述方法加入不同浓度药
物 ,H2O2 损伤 2 h 后取出盖玻片 ,常规免疫组化
ABC法染色。简要步骤如下:以 40%多聚甲醛固
定 10 min ,0.3%H2O2 处理后用正常羊血清封闭
30 min 滴加bcl-2多克隆抗体(1∶75)或 bax单克隆
抗体(1∶50),室温反应 1.5 h ,加入 ABC 复合物室
温反应 2 h ,DAB显色 ,明胶封片 。光镜下以每张
盖玻片中央处为中心视野 ,再取其上下左右视野
各1个 ,共 5个视野 ,计算阳性细胞数 ,每组 4个
盖玻片 ,以一个视野为一个样本 ,共计 20个样本 。
1.5　统计学处理　所有数据用均数±标准差(x
±s)表示 ,组间比较采用 t 检验 。
2　结果
2.1　甘西鼠尾草注射液和丹参注射液对经 H2O2
处理的 PC12细胞细胞存活率和凋亡率的影响　
通过MTT 法及流式细胞仪检测发现 ,PC12细胞经
H2O2损伤后细胞存活率明显降低 ,凋亡率增加 ,
甘西鼠尾草注射液与丹参注射液均能提高 PC12
细胞的存活率 ,减少凋亡的发生 , 当浓度达到
125 mg mL 及以上时 ,效果更加明显(P <0.05),
高浓度的甘西鼠尾草注射液在提高存活率 ,降低
凋亡方面要优于等剂量的丹参注射液(P <
0.05),结果见表 1。
表 1　对 PC12 细胞 H2O2 损伤后细胞存活率和凋亡率的影响(x±s , n=3)
组别 药物浓度(mg mL) 细胞存活率(%) 凋亡率(%)
对照组 等容积 95.2±5.7 2.1
模型组 等容积 33.9±3.3b 33.6b
丹参注射液 31.25 37.0±1.6 30.6
丹参注射液 62.5 42.1±2.7 28.3e
丹参注射液 125 49.9±4.4e 26.9e
丹参注射液 250 52.4±2.4e 21.7e
丹参注射液 500 59.8±8.6e 18.2e
鼠尾草注射液 31.25 37.3±6.7 28.1e
鼠尾草注射液 62.5 41.8±6.2 27.4
鼠尾草注射液 125 47.4±5.4e 25.1e
鼠尾草注射液 250 61.0±4.2ei 22.2e
鼠尾草注射液 500 71.2±3.9ei 15.7e
与对照组比较bP<0.05;与模型组比较eP<0.05;与等剂量丹参注射液比较i P<0.05
2.2　甘西鼠尾草注射液和丹参注射液对经 H2O2
处理的PC12细胞 bcl-2和 bax表达的影响　通过
免疫组化检测发现PC12细胞经 H2O 2损伤后凋亡
抑制因子 bcl-2表达降低 ,凋亡促进因子 bax表达
增加 ,即凋亡增加 ,这与流式细胞检测结果相符。
甘西鼠尾草注射液与丹参注射液均能阻遏 H2O2
致PC12细胞凋亡抑制因子 bcl-2表达的降低和凋
亡促进因子 bax 表达的升高 ,进而减少凋亡的发
生 ,当浓度达到 62.5 mg mL 及以上时 ,效果更加
明显(P<0.05), 125 、250 mg mL 的甘西鼠尾草注
射液在降低凋亡促进因子 bax表达方面要优于等
剂量的丹参注射液(P <0.05),结果见表 2。
·1037·中国临床药理学与治疗学 2009 Sep;14(9)
表 2　PC12细胞 H2O2 损伤后 bcl-2和 bax 表达情况(以阳性细胞数计算)(x±s , n=3)
组别 药物浓度(mg mL) bcl-2阳性细胞数 bax阳性细胞数
对照组 等容积 80.3±4.2 56.3±8.8
模型组 等容积 51.6±3.6b 81.5±7.6b
丹参注射液 31.25 51.9±1.8 80.3±4.6
丹参注射液 62.5 62.4±8.0e 76.6±6.9e
丹参注射液 125 69.9±4.2e 77.3±1.4e
丹参注射液 250 68.9±8.4e 71.5±5.8e
丹参注射液 500 72.3±1.7e 65.2±7.9e
鼠尾草注射液 31.25 54.6±9.5 79.6±9.0e
鼠尾草注射液 62.5 59.3±3.9e 76.3±6.8e
鼠尾草注射液 125 63.9±6.5e 70.2±2.7ei
鼠尾草注射液 250 69.7±2.3e 65.3±6.0ei
鼠尾草注射液 500 72.0±5.4e 64.9±4.8e
与对照组比较bP<0.05;与模型组比较eP<0.05;与等剂量丹参注射液比较i P<0.05
3　讨论
PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆化
的细胞株 ,以其易获得性和细胞均一性而成为神
经科学离体研究中的重要工具细胞 ,广泛用于神
经细胞分化 ,离子通道 、受体和递质释放的实验材
料 ,也是研究神经毒性的最重要的细胞株之一 。
在本研究中我们采用 MTT 法和流式细胞仪
检测技术测定了 PC12细胞的存活率与凋亡率 ,发
现细胞经H2O2 损伤后存活率明显降低 ,凋亡率增
加 ,甘西鼠尾草注射液与丹参注射液均能提高
PC12细胞的存活率 ,减少凋亡的发生 ,其中高浓
度的甘西鼠尾草注射液在提高存活率 ,降低凋亡
方面要优于等剂量的丹参注射液。
bcl-2基因为原癌基因 ,目前已发现 5个 bcl-2
基因家族(bcl-2 、bcl-x 、bax 、mcl-1和 A1),其中 bcl-
2可抑制细胞程序性死亡(PCD)。bcl-2的作用机
理可能有:(1)抑制 Ca2+的释放 。bcl-2是一种跨
膜蛋白 ,其主要位于核膜上 ,核内外膜之间由内质
网管腔相连 , 后者是细胞内 Ca2+的主要贮存场
所 ,而 Ca2+在细胞凋亡过程中起重要作用 。应用
转基因方法发现 bcl-2高表达可抑制内质网释放
Ca
2+ ,故推测 bcl-2对细胞凋亡的抑制作用可能与
细胞内质网中 Ca2+有关[ 6-8] 。(2)bcl-2 通过阻止
促凋亡基因信号传递 ,或阻止这些诱导基因产物
而发挥抗细胞凋亡作用。研究表明 bcl-2蛋白可
抑制 P53 、c-fos诱导的细胞凋亡等[ 8-9] 。(3)bcl-2
可通过抑制自由基而发挥抗凋亡作用 , bcl-2具有
抗氧化剂作用 ,它可抑制超氧化物的产生和作用 ,
从而抑制细胞凋亡的发生[ 6, 10] 。bcl-2对细胞的影
响可被称为“bax 的促死亡相对物”所调节 ,bax-bax
同源二聚体可促进细胞死亡 ,而 bcl-2-bax异源二
聚体则抑制细胞死亡 ,bcl-2和 bax 是一对细胞凋
亡的正负调节基因 ,因此 , bcl-2 bax 表达量的比
值 ,对细胞存活与凋亡起着十分重要的作用[ 11] 。
在本实验中 , PC12细胞经 H2O2 损伤后 bcl-2
表达减弱 ,bax表达增加 ,丹参注射液和甘西鼠尾
草注射虽不能完全缓解这种改变 ,但是细胞经两
药处理后 , bcl-2 表达有所增加 , bax 表达有所减
弱 ,提示丹参注射液和甘西鼠尾草注射液对神经
细胞的保护作用可能与增强凋亡抑制因子 bcl-2
表达 、抑制凋亡促进因子 bax 表达 ,进而抑制细胞
凋亡有关 ,相关机制还需要进一步探讨 。
参 考 文 献
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Comparison of protective effects on H2O2-induced PC12 injury from
S.miltiorrhiza Bunge injection and S.przewalskii Maxim injection
LUO Hui-ying1 , CHENG Ti-juan2
1
Department of Pharmacology , GansuCollege of Traditional Chinese Medicine;2Department of Pharmacology , Med-
ical College , Lanzhou University , Lanzhou 730000 , Gansu , China
ABSTRACT　AIM:To compare the influence of S.
miltiorrhiza Bunge injection (SMBI)and S.przewalskii
Maxim injection(SPMI)on H2O2-induced injury in
PC12.METHODS:PC12 cells were cultured in vitro
to compare the protective effects of SMBI and SPMI on
cell injury induced by H2O2 .The survival rate was
measured by MTT method , and the apoptosis rate of
PC12 cells was detected by flow cytometry , the protein
expressions of bcl-2 and bax in PC12 cells were detect-
ed by immunocytochemistry staining method.RE-
SULTS:When PC12 was damaged by H2O2 , the rate
of cell survival was degraded , and the rate of apoptosis
was increased.SMBI and SPMI could alleviate the de-
stroy effectively(P <0.05), they both could strength-
en the expression of bcl-2(P <0.05)and lighten that
of bax(P<0.05).CONCLUSION:The results sug-
gested that SMBI and SPMI had comparable protective
effect on H2O2-induced injury in vitro.The main ef-
fects of both injections were related to strengthening the
expression of bcl-2 and lightening that of bax.
KEYWORDS　S.miltiorrhiza Bunge injection(SM-
BI);S.przewalskii Maxim injection (SPMI);H2O2;
apoptosis;bcl-2;bax
本文编辑:钟正灵
·1039·中国临床药理学与治疗学 2009 Sep;14(9)