全 文 ：型组大鼠血清 E2 含量显著增加，P含量显著降低( P ＜ 0． 01) ;与
模型组比较，隔药灸组、针刺组及药物组 E2 显著降低，P 显著增
加( P ＜ 0． 01) ;与药物组比较，隔药灸组及针刺组 E2 显著降低，
P显著增加( P ＜ 0． 01) ;与针刺组比较，隔药灸组 E2 显著降低，P
显著增加( P ＜ 0． 01) 。故隔药灸组疗效最为理想。
表 2 各组大鼠血清 E2 及 P的比较( 珋x ± s) pg·ml －1
组别 E2 P
空白对照组 26． 81 ± 3． 85 8． 72 ± 0． 52
隔药灸组 43． 64 ± 5． 69▲△◆■ 7． 05 ± 0． 72▲△◆■
针刺组 47． 96 ± 5． 54▲△◆ 5． 80 ± 0． 53▲△◆
药物组 58． 74 ± 4． 19▲△ 4． 28 ± 0． 60▲△
模型组 68． 59 ± 5． 95▲ 3． 26 ± 0． 71▲
和空白对照组比较，▲P ＜ 0． 01;和模型组比较，△P ＜ 0． 01; 和药物组
比较，◆P ＜ 0． 01;和针刺组比较，■P ＜ 0． 01; n = 20
3 讨论
祖国医学认为原发性痛经的病机主要是寒凝胞宫，气血运行
不畅，瘀阻冲任，导致“不通则痛”以及气血不足引发“不荣则
痛”。现代医学认为，痛经的发生与月经周期中激素变化，尤其
是与前列腺素( prostaglandin，PG) 变化有关［2］。E2、P在痛经的病
因上起一定作用。有研究表明［3］，E2 的增高促进 PG的合成与释
放而致血管平滑肌痉挛，此作用能被 P所拮抗，P可促进 E2 转化
为无活性的雌酮，P的升高缓解子宫平滑肌痉挛，舒缓血管收缩，
促进血液循环及镇痛物质的合成与释放。现代药理学研究已证
实［4］，益母草对子宫具有较广泛的药理作用。通过抑制痉挛的
子宫活动，减低子宫平滑肌前列腺素的含量及升高体内 P等多种
途径缓解痛经症状。在本实验中观察到隔药灸、针刺以及益母草
膏均能使痛经大鼠血清 E2 含量减少，而 P含量增加。因此，笔者
认为在卵巢水平，隔药灸发挥调节作用，通过提高 P 的含量而使
其与 E2 重新恢复平衡。
命门穴出自《针灸甲乙经》: “命门，……督气所发。”命，人之
根本也，气也。门，出入之气户也。《经穴释义汇解》: “穴在第十
四椎节下间。当肾中间，为精道所出，是生之门，死之门，喻穴处
关乎生命之门，故名命门。”命门在女子紧密联系着胞宫，对生殖
功能有重要影响;命门内含有真阳( 真火) 、真阴( 真水) ，五脏六
腑以及整个人体的生命活动都由它激发和主持。灸命门穴可以
振奋督脉阳气，温通经脉。理中汤出自张仲景《伤寒论》，由人
参、干姜、白术、炙甘草组成。方中以辛热之干姜为君，温中焦脾
胃而祛里寒;人参大补元气，助运化而正升降，为臣药，补气益脾;
白术健脾燥湿，炙甘草益气和中补土，诸药配合，中焦之寒得辛热
而去，中焦之虚得甘温而复，清阳升而浊阴降，运化健而中焦治，
故曰“理中”。阳气得温，经脉得通，“通则不痛”。隔药饼灸的方
法燃烧时产生的近红外线有较强的穿透力［5］，能充分发挥艾绒
的药物和火热的温通作用，很好地将药物的作用输送到人体内
部，使局部的毛细血管扩张，从而对盆腔脏器产生热效应，以解除
紧张，减少子宫的收缩，使局部循环得以改善，并激发人体脏腑经
络的功能，调整机体阴阳气血的运行，以起温经散寒、化瘀止痛之
效。
本次研究表明，与痛经模型大鼠相比，隔药灸组、针刺组以及
益母草膏组均能不同程度地使痛经大鼠血清 E2 含量减少，P 含
量增加，其中隔药灸的调节作用最佳。提示隔药灸治疗原发性痛
经有较好的作用，有进一步研究的价值，并可推广于临床。
参考文献:
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收稿日期: 2013-01-07; 修订日期: 2013-05-28
基金项目:国家自然科学基金( No． 81001700) ;四川省教育厅青年基金项目( No． 11ZB227) ;四川省科技厅应用基础计划( No． 2012JY0081)
作者简介:毛樱逾( 1974-) ，女( 汉族) ，四川攀枝花人，现任泸州医学院副教授，硕士学位，主要从事药用植物基因工程研究工作．
* 通讯作者简介:张 春( 1983-) ，女( 汉族) ，四川自贡人，现任泸州医学院副教授，博士学位，主要从事药用植物分子鉴定及分子生药学研究工作．
低温切片破碎紫花地丁根组织提取 ＲNA的研究
毛樱逾，罗 波，罗 茂，段素群，张 春*
( 泸州医学院，四川 泸州 646000)
摘要:目的 通过比较液氮研磨法和低温切片法破碎紫花地丁根组织来提取 ＲNA的效果，以获得提取药用植物紫花地丁
根 ＲNA的最佳方法。方法 用液氮研磨法和低温切片法破碎紫花地丁根组织，然后提取 ＲNA。通过 ＲNA 浓度、纯度及
完整性的检测，以及扩增 GAPDH基因来比较两种方法的效果。结果 液氮研磨法和低温切片法提取的 ＲNA 浓度分别为
1． 21，3． 57μg /μl。琼脂糖凝胶电泳检测可见两条明显的条带。28S rＲNA 与 18S rＲNA 条带亮度之比大于 1。GAPDH 基
因的 PCＲ扩增在约 230 bp处有与预期长度一致的明亮条带。结论 低温切片法破碎植物根组织能达到液氮研磨法的效
果，是提取 ＲNA时，破碎植物根组织的一种成本低，效果好，快速简便的方法。
关键词:低温切片; ＲNA提取; 紫花地丁根
DOI标识: doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 11． 106
中图分类号: Ｒ2 －03 文献标识码: A 文章编号: 1008-0805( 2013) 11-2816-03
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时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 11 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 11
Ｒesearch the effective and simple Methods for Breaking the root of the Herb Violae to Ex-
tract ＲNA
MAO Ying-yu，LUO Bo，LUO Mao，DUAN Su-qun，ZHANG Chun*
( Luzhou Medical College ，Luzhou Sichuan，646000，China)
Abstract: Objective Comparing liquid nitrogen grinding method with frozen section method for breaking the root of the herb Vio-
lae to extract ＲNA，to demonstrate that frozen section is a simple and effective mathod．Methods Broke the root of the Herb Violae
by liquid nitrogen grinding method and frozen section method，and extracted ＲNA． Concentration，purity and integrity of ＲNA were
detected． The GAPDH gene was amplified by ＲT － PCＲ． Ｒesults The ＲNA concentration was 1． 21μg /μl and 3． 57μg /μl，extrac-
ted by liquid nitrogen grinding method and frozen section method respectively． Two distinct bands were showed by agarose gel elec-
trophoresis． The ratio of brightness of the 28S rＲNA and the 18S rＲNA bands was greater than 1． The length of GAPDH gene was
230 bp． Conclusion The experimental results indicated that frozen section method to break the root of the Herb Violae can meet
the needs of most molecular biological experiments including gene cloning and expression analysis． It is an effective and simple
method for extract ＲNA of from the plant root．
Key words: Freezing microtome; ＲNA extracting; The root of the Herb Violae
紫花地丁 Viola yedoensis Makino系堇菜科堇菜属多年生宿根
草本植物，又称光瓣堇菜，为常用中草药。其性寒，味苦、辛，有清
热解毒、凉血消肿之功效，用于疔疮肿毒，痈疽发背，丹毒，毒蛇咬
伤［1］。为研究其药用功能基因，提取纯度高、完整性好的 ＲNA是
进行后续研究的必要前提和关键。完整的细胞中，内源 Ｒnase不
会降解 ＲNA。但是，提取 ＲNA 时，在破碎细胞后，内源性 Ｒnase
就会迅速降解 ＲNA。因此，如何在抑制 Ｒnase活性前提下充分破
碎细胞成为提取高质量 ＲNA的关键所在［2］。
目前，广泛采用的组织破碎方法是液氮研磨法。然而，由于
紫花地丁根组织纤维含量丰富，韧性较大，对许多实验人员来说，
要顺利破碎植物根组织，提取到高质量的 ＲNA 比较困难。本课
题组在实验中，采用低温切片来破碎紫花地丁根组织，提取
ＲNA，实验操作简单，获得了较为满意的结果。
本文用低温切片法和液氮研磨法破碎紫花地丁根组织，然后
提取 ＲNA，并进行 ＲT － PCＲ，扩增甘油醛 － 3 － 磷酸 － 脱氢酶
( glyceraldehyde － 3 － phosphate dehydrogenase，GAPDH) 基因，探讨
低温切片法在实验工作中的可行性。
1 材料和方法
1． 1 仪器和试剂 ND － 1000 微量紫外可见分光光度计 ( 美国
NanoDrop ) ，Leica CM1900 冰冻切片机( 德国 Leica) ，PowerPac U-
niversal 电泳仪( 美国 BIO － ＲAD) ，市售合成胶水，全自动凝胶成
像系统 GelDocXＲ + ( 美国 BIO － ＲAD ) ，Ep 管及取液器枪头( 美
国 axygen) ，ＲNAprep pure Plant Kit抽提试剂盒( 北京天根) 、First
Strand cDNA Synthesis Kit( TOYOBO 公司) ，DNA marker ( 北京天
根) ，2 × Taq PCＲ MasterMix( 北京博迈德) 。
1． 2 Ｒnase的灭除 研钵、剪刀、镊子等所需器具，经 0． 1% DEPC
H2O浸泡 24 h，再经 121℃高压灭菌 30 min、70℃烘干备用。
1． 3 引物的设计与合成 根据 GenBank 上公布堇菜科植物同源
序列比对，设计 GAPDH 基因引物，利用软件 primer premier 5． 0
设计引物。上游引物: 5＇－ TGGAGCAGAGTATGTTGTGG － 3＇，下游
引物: 5＇－ GAGGTAATGACGATGGGTTT － 3 ＇; 所扩增的目的片段
长度约为 238 bp，引物合成由上海 Invitrogen生物工程公司完成。
1． 4 紫花地丁根组织取材 采集生长旺盛的紫花地丁，经泸州医
学院税丕先教授鉴定，栽种于泸州医学院药用植物园内。操作人
员戴上口罩和手套，从盆土中挖出紫花地丁根，用自来水快速冲
净盆土，然后用蒸馏水冲洗干净，最后用 DEPC水冲洗，选取颜色
较浅的嫩根，用剪刀剪成长约 3 mm 左右的小段，放入做好标记
的 1． 5 ml冻存管中，立即置液氮中速冻。
1． 5 ＲNA提取 将速冻的紫花地丁根分成两组，分别为液氮研
磨法组和低温切片法组，两组都各自提取 ＲNA，提取方法如下。
1． 5． 1 液氮研磨法 在碾钵中加入适量的液氮，再将紫花地丁根
从液氮中取出迅速放入碾钵中，并迅速碾磨。此过程中要及时补
充液氮，组织绝对不能融化。待组织彻底碾磨成粉末状后，等剩
余液氮基本挥发完，马上加入 HL 裂解液 1 ml，继续快速匀浆。
将匀浆转移进 Ep管。然后按照 ＲNAprep pure Plant Kit说明书方
法提取 ＲNA。
1． 5． 2 低温切片法 从液氮中取出装有紫花地丁根的 1． 5 ml 冻
存管，立即放入冰冻切片机箱体中。镊子在酒精灯上烧灼片刻，
放入冰冻切片机内预冷。取出冰冻切片机的样本头，在样本头上
滴加适量的合成胶水，然后将样品头放入冰冻切片机内，用镊子
小心将样本从冻存管中取出，将其固定在样本头上的胶水中。然
后，以 4 μm的厚度连续切片，注意，不能切到胶水部分。将切出
来的组织碎片快速转移进预先加了 1ml HL 裂解液的 1． 5 ml 的
Ep管中，充分混匀。然后按照 ＲNAprep pure Plant Kit 说明书方
法提取 ＲNA。
1． 6 ＲNA浓度、纯度及完整性检测 取 1μl提取的 ＲNA，用微量
紫外可见分光光度计 ( NanoDrop ND1000 ) 测定其浓度、OD260 /
OD280值和 OD260 /OD230值;取 3 μl提取的 ＲNA用 1． 0%琼脂糖凝
胶电泳，全自动凝胶成像系统分析 ＲNA的完整性及纯度。
1． 7 18s ＲNA基因的 ＲT － PCＲ 扩增 按 First Strand cDNA Syn-
thesis Kit说明书进行逆转录( ＲT) ，引物为 Oligo( dT) 18，反应参数
为: 30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，99 ℃5 min，4 ℃ 5 min。取 cDNA
产物 1μl，上下游引物( 10 μmol /L) 各 1μl、2 × MasterMix12． 5 μl，
ddH2O 9． 5 μl至总体积 25 μl 进行 PCＲ，反应参数为:预变性 94
℃ 5 min，变性 94 ℃ 35 s，退火 55 ℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min，30 个
循环后于 72℃延伸 5 min，反应产物用琼脂糖电泳分析。
2 结果
2． 1 ＲNA纯度及浓度的紫外扫描分析 利用紫外分光光度法测
得液氮研磨法组提取的 ＲNA 浓度为 1． 21μg /μl，低温切片法组
提取的 ＲNA 浓度为 3． 57 μg /μl。紫外吸收 OD260 /OD280分别为
1． 96和 1． 82，OD260 /OD230分别为 2． 09 和 2． 17，可知其 ＲNA 纯度
较高。
2． 2 ＲNA完整性检测 琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，液氮研
磨法和低温切片法提取的 ＲNA，可见两条明显的条带( 见图 1) 。
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28s rＲNA与 18s rＲNA 条带亮度之比大于 1，说明 ＲNA 未被降
解。
M － Marker; 1．液氮研磨法; 2．低温切片法
图 1 ＲNA琼脂糖凝胶电泳结果
2． 3 GAPDH基因的 PCＲ扩增结果分析 反应产物用琼脂糖电泳
分析，在约 230bp处有明亮条带显示( 见图 2) ，与预计长度一致。
M － Marker; 1．液氮研磨法; 2．低温切片法
图 2 GAPDH基因扩增结果
3 讨论
提取 ＲNA是进行基因克隆、基因表达等分子生物学研究常
用实验。保证所提 ＲNA 完整是实验成功的前提和关键。但是，
当采集实验样本时，细胞离开了活体或者原来的生长环境后，内
源 Ｒnase即会开始降解 ＲNA，降解速度与内源酶含量及温度等因
素呈正相关。要想获得高质量的 ＲNA，需要在破碎组织时，保持
低温，快速将组织破碎，使组织细胞尽快与裂解液充分接触，裂解
液中的 Ｒnase 抑制剂发挥作用，保证 ＲNA 的完整性。液氮碾磨
就是目前使用最多，最有效的一种办法［2，3］。液氮研磨使组织在
研磨过程中，始终处于低温，ＲNA 酶活性被极大抑制，当研磨结
束后，虽然温度升高，但组织匀浆中的裂解液已经充分和细胞接
触，其中的 Ｒnase抑制剂可以继续发挥 Ｒnase抑制作用，这样，组
织中的 ＲNA得以完整的保留下来，因此，液氮研磨法能提取到高
质量的 ＲNA［4］。但是，液氮碾磨时间长，操作麻烦，如果样品数
较多的时候更加耗时耗力，植物根组织纤维含量丰富，韧性较大，
更增加了其难度。而且，研磨过程中需要消耗大量的液氮，成本
极高。
冰冻切片机切片过程中，其机箱温度可以设置成 － 30 ～ 25
℃的较低温度水平，短时间将样品组织置于其中，Ｒnase 活性也
能被充分抑制。冰冻切片机切片厚度可以达到几微米，大多数组
织的细胞直径在 10 ～ 20 μm左右，因此，如果用冰冻切片机对组
织进行切片，基本上能将所有的细胞充分切碎。因此，采用冰冻
切片机来对植物根组织进行切片，完全能够达到提取 ＲNA 的要
求。而且，冰冻切片机切片迅速，如果操作人员动作熟练，可以在
很短的时间内完成操作，将切出来的组织快速溶解在裂解液中，
再做后续提取 ＲNA的实验操作，能获得高质量 ＲNA。
通常，OD260 /OD280值和 OD260 /OD230值可以判断 ＲNA 的纯
度。纯的 ＲNA，其 A260 /A280以及 A260 /A230为 2． 0 左右。本实验中，
冰冻切片法和液氮研磨法的 OD260 /OD280分别为 1． 96 和1． 82，
OD260 /OD230分别为 2． 09 和 2． 17，可知其 ＲNA 纯度较高。实验
中，低温切片法比液氮研磨法提取的 ＲNA浓度高一些，估计是液
氮研磨时，损失的根组织较多，导致所提的 ＲNA量较少。电泳可
以判断 ＲNA的完整性。理论上，完整的 ＲNA拥有 28s∶ 18s = 2．
7∶ 1 的比例，大部分资料则强调 28s: 18s = 2: 1 的比例。事实是，
除了细胞外，从其它样品中抽提的 ＲNA 几乎都得不到 2: 1 的比
例。使用非变性电泳检测 ＲNA，以 DNA Marker 做对照，如果 2
kb处的 28s和 0． 9kb处的 18S条带清晰，且 28s∶ 18s ＞ 1，该完整
性可以满足绝大部分后续实验要求了。本实验中用两种方法提
取的 ＲNA都达到了这个要求。实验中用两种方法提取的 ＲNA
进行 ＲT － PCＲ扩增 GAPDH基因，两种方法都扩增出了符合预期
的条带。
本实验结果显示，低温切片法破碎植物根组织不仅能达到液
氮研磨法的效果，能满足后续实验需要，而且获得的 ＲNA 量更
多。因此，应用冰冻切片法来提取植物根组织 ＲNA 是一种成本
低，效果好，操作简便的方法，具有重要的实用价值。
参考文献:
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