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(收稿日期　2003-05-15)
紫花地丁水煎剂调节小鼠免疫细胞功能的体外研究
赵　红1 　顾定伟2　张淑杰1 　马立人1
1.华北煤炭医学院生物科学系 (河北唐山 063000)　2.华北煤炭医学院附属医院骨外科
提要:目的:通过研究紫花地丁 (Viola yedoensis Makino)水煎剂体外对 C57小鼠脾淋巴细
胞转化试验和腹腔巨噬细胞的吞噬功能的影响 , 探讨紫花地丁的免疫调节功能 , 寻求一种更适宜
的免疫调节剂。方法:3H —TdR掺入法测定不同浓度的紫花地丁对小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细
胞的毒性作用;MTT 方法检测小鼠脾淋巴细胞转化试验和腹腔巨噬细胞的吞噬功能。结果:紫花
地丁水煎剂在 0.2 ～ 1.6mg/ml浓度时 , 能抑制正常小鼠被 LPS诱导的脾淋巴细胞增殖活性 , 但未
见到对 ConA诱导的脾淋巴细胞增殖活性及对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能有明显影响 。结论:紫
花地丁水煎剂通过抑制小鼠由 LPS诱导的 B淋巴细胞的增殖 , 下调抗体的生成 , 但对小鼠细胞免
疫功能无明显影响。
关键词:紫花地丁　脾淋巴细胞　巨噬细胞
　　紫花地丁 (Viola yedoensis Makino)属堇菜属 , 味苦
性寒 , 药用历史悠久 , 具有清热解毒 、 消肿散结等功效。
常用于治疗疔疮热毒 , 痈肿发背及各种化脓性感染。 有文
献报道紫花地丁治疗腮腺炎[ 1]及以紫花地丁 、 金银花为主
药的方剂治疗慢性盆腔炎[ 2] 、 肝炎[ 3]等病原体感染性疾病
和自身免疫性不孕[ 4] 、 过敏性紫癜性肾炎[ 5]等自身免疫相
关性疾病均优于西医疗法 , 但对其药理学机制尚无报道。
笔者认为祖国医学博大精深 , 但亦存在发展与创新问题。
利用现代医学与祖国医学相结合 , 探讨中药及其新成分的
药理学机制 , 有助于中药的开发和利用。本文旨在探讨紫
花地丁的免疫学机制 , 寻求一种更优的免疫调节剂。
1　材料和方法
1.1 　主要试剂 　细菌脂多糖 (LPS), 刀豆蛋白 A
(ConA), MTT , 硫代乙醇酸钠肉汤均为 Sigma 公司产品。
RPMI-1640 培养液 、 细胞裂解液 、 0.075%中性红溶液 、
PH7.2的 PBS 、 96 孔培养板 、 酶标仪 、 二氧化碳孵箱等均
由我院生物科学系实验中心细胞免疫室提供。
1.2　药材　紫花地丁产于河北 , 经药材公司鉴定为堇菜属
植物紫花地丁的干燥全草 , 常规方法[ 6] 3 次水煎混合液浓
缩至 1g/ml , 离心 2000 转/分 , 10 分钟。取上清液60Co 照
射灭菌。
1.3　实验动物　C57 小鼠 6 ～ 8W , 体重 18 ～ 22g , 购自北
京医科大学动物中心。
1.4　实验方法　
1.4.1　紫花地丁对小鼠脾淋巴细胞及腹腔巨噬细胞毒性试
验　①以常规方法取其小鼠脾脏制备小鼠脾细胞悬液 , 调
整细胞浓度为 5×106 个/ml。将新分离的小鼠脾淋巴细胞
加入 96孔培养板 100μl/孔 , 然后加入等量的含不同浓度紫
花地丁的 RPMI-1640 培养液 , 每个样品设三个平行孔并
设阴性对照孔 (只加 RPMI-1640 培养液), 置 37℃5%
四　川　中　医 2003 年第 21 卷第 9 期
18　 Journal of Sichuan of T raditional Chinese Medicine Vol.21 , No.9 , 2003
CO2 孵箱中培养 24h , 参照文献[ 7]按常规3H-TdR掺入法 ,
用β-液体闪烁计数仪测量每分钟脉冲数 (cpm 值)。 ②诱
导小鼠腹腔巨噬细胞:试验前三天给小鼠腹腔注射 3%硫
代乙醇酸钠肉汤 1ml/只 , 诱导腹腔巨噬细胞。 试验当天 ,
以无菌操作取小鼠腹腔液 , 用 RPMI-1640 培养液制备小
鼠腹腔巨噬细胞悬液 (浓度为 1×106 个/ ml)。上述方法进
行紫花地丁的 24 小时毒性实验。
1.4.2　脾淋巴细胞转化试验　将新分离的浓度为 5×106 个/
ml的小鼠脾淋巴细胞悬液加入 96孔培养板 100μl/孔, 然后加
入含不同浓度紫花地丁的 RPMI-1640培养液 100μl/每孔 , 按
设计 (分三组:A 组仅加紫花地丁;B组 LPS+紫花地丁;C
组ConA+紫花地丁), LPS 的终浓度为 10μg/ml , ConA的终浓
度为 5μg/ml , 每个样品设三个平行孔并设对照孔 (A组仅加
1640 培养液;B组 LPS+1640培养液;C 组 ConA+1640培养
液), 置37℃5%CO2孵箱中培养 72h , 培养结束前 4小时每孔
加入 10μlMTT , 培养结束后加细胞裂解液, 参照文献[ 8] , 酶
标仪读取 570nm 处OD值。
1.4.3　小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定　小鼠腹腔巨噬
细胞用 RPMI —1640 调浓度至 1×106 个/ml , 加入 96 孔培
养板 100μl/孔 , 再于各孔分别加入含有不同浓度的紫花地
丁的 1640 培养液 100μl/孔 , 每个样品设三个平行孔并设对
照孔 (仅加 1640 培养液), 培养 24h 后弃上清液 , 每孔加
入 0.075%的中性红生理盐水溶液 50μl , 37℃保温 1h , 弃
掉中性红溶液 , 用预温 PBS 洗 2 ～ 3 次 , 然后每孔加细胞
裂解液 150μl (0.1M 的冰醋酸与无水乙醇等体积混合液)
静置 , 参照文献[ 9] 。待细胞完全溶解后 , 用酶标仪读取
570nm 处 OD值。
1.5　统计学处理　实验结果以均数±标准差 (′x±s)表
示 , 实验数据的 t检验及直线相关回归方程用 S TATA 软件
处理。
2　结　果
2.1　紫花地丁的细胞毒性分析　紫花地丁在 0mg/ ml ～
102.4mg/ ml范围内的 12个浓度对小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬
细胞进行了细胞毒性试验 , 结果显示紫花地丁在 6.4mg/ ml以
下对小鼠脾淋巴细胞无毒性 , 且在 3.2mg/ ml对细胞有一保护
作用;在 3.2mg/ ml以下对小鼠腹腔巨噬细胞无毒性, 且在
1.6mg/ ml对细胞有一保护作用。见表 1。
表 1　紫花地丁对小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的
细胞毒性试验结果 (′x±s)
FS 浓度
(mg/ml)
Lymphocyte
(cpm 值)
Macrophage
(cpm 值)
0.0 167.05±10.36 169.90±49.29
0.05 196.03±31.21 145.57±46.95
0.1 191.47±41.22 147.20±28.75
0.2 225.23±38.74 153.17±32.30
0.4 218.91±39.29 218.03±47.86
0.8 193.90±25.33 212.60±76.90
1.6 230.50±21.02 357.87±68.76＊
3.2 366.40±26.51＊＊ 169.20±90.67
6.4 103.67±34.87 86.60±39.18＊＊
12.8 76.83±27.93＊ 67.57±20.58＊
25.6 71.03±26.81＊ 50.93±6.31＊
51.2 79.60±29.43＊＊ 40.03±5.89＊
102.4 49.63±11.93＊＊ 58.33±18.10＊
　　注:经 t检验 , 与阴性对照组比 , ＊P<0.05 , ＊＊P
<0.01
2.2　紫花地丁对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响分析　紫
花地丁在 0.2 ～ 1.6mg/ml浓度范围可下调由 LPS 诱导的脾
淋巴细胞增殖;紫花地丁单独作用以及与 ConA 协同作用
诱导的脾淋巴细胞增殖活性未见明显影响。结果见表 2。
表 2　紫花地丁影响小鼠脾淋巴细胞增殖活性的测定
结果 (′x±s)
FS浓度
(mg/ml)
A组
OD 值
B组
OD值
C组
OD值
0.0 0.1550±0.0129 0.4380±0.0148 0.3880±0.0687
0.2 0.1400±0.0707 0.4000±0.0010＊＊ 0.3807±0.0252
0.4 0.1550±0.0495 0.3733±0.0208＊＊ 0.4067±0.0351
0.5 0.1700±0.0418 0.4000±0.0173＊ 0.3700±0.0200
0.8 0.1700±0.1414 0.3833±0.0289＊ 0.4267±0.0321
1.6 0.1350±0.0070 0.3400±0.0265＊＊ 0.3967±0.0651
3.2 0.1725±0.0001 0.4333±0.0378 0.3433±0.0115
　　注:A 组:紫花地丁;B 组:紫花地丁+Lps;C 组:紫花
地丁+ConA。经 t检验, 与对照组比＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
2.3　紫花地丁对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响分析　
紫花地丁在 0.1 ～ 6.4mg/ ml范围内对小鼠腹腔巨噬细胞的
吞噬功能未见明显影响。结果见表 3。
表 3　紫花地丁影响小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定
结果 (′x±s)
FS concentration
(mg/ml)
phagocy tosis of M Υ
(OD570 值)
0.0 0.2733±0.0057
0.1 0.2667±0.0289
0.2 0.2633±0.0493
0.4 0.2567±0.0306
0.8 0.2867±0.0404
1.6 0.2800±0.0346
3.2 0.2467±0.0252
6.4 0.2746±0.1300
　　注:经 t检验 , 与阴性对照组比 , P>0.05
3　讨　论
免疫学理论认为 , 免疫自稳 、 免疫监视 、 免疫防御是
免疫的三大基本功能。免疫自稳是机体免疫系统维持内环
境相对稳定的一种生理功能 , 若该功能失调时 , 可发生生
理功能紊乱或自身免疫性疾病。机体正常免疫功能依赖于
各种正常功能的免疫细胞及细胞之间的相互作用。其中 T 、
B淋巴细胞又称为免疫活性淋巴细胞 , 主要定居于脾脏和
2003 年第 21 卷第 9 期 四　川　中　医
Vol.21 , No.9 , 2003 Journal of Sichuan of T raditional Chinese Medicine 19　
淋巴结等外周淋巴器官中 , 是特异性免疫应答的基础。而
单核-巨噬细胞更是具有非特异吞噬 、 参与细胞免疫 、 抗
肿瘤 、 免疫调节等多种功能。我们的实验表明 , 紫花地丁
在一定范围内抑制 LPS 诱导的脾淋巴细胞增殖 , 但对
ConA 诱导的脾淋巴细胞增殖活性及对巨噬细胞的吞噬功能
未见明显影响。由此推断 , 一方面临床报道的紫花地丁抵
抗病原体感染作用[ 1] [ 2] [ 3]可能并不是通过直接辅助 T 、 B
淋巴细胞和巨噬细胞活化。由于 《本草正义》 誉紫花地丁
为痈肿疔毒通用之药 , 推测其抗感染作用可能与其减缓炎
症的进程相关 , 需要进一步研究。 另一方面 , LPS 为 B 细
胞的有丝分裂原 , 特异性地诱导 B 细胞的增殖与分化 ,
ConA 为 T 细胞的有丝分裂原 , 特意性地诱导 T 细胞的增
殖与分化。实验结果表明了紫花地丁通过抑制 LPS 诱导的
B 淋巴细胞增殖而抑制抗原诱导的体液免疫应答 , 即下调
抗体的生成 , 提示临床报道的紫花地丁及其为主的方剂治
疗自身免疫性不育[ 4] 、 过敏性紫癜性肾炎[ 5]等自身免疫相
关性疾病是通过下调自身抗原诱导其自身抗体的生成实现
的。同时 , 实验结果显示紫花地丁对 ConA 诱导的 T 淋巴
细胞增殖活性以及对巨噬细胞的吞噬功能未见明显影响 ,
提示紫花地丁下调抗体产生的同时并没有减弱细胞免疫动
能 , 即机体对病毒感染和肿瘤免疫的保护作用。
综上所述 , 本试验结果提示紫花地丁具有下调小鼠体
液免疫功能的能力 , 但对细胞免疫功能无明显影响。 这种
选择性的免疫调节作用做为免疫抑制剂较环磷酰胺等目前
常用免疫抑制剂具有明显优越性。但免疫功能是免疫细胞
之间通过直接作用或分泌细胞因子相互作用的复杂过程。
紫花地丁作为免疫调节剂还需在细胞因子水平进一步研究。
另外本试验所用紫花地丁水煎剂成分复杂 , 开发其新成分 ,
探讨每种成分对免疫功能的影响作用等方面都有大量工作 。
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(收稿日期　2003-05-16)
＊本论文为四川省中医药管理局课题———“肾虚证”模鼠孕后服五子衍宗丸胎产研究课题的一部分(课题编号:2000—72)
一种妊娠肾虚鼠造模方法研究＊
陈淑涛1　刘凤琳1 　王米渠2
1.四川省中医药研究院(成都 610041)　2.成都中医药大学
提要:根据中医学“恐伤肾”的基本原理 ,利用鼠的自然天敌猫恐吓老鼠的方法 ,造成母鼠肾虚病
证 ,观察妊娠肾虚证的相关指标 ,借助反证来探索造模方法的可行性 。
关键词:妊娠肾虚证　恐伤肾　造模
　　肾主生殖 , 在女性“肾—天癸—冲任—胞宫”生
殖轴中 ,肾占主导位置 ,而肾多虚证 , 尤其是妊娠肾
虚证 ,在临床上可以出现胎漏 、胎动不安 、坠胎、小
产、滑胎、胎萎不长等临床病证。中医辨证论治具有
疗效好、副作用小等优势 ,但病证与方药疗效机理不
清。所以 ,为了促进中医现代化发展 ,必须借助现代
医学的一些理化指标来阐释该证的发病机理 , 而再
现该病证的动物模型则是面临的一大问题。故我们
根据中医基本理论“恐伤肾”的原理 , 利用猫是老鼠
的天敌这一自然规律 ,采用猫吓老鼠的方法 ,造成母
鼠肾虚证 ,再通过对子鼠的生理生化检测 , 来反证用
猫吓鼠造成肾虚证模鼠的造模方法的可行性。
1　对象和方法
1.1　对象　实验选用C57BL/6J种鼠 75日龄 ,特别测
试用铁丝饲养笼 ,种鼠及标准饮食由卫生部成都生物
制品研究所动物中心提供。家猫为市售捕鼠型。
1.2　方法　实验造模用成年雌鼠60只 ,雄鼠30只 ,以
雌雄2∶1交配后取出母鼠 ,随机分为惊恐处理组(简称
四　川　中　医 2003 年第 21 卷第 9 期
20　 Journal of Sichuan of T raditional Chinese Medicine Vol.21 , No.9 , 2003