全 文 ：先从 DNA 的提取出发，针对供试材料质量参差不
齐的状况，在改良 SDS 法的基础上做了相应调整，
从本实验研究结果来看，无论是电泳检测还是
PCR扩增效果，本方法所提基因组 DNA 都能较好
满足实验要求。虽然试剂盒方法成熟可靠，提取的
DNA纯度也较高，但是由于其价格较贵，提取量
少，而 RAPD对模板的纯度要求不高，因此，从实
际角度出发本实验及后续研究都使用改良的 SDS
法进行提取。
均匀设计是我国数学家王元和方开泰将数论与
多元统计相结合而创造的一种能解决多因素多水平
的全新的试验设计方法，该法与其他的试验设计方
法相比，最大的特点是大大减少了试验次数［15］。
最终优化的 RAPD-PCR 体系为 25 μL 体系中内含
10xTaq reaction Buffer 2 μL、Mg2 + 2. 5 mmol /L，
dNTPs 4. 5 mmol /L，Primer 3. 5 μmol /L，DNA模板
60 ng，Taq 酶 1. 5 U，退火温度为 38. 9 ℃。通过
对不同引物的反复试验，这一反应体系都能显现很
好的扩增效果，为后续的亲缘关系确立及药材鉴别
实验奠定了基础。
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HPLC法同时测定牛膝中 β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1
张留记1，2， 张格艳1， 屠万倩2*
(1． 河南中医学院，河南 郑州 450008;2． 河南省中医药研究院，河南 郑州 450004)
收稿日期:2012-07-12
基金项目:河南省重点科技攻关计划项目资助项目 (102102310018)
作者简介:张留记 (1963—) ，男，研究员，博士，硕士生导师，从事中药质量评价研究。Tel: (0371)66331598，E-mail:zlj6666671
@ yahoo． com． cn
* 通信作者:屠万倩 (1970—) ，女，副研究员，研究方向:中药分析。Tel: (0371)66331718，E-mail:wqtu632@ yahoo． com． cn
摘要:目的 建立同时测定牛膝中 β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1 的高效液相色谱法。方法 Waters SunFire C18色谱柱
(250 mm ×4. 6 mm，5 μm) ，以甲醇-水为流动相，梯度洗脱，体积流量 1. 0 mL /min，柱温 30 ℃，最大吸收波长下检
测 (β-蜕皮甾酮为 250 nm，竹节参皂苷-1 为 240 nm)。结果 β-蜕皮甾酮在 0. 515 ～ 1. 545 μg，竹节参皂苷-1 在 4. 965
～ 14. 895 μg范围内，呈良好的线性关系，相关系数分别为 0. 999 8、0. 999 9;β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1 平均回收率
分别为 99. 17% (RSD为 1. 44%)和 98. 70% (RSD为 1. 03%)。结论 该方法简便、准确、重复性好，可用于牛膝
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的质量控制。
关键词:牛膝;β-蜕皮甾酮;竹节参皂苷-1;定量测定;高效液相色谱法
中图分类号:R284. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2013)05-1010-04
doi:10． 3969 / j． issn． 1001-1528． 2013． 05． 035
Simultaneous determination of β-ecdysterone and chikusetsusaponin-1 in Achy-
ranthes bidentata Bl． by HPLC
ZHANG Liu-ji1，2， ZHANG Ge-yan1， TU Wan-qian2*
(1． Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China;2． Henan Academy of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450004，
China)
KEY WORDS:Achyranthes bidentata;β-ecdysterone;chikusetsusaponin-1;assay;HPLC
牛膝为苋科植物牛膝 Achyranthes bidentata Bl．
的干燥根，性平，味甘苦酸，具有逐瘀通经，补肝
肾，强筋骨，利尿通淋，引血下行等功效［1］，用
于经闭、痛经、腰膝酸痛、筋骨无力、淋症、水
肿、头痛、眩晕、牙痛、口疮、吐血、衄血等症的
治疗［2］。牛膝为常用大宗药材品种，临床应用广
泛，主产于河南焦作地区 (即古怀庆府) ，是河南
主产的道地药材品种 “四大怀药”之一。牛膝的
主要化学成分有多糖类、皂苷类、甾酮类、三萜皂
苷、生物碱类和香豆素类化合物［3-5］。研究表明，
牛膝中的蜕皮甾酮有抑制破骨细胞分化、促成骨样
细胞增殖活性［6］，促进蛋白质合成的作用。牛膝
中的三萜皂苷类成分具有保肝利胆、降血脂、强心
等作用，能明显降低血清中甘油三酯、胆固醇和脂
蛋白的量［7］。因此有必要对牛膝中甾酮类和三萜
皂苷类化合物进行质量控制。
在实验中，从牛膝中提取分离得到皂苷类成分
竹节参皂苷-1 (chikusetsusaponin-1) ，采用高效液
相色谱法同时测定牛膝中竹节参皂苷-1 与 β-蜕皮
甾酮，为更好地控制牛膝药材质量奠定基础。
1 材料
1. 1 仪器 美国 Waters高效液相色谱仪 (2695 溶
剂管理系统，2996 二极管阵列检测器，美国 Wa-
ters柱温箱，Empower Ⅱ工作站) ，Waters SunFire
C18色谱柱 (250 mm × 4. 6 mm，5 μm) ，AE240 十
万分之一分析天平 (瑞士 METTLER 公司) ，LI-
BROR-160DPT万分之一分析天平 (日本岛津)。
1. 2 试剂 甲醇 (德国 Merck． 试剂公司) ，其余
试剂为分析纯，蒸馏水购自郑州市大成蒸馏水厂，
重蒸馏水自制。
1. 3 材料 β-蜕皮甾酮 (β-ecdysterone) (购自中
国药品生物制品检定所，批号:111638-200301，
为含量测定用对照品) ;竹节参皂苷-1 (chikusetsu-
saponin-1) (自制) ，经 UV、IR、1H-NMR、13C-NMR
鉴定结构数据与文献［8］对照一致，高效液相法测
定纯度达 98. 31%;牛膝对照药材 (购自中国药品
生物制品检定所，批号:1006-2002203) ;供试药
材来源见表 1，经河南省中医药研究院都恒青研究
员鉴定均为苋科植物牛膝 A． bidentata Bl． 的干燥
根，凭证标本存放于河南省中医药研究院中药室。
表 1 不同产地的牛膝药材来源
Tab. 1 Samples of Achyranthes bidentata Bl． from different
habitats
编号 产地 药材 等级 采集年月 凭证标本号
1 武陟大封乡东唐郭 牛膝 一等 201001 201001001
2 武陟大封乡东唐郭 牛膝 二等 201001 201001002
3 武陟大封乡架部三村 牛膝 一等 201001 201001003
4 武陟大封乡架部三村 牛膝 二等 201001 201001004
5 武陟大封乡架部三村 牛膝 四等 201001 201001005
6 温县赵堡乡南平皋 牛膝 二等 201001 201001006
7 温县赵堡乡南平皋 牛膝 三等 201001 201001007
8 温县赵堡乡北平皋 牛膝 二等 201001 201001008
9 温县赵堡乡北平皋 牛膝 三等 201001 201001009
10 博爱孝敬镇小岩村 半野生牛膝 不分 201001 201001010
11 中国药品生物制品检定所 对照药材 201001
12 武陟大封乡架部四村 牛膝 二等 201011 201011001
13 武陟大封乡架部三村 牛膝 二等 201011 201011002
14 武陟大封乡东唐郭 牛膝 二等 201011 201011003
15 温县赵堡乡北平皋 牛膝 二等 201011 201011004
16 温县赵堡乡南平皋 牛膝 二等 201011 201011005
17 温县南张羌朱家庄 牛膝 二等 201011 201011006
18 河北安国市深泽 牛膝 一等 201011 201011007
19 河北安国市郑章 牛膝 三等 201011 201011009
20 内蒙古赤峰市 牛膝 三等 201011 201011010
21 安徽亳州 牛膝 四等 201011 201011011
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2 方法与结果
2. 1 色谱条件 Waters SunFire C18色谱柱 (250
mm ×4. 6 mm，5 μm) ;流动相为甲醇-水，梯度洗
脱，梯度洗脱程序见表 2，柱温 30 ℃;体积流量
1. 0 mL /min;β-蜕皮甾酮检测波长 250 nm，竹节
参皂苷-1 240 nm;进样量 20 μL。在此条件下，β-
蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1 色谱峰与相邻成分可达
基线分离，见图 1。
表 2 梯度洗脱时间程序
Tab. 2 Mobile phase in gradient elution
时间 /min 甲醇 /% 水 /%
0 ～ 20 38 62
20 ～ 35 38→80 62→20
35 ～ 44 80 20
44 ～ 45 80→38 20→62
A． 对照品 B． 供试品 1． β-蜕皮甾酮 2． 竹节参皂苷-1
A． reference substances B． sample 1． β-ecdysterone 2． chiku-
setsusaponin-1
图 1 β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1 高效液相图谱
Fig. 1 HPLC chromatograms of β-ecdysterone and
chikusetsusaponin-1
2. 2 供试品溶液的制备 取牛膝粉末 (过四号
筛)约 1 g，精密称定，置具塞三角瓶中，加甲醇
50 mL，密塞，称定质量，浸泡 2 h，超声处理 30
min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失
的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液 25 mL，回
收溶剂并浓缩至干，残渣加甲醇溶解，移至 5 mL
量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2. 3 对照品溶液的制备 精密称取 β-蜕皮甾酮、
竹节参皂苷-1 对照品适量，加甲醇制成每 1 mL 分
别含 β-蜕皮甾酮 0. 051 5 mg、竹节参皂苷-1
0. 496 5 mg的混合溶液，作为对照品溶液。
2. 4 线性关系考察 精密吸取 2. 3 项下的对照品
溶液 10、15、20、25、30 μL，分别注入液相色谱
仪，测定 β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1 吸收峰峰面
积积分值，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，
得回归方程，β-蜕皮甾酮 Y = 2. 075 × 106X － 2. 010
× 104，r = 0. 999 8;竹节参皂苷-1 Y = 2. 075 3 ×
105X － 1. 400 × 104，r = 0. 999 9。结果表明，β-蜕
皮甾酮在 0. 515 ～ 1. 545 μg，竹节参皂苷-1 在
4. 965 ～ 14. 895 μg范围内呈良好的线性关系。
2. 5 精密度试验 吸取同一供试品溶液 20 μL，
注入高效液相色谱仪，重复进样 6 次，测定 β-蜕
皮甾酮和竹节参皂苷-1 的峰面积并计算 RSD 值，
结果 β-蜕皮甾酮的平均峰面积 RSD 值为 1. 38%，
竹节参皂苷-1 的平均峰面积 RSD 值为 1. 69%。结
果表明，本方法精密度较好。
2. 6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于 0、
2、4、6、8、10 h 注入液相色谱仪，测得 β-蜕皮
甾酮的平均峰面积 RSD值为 1. 88%，竹节参皂苷-
1 的平均峰面积 RSD 值为 1. 11%，表明供试品溶
液在 10 h内稳定性较好。
2. 7 重复性试验 取同一批牛膝药材，平行制备
6 份供试品溶液，测得 β-蜕皮甾酮的平均质量分数
为 0. 575 mg /g (RSD = 1. 39%) ，竹节参皂苷-1 的
平均质量分数为 4. 807 mg /g (RSD = 1. 14%) ，表
明该方法重复性较好。
2. 8 加样回收率试验 取已测定的牛膝样品 (β-
蜕皮 甾 酮 0. 575 mg /g，竹 节 参 皂 苷-1 4. 807
mg /g) ，取约 0. 5 g，精密称定，置具塞三角瓶中，
分别精密加入 β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1 对照品
混合甲醇溶液 (β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1 质量
浓度分别为 5. 6 μg /mL 和 50. 4 μg /mL)50 mL，
以下按 2. 2 项下操作，平行操作，制得 6 份加样供
试品溶液。精密吸取加样供试品溶液 20 μL，注入
液相色谱仪，测定 β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1 的
量，计算加样回收率，结果见表 3。
2. 9 样品测定 取不同产地牛膝样品，按 2. 2 项
下方法操作，制备供试品溶液，分别测定药材中
β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1 的量，结果见表 4。
3 讨论
3. 1 样品处理方法的选择 根据 β-蜕皮甾酮和竹
节参皂苷-1 的理化性质，对不同提取溶剂 (甲醇、
水饱和正丁醇、95%乙醇等)、不同提取方式 (加
热回流、超声处理、索氏提取等)、不同浸泡时间
和提取时间等进行了考察和比较，确定了供试品溶
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表 3 β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1 加样回收率测定结果
Tab. 3 Results of recovery tests of β-ecdysterone and
chikusetsusaponin-1
成分
称样量
/ g
原有量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
RSD
/%
β-蜕皮 0. 500 8 0. 288 0. 280 0. 563 98. 21 1. 44
甾酮 0. 502 1 0. 289 0. 280 0. 572 101. 07
0. 502 5 0. 289 0. 280 0. 567 99. 29
0. 501 3 0. 288 0. 280 0. 569 100. 36
0. 499 7 0. 287 0. 280 0. 559 97. 14
0. 501 6 0. 288 0. 280 0. 565 98. 93
竹节参 0. 500 8 2. 407 2. 520 4. 893 98. 65 1. 03
皂苷-1 0. 502 1 2. 414 2. 520 4. 879 97. 82
0. 502 5 2. 416 2. 520 4. 948 100. 48
0. 501 3 2. 410 2. 520 4. 891 98. 45
0. 499 7 2. 402 2. 520 4. 864 97. 70
0. 501 6 2. 411 2. 520 4. 909 99. 13
表 4 不同产地牛膝药材 β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1 测定
结果
Tab. 4 Determination results of β-ecdysterone and chiku-
setsusaponin-1 in samples from different habitats
编号
β-蜕皮甾酮
/(mg·g － 1)
竹节参皂苷-1
/(mg·g － 1)编号
β-蜕皮甾酮
/(mg·g － 1)
竹节参皂苷-1
/(mg·g － 1)
1 0. 582 4. 686 12 0. 645 5. 882
2 0. 593 4. 911 13 0. 697 6. 080
3 0. 587 4. 879 14 0. 738 6. 131
4 0. 584 5. 035 15 0. 632 5. 666
5 0. 575 4. 807 16 0. 594 4. 948
6 0. 606 4. 995 17 0. 474 3. 353
7 0. 580 6. 121 18 0. 498 3. 844
8 0. 610 5. 053 19 0. 475 3. 806
9 0. 666 5. 994 20 0. 523 4. 140
10 0. 619 5. 439 21 0. 441 3. 970
11 0. 618 5. 369
液的制备方法为:取牛膝粉末 1 g，加入甲醇 50
mL，浸泡 2 h，超声处理 30 min，β-蜕皮甾酮和竹
节参皂苷-1 提取率最高。
3. 2 色谱条件的选择 牛膝中 β-蜕皮甾酮和竹节
参皂苷-1 化学结构和极性差异较大，难以采用固
定的流动相同时测定，在实验中先后比较了乙腈-
1%乙酸溶液、乙腈-0. 4%磷酸溶液、乙腈-水、甲
醇-0. 4%磷酸溶液和甲醇-水等多种色谱系统和梯
度洗脱程序，结果采用甲醇-水系统，按本实验选
定的时间程序洗脱，β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1
色谱峰出峰时间适宜，与相邻峰的分离度较好，且
峰形对称。
3. 3 检测波长的选择 分别对 β-蜕皮甾酮和竹节
参皂苷-1 色谱峰进行吸收光谱扫描，结果 β-蜕皮
甾酮在 250 nm 处有最大吸收，与 《中国药典》
2010 年版一部牛膝药材 β-蜕皮甾酮含量测定项下
的测定波长基本一致，竹节参皂苷-1 在 240 nm 有
强吸收。因此选择 0 ～ 30 min 250 nm和 30 ～ 45 min
240 nm分别作为 β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1 的检
测波长。采用 Waters Empower Ⅱ 色谱工作站的定
时波长功能，以 30 min 为检测波长转换点，检测
波长由 250 nm 变为 240 nm，在同一色谱条件下同
时检测牛膝中 β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1，提高检
测的灵敏度和准确性。此法不仅可以用于二极管阵
列检测器，也可用于普通的多波长紫外检测器，具
有普遍适用性，方便快速。
3. 4 小结 实验结果表明，21 个不同产地牛膝样
品中 β-蜕皮甾酮的量均符合 《中国药典》2010 年
版一部中牛膝药材项下 β-蜕皮甾酮含有量不得低
于 0. 030%的有关规定［1］。对不同产地的牛膝药材
成分含有量进行比较，结果河南焦作地区武陟、博
爱、沁阳、温县等地 (古怀庆府)所产怀牛膝中
蜕皮甾酮的量较高，不同产地的牛膝中竹节参皂苷
-1 量存在一定差异。β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1
分别为牛膝中的甾酮类和皂苷类有效成分，且竹节
参皂苷-1 的量明显高于 β-蜕皮甾酮，仅以 β-蜕皮
甾酮为定量指标对牛膝的质量控制，不能准确评价
药材的内在质量。本法采用高效液相色谱法同时测
定牛膝中 β-蜕皮甾酮和竹节参皂苷-1 的含量，方
法简便、快捷、重现性好，可更科学、更全面地进
行牛膝药材的质量评价。
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