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花楸组织培养中玻璃化现象的发生与防治



全 文 :第 37卷 第 10期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol.37 No.10
2009年 10月 JOURNALOFNORTHEASTFORESTRYUNIVERSITY Oct.2009
花楸组织培养中玻璃化现象的发生与防治 1)
     王爱芝 沈海龙 张 鹏 尹永花   李长海
  (东北林业大学 ,哈尔滨 , 150040)          (黑龙江省森林植物园)
  摘 要 以花楸(Sorbuspohuashanesis(Hance)Hedl)幼胚为外植体 , 对不定芽诱导 、增殖和腋芽增殖过程中玻
璃化现象的发生和防治措施进行了研究。结果表明:培养基种类和激素质量浓度是导致玻璃化现象的 2个主要原
因。在花楸组织培养中 MS和 WPM是理想的培养基;在不添加任何激素的 MS和 WPM培养基上 , 添加琼脂 7g/L, 并用带透气孔的封口膜封口 ,绝大部分玻璃化苗可逆转为正常的健壮苗 ,而且在 WPM培养基上 , 玻璃化苗在逆
转为正常苗的同时有 60% ~ 80%的茎芽基部长出辐射状根。
关键词 花楸;组织培养;玻璃化;培养条件;逆转
分类号 Q949VitrificationandItsPreventioninTissueCultureofSorbuspohuashanensis/WangAizhi, ShenHailong, Zhang
Peng, YinYonghua(ColegeofForestry, NortheastForestryUniversity, Harbin150040, P.R.China);LiChanghai
(HeilongjiangForestBotanicalGarden)//JournalofNortheastForestryUniversity.-2009, 37(10).-18 ~ 22
Anexperimentwasconductedtostudythevitrificationanditspreventionduringtheinductionofindefinitebuds, mul-tiplicationofadventitiousshootsfromyoungembryos, andtheproliferationofauxiliarybudsontheinvitroculturedshoots
ofSorbuspohuashanensis(Hance)Hedl.Resultsindicatedthatmediumtypeandhormoneconcentrationweretwoimpor-
tantfactorstocausevitrification.MSandWPMweretheoptimalmediafortissuecultureofS.pohuashanensis.Almostal
ofthevitrifiedshootscouldbecomevigorouswithusualappearanceonhormone-freeMSorWPMmediumsupplemented
with7g/Lagarinculturecontainerswiththeventilationholesealedwithsealingfilm.Moreover, 60 percentto80 percentofshootsgrewradialrootsattheirbasesonWPMmediumduringthereversionperiodfromvitrificationtonormal.
Keywords Sorbuspohuashanensis;Tissueculture;Vitrification;Cultureconditions;Reversion
  花楸(Sorbuspohuashanesis(Hance)Hedl)属蔷薇科苹果
亚科花楸属落叶小乔木。主要分布在我国黑龙江省小兴安
岭 、完达山 、张广才岭和老爷岭山区 , 以及吉林 、辽宁 、内蒙和
华北各省。 此外 , 朝鲜北部和俄罗斯的远东地区也有分
布 [ 1] 。花楸是我国北方珍贵的观花 、观果 、观叶树种 [ 2] 。它
具有耐冷湿 , 亦耐干燥瘠薄土壤;抗烟 、抗病力强 , 耐污染 [ 3] ,
兼有木材 、药材 、水果等多种用途 [ 4] , 是一种未被充分开发利
用的优良绿化和经济林树种。
花楸一般采用播种繁殖 , 人们在生产实践中已经积累了
一些关于种子采集 、调制 、播种 、抚育管理 、病虫害防治 、移栽 、
苗木生长等方面的经验 [ 5-10] 。但花楸实生苗生长周期长 、成
型慢 , 且采种母树不足(林内散生), 果实收集困难 , 出种率仅
为 1%[ 5] ,种子发芽率低 , 出苗率不稳定。因而 , 营养繁殖成
为繁殖优良特性花揪树种的重要方法 [ 11] 。近些年来 ,有人对
花楸扦插作了探索性试验 [ 12] , 但目前尚未达到最佳生根率。
因此 , 笔者曾尝试通过组织培养手段来繁殖和培育花楸苗
木 [ 13] ,诱导不定芽 , 然后伸长生长 、试管内外生根 , 培育成完
整植株 , 但是在花楸组培过程中玻璃化现象成为大量扩繁的
严重障碍。
Debergh等将试管苗生长异常现象命名为 “玻璃化”(Vit-
rification),是植物组培过程中离体条件下胁迫环境引发的生
理失调或生理病变 [ 14] ,是对胁迫的一种适应性反应 [ 15-16] 。
1)“十一五 ”林业科技支撑计划项目子专题(2006BAD03A04)和
哈尔滨市科技攻关课题(2003AA6CN094)。
第一作者简介:王爱芝 ,女 , 1975年 8月生 ,东北林业大学生命科
学学院 ,助理研究员。
通信作者:沈海龙 ,东北林业大学林学院,教授。
收稿日期:2009年 1月 8日。
责任编辑:潘 华。
研究玻璃化苗发生的原因和预防措施 , 是植物组培中至关重
要的一环。卜学贤 [ 17] 、梁海曼 [ 18]等对玻璃化现象的发生机
理进行了较为全面的研究。导致玻璃化苗发生的因素很多 ,
且不同植物的主导影响因素往往因种类而异。尽管试管苗玻
璃化偶尔可在延长培养期间恢复正常 [ 19-21]或通过诱导愈伤
组织后重新分化形成正常苗 , 但继代培养如果不能消除玻璃
化现象 , 不仅试管苗的分化能力低下 ,难以继代增殖 , 且难以
发根成苗 ,致使移栽成活率低 [ 22-24] 。近些年来玻璃化现象在
苹果 [ 25-29] 、梨 [ 30] 、刺槐 [ 31] 、软枣猕猴桃 [ 32] 、高山杜鹃 [ 33] 、枸
杞 [ 34]等数 10种植物的组织培养中都有报道。本研究主要比
较了以花楸幼胚为外植体时 , 不同培养基种类 、激素质量浓
度 、琼脂含量以及培养环境条件等对玻璃苗产生的影响并找
寻花楸玻璃化苗的逆转方法。
1 材料与方法
1.1 材料的采集 、处理和消毒
供试材料于 2005年和 2006年 8月中旬取自黑龙江省森
林植物园内 20a的花楸树。从采集的花楸幼果中挑选饱满
的幼果用自来水冲洗干净 , 然后搅拌冲洗 30min,再用 75%酒
精消毒 30s, 加入 3.0%的NaClO溶液 , 同时加入数滴吐温
-20不断搅拌消毒 15min,然后用无菌水冲洗 5 ~ 7次 ,在无
菌工作台下挤碎幼果 , 将幼嫩的种子取出 , 切破种皮子叶端 ,
挤出幼胚进行接种。
1.2 培养基的选择
诱导培养基:WPM(MS)+蔗糖 20g/L+琼脂 7 g/L+
NAA0.05mg/L+BA0.5mg/L;
丛生芽继代增殖培养基:MS(WPM)+BA0.1 ~ 0.3mg/L+
蔗糖 20g/L+琼脂 7g/L;
腋芽增殖培养基:将以 MS为初代培养基诱导出的正常
健壮的小苗截取带顶芽的高 1.0 ~ 1.5cm的茎段和长 1.0 cm
左右的带腋芽的茎段分别垂直和水平接种在腋芽增殖培养基
上。试验采用MS和 WPM 2种基本培养基 ,生长素 NAA质量
浓度采用 0、0.01和 0.03 mg/L3个水平;细胞分裂素 BA质
量浓度采用 0、0.1、0.3和 0.5mg/L4个水平;添加蔗糖 20g/
L和琼脂 7g/L;
“玻璃化”苗逆转培养基:以 MS(或 WPM)为基本培养
基 , NAA采用 0、0.01和 0.03mg/L3个水平;BA采用 0、 0.1
和 0.3mg/L3个水平;添加蔗糖 20g/L和琼脂 7g/L。
1.3 培养条件
本试验采用日光灯照射进行光照培养 , 光照 16 h/黑暗 8
h,光强 2 000 ~ 3 000lx,温度(25±2)℃, 湿度 70% ~ 80%。
1.4 数据统计
通过统计接种外植体总数 、诱导出丛生芽的外植体数 、诱
导出丛生芽总数以及玻璃化苗 、玻璃化苗逆转为正常健壮苗
数 , 分别计算出丛生芽诱导率 、丛生芽增殖系数 、玻璃化苗发
生率及玻璃化苗逆转率 ,即:
丛生芽诱导率 =(诱导出丛生芽的外植体数 /接种外植
体总数)×100%;
丛生芽增殖系数 =诱导出丛生芽总数 /诱导出丛生芽的
外植体数;
玻璃化苗发生率 =(玻璃化苗发生数 /该外植体诱导出
的不定芽总数)×100%;
玻璃化苗逆转率 =(玻璃化苗逆转为正常健壮苗数 /接
种的玻璃化苗数)×100%。
2 结果与分析
2.1 花楸幼胚组培过程中玻璃化现象的发生
2.1.1 花楸幼胚诱导阶段玻璃化现象的发生
从花楸幼果中剥出的幼胚 , 水平接种在诱导培养基上。
培养 1周后 , 子叶陆续开始变绿 , 胚轴开始伸长或膨大 ,之后
胚芽膨大 , 3周后部分幼胚胚芽处出现丛生芽。
①以 WPM为诱导培养基玻璃化现象的发生。从表 1可
以看出:当以 WPM为基本培养基时 , 丛生芽诱导率平均高达
58.61%, 丛生芽增殖系数最高可达 9.5, 少的一个幼胚仅能
诱导出不到 6个芽 , 而玻璃化苗发生率却最高达 59.9%, 也
就是说在诱导出的不定芽中竟然有约 60%的芽发生了严重
的玻璃化现象。诱导出的丛生芽茎叶黄绿 ,最高可达 7cm, 但
诱导的丛生芽个数较少。
表 1 以 WPM为基本培养基诱导花楸幼胚情况
重复

接种外
植体总
数 /个
诱导出丛
生芽的外
植体数 /个
丛生芽
诱导率 /
%
诱导出
丛生芽
总数 /个
丛生芽
增殖系

玻璃化
的丛生
芽数 /个
玻璃化
苗发生
率 /%
1 76 42 55.26 399 9.5 239 59.90
2 81 44 54.32 329 7.5 176 53.50
3 80 53 66.25 309 5.8 133 43.04
  ②以 MS为诱导培养基玻璃化现象的发生。从表 2中可以
看出,当以 MS为基本培养基时 ,丛生芽平均诱导率为 35.04%,
丛生芽增殖系数最高可达 10.6, 即一个幼胚经过初代诱导至
少可诱导出 10个芽 , 而玻璃化苗发生率最高达 25%。比较
表 1和表 2不难看出 ,当以 WPM为基本培养基时 , 丛生芽诱
导率明显高于 MS培养基 , 而丛生芽增殖系数前者比后者略
低 , 但是玻璃化苗的发生率远远高于后者。
在 MS培养基上诱导的丛生芽则茎叶墨绿 , 平均每个幼
胚诱导的丛生芽个数较多 , 只是芽的高度相对矮一点。经初
代培养后 , MS培养基中的茎丛基部仍有许多不定芽点或胚芽
周围膨大 ,继代培养中如果添加适当的激素仍可继续增殖 , 产
生大量的植株。在离体培养条件下 , 植物直接器官发生要求
培养基中有较高质量浓度的 Mg2+、K+、Zn2+和 Mn2+等。 不
定芽产生后其生长发育所必须的营养元素都来源于外植体对
培养基中营养盐分的吸收 , MS培养基包含了高质量浓度营养
元素 ,是一种非常有效的培养基。因此在营养盐分含量高的
培养基中 , 不定芽的质量要高于寡营养的培养基。综合以上
数量和质量指标 , 我们选择 MS培养基为最佳诱导培养基。
表 2 以MS为基本培养基诱导花楸幼胚情况
重复

接种外
植体总
数 /个
诱导出丛
生芽的外
植体数 /个
丛生芽
诱导率 /
%
诱导出
丛生芽
总数 /个
丛生芽
增殖系

玻璃化
的丛生
芽数 /个
玻璃化
苗发生
率 /%
1 34 13 38.24 138 10.6 15 10.87
2 37 11 29.73 138 12.5 20 14.49
3 35 13 37.14 108 8.3 27 25.00
2.1.2 花楸丛生芽的继代 、增殖阶段玻璃化现象的发生
经 WPM和 MS诱导培养获得丛生芽 , 切割带有不定芽芽
点的组织块转入继代增殖培养基经第 1次继代培养 , 1个胚
可诱导出 7 ~ 20个小茎丛 , 但发现有不同程度的玻璃化现象
发生 [ 35] 。
当初代培养基为 WPM培养基时 , 接种在 MS继代培养基
上 ,试验观察发现 ,玻璃瓶的内壁上有小水珠 , 叶片较大 、嫩梢
呈水晶透明或半透明地水渍状 , 几乎全部茎丛玻璃化;然而当
接种在 WPM继代培养基上时 , 玻璃瓶上有雾状水珠 , 小苗叶
片小 ,嫩茎细弱发黄 ,节间高 , 茎丛全部玻璃化。
当初代培养基为 MS培养基时 ,接种在 MS继代培养基上,
观察发现 , 无根茎丛墨绿 , 粗壮, 几乎没有玻璃化现象;然而当
接种在 WPM继代培养基上时 , 结果发现玻璃瓶上有雾状水
珠 ,小苗叶片小 , 卷曲 ,嫩茎细弱发黄, 节间高 , 茎丛发生不正常
的 “叶丛芽现象”,玻璃化现象严重。综合以上试验结果我们
认为继代培养阶段采用 MS培养基对减少玻璃化现象有效。
由此我们可以看出花楸不定芽诱导和增殖过程中培养基
种类是导致玻璃化现象的主要原因。
2.1.3 花楸无菌苗腋芽增殖阶段玻璃化现象的发生
①花楸顶芽增殖时玻璃化现象的发生。以 MS为诱导培养
基诱导出的正常健壮的茎丛, 剪取带顶芽茎段分别接种在 WPM
和 MS的腋芽增殖培养基上的生长情况,见表 3和表 4所示。
从表 3可以看出:随着 NAA质量浓度的增加 , 部分顶芽
外植体的基部切口处有愈伤组织形成;当 NAA质量浓度一定
时 ,随着 BA质量浓度的升高 ,丛生芽的诱导率和增殖系数都
在增加 , 同时玻璃化苗的发生率也随之升高;然而随着 NAA
和 BA质量浓度的升高 , 诱导出的茎丛虽然有的组合可以达
到 20个不定芽但其颜色则由墨绿至黄绿 ,茎也变得越来越细
弱 ,当 NAA质量浓度为 0.03mg/L, BA质量浓度在 0.1 ~ 0.5
mg/L范围内诱导出的丛生芽全部玻璃化。在不添加 BA时 ,
NAA在 0 ~ 0.03mg/L范围内都没有诱导出不定芽 , 而且在
NAA为 0 ~ 0.01mg/L, BA为 0 ~ 0.1mg/L时 , 均能产生辐射
状根 ,而且在不添加任何激素的 WPM空白培养基上 , 生根率
可达到 83.3%。
比较表 3和表 4可以得出 ,以顶芽为外植体诱导芽增殖
时 , WPM培养基上丛生芽诱导率(66.67%)略低于 MS培养
基(73.06%)、但是芽增殖系数和玻璃化发生率(45.83%)却
19第 10期            王爱芝等:花楸组织培养中玻璃化现象的发生与防治         
远远高于 MS培养基(30.28%),由此我们得出顶芽增殖培养 基选用 MS培养基。
表 3 从 MS转接到 WPM培养基后花楸顶芽增殖情况
WPM腋芽增殖
NAA/mg· L-1 BA/mg· L-1
外植体
数 /个
丛生芽诱
导率 /%
丛生芽
数量 /个
玻璃化
苗率 /%
丛生芽
高 /cm 小苗生长状态
生根外植
体数 /个
0 0 30 0 1 0 1 ~ 3 墨绿 25
0 0.1 30 66.7 3~ 7 0 2 ~ 5 墨绿,切口有愈伤组织 1
0 0.3 30 100 5~ 20 66.7 2 ~ 8 墨绿,部分黄绿 ,切口有愈伤组织 0
0 0.5 30 100 5~ 10 100 2 ~ 7 黄绿,切口有愈伤组织 0
0.01 0 30 0 1 0 1 ~ 4 墨绿 26
0.01 0.1 30 100 2~ 8 0 5 ~ 7 黄绿,部分墨绿 ,切口有愈伤组织 1
0.01 0.3 30 100 3~ 8 0 2 ~ 5 黄绿,部分墨绿 0
0.01 0.5 30 100 2~ 10 33.3 2 ~ 4 黄绿,部分墨绿 0
0.03 0 30 0 1 50 1 ~ 1.5 黄绿,部分墨绿 0
0.03 0.1 30 33.3 3~ 5 100 2 ~ 5 墨绿,切口有愈伤组织 0
0.03 0.3 30 100 2~ 8 100 2 ~ 8 黄绿,切口有愈伤组织 0
0.03 0.5 30 100 5~ 8 100 1.5 ~ 7 黄绿,切口有愈伤组织 0
表 4 从 MS转接到 MS培养基后花楸顶芽增殖情况
MS腋芽增殖
NAA/mg· L-1 BA/mg· L-1
外植体
数 /个
丛生芽诱
导率 /%
丛生芽
数量 /个
玻璃化
苗率 /%
丛生芽
高 /cm 小苗生长状态
生根外植
体数 /个
0 0 30 33.3 2~ 3 20.0 1 健壮 0
0 0.1 30 40.0 1~ 3 26.7 1 ~ 1.5 健壮 0
0 0.3 30 33.3 1~ 2 50.0 1 ~ 3 细弱 0
0 0.5 30 33.3 1~ 4 33.3 1 ~ 4 细弱 0
0.01 0 30 66.7 1~ 2 0 1 ~ 3 健壮 2
0.01 0.1 30 100 2~ 3 0 1 ~ 3 健壮 0
0.01 0.3 30 96.7 3~ 8 0 5 ~ 7 健壮 0
0.01 0.5 30 100 5~ 10 100 3 ~ 7 细弱 0
0.03 0 30 100 1~ 3 0 1 ~ 3 健壮 8
0.03 0.1 30 100 2~ 3 40.0 5 ~ 7 部分健壮 ,部分细弱 4
0.03 0.3 30 73.3 3~ 5 60.0 3 ~ 5 部分健壮 ,部分细弱 0
0.03 0.5 30 100 6~ 10 33.3 4 ~ 5 部分健壮 ,部分细弱 0
  ②花楸带腋芽的茎段增殖时玻璃化现象的发生。在初代
诱导培养基 MS上诱导出的正常健壮的小苗 , 截取顶芽和茎
段接种在 MS腋芽增殖培养基上的生长情况 ,见表 4和表 5
所示。
表 5 从 MS转接到 MS培养基后花楸茎段腋芽增殖情况
MS腋芽增殖
NAA/mg· L-1 BA/mg· L-1
接种外植
体数 /个
诱导出丛生芽
外植体数 /个
丛生芽诱
导率 /%
丛生芽
数量 /个
发生玻璃化
外植体数 /个
玻璃化
苗率 /%
丛生芽
高 /cm
苗生长
状态
生根外植
体数 /个
0 0 30 6 20.0 1 0 0 0.5 ~ 2 健壮 0
0 0.1 30 16 53.3 1 ~ 3 10 33.0 1 ~ 3 健壮 ,后下部叶枯 0
0 0.3 30 19 63.3 1 ~ 5 10 33.0 2 ~ 3 健壮 ,后下部叶枯 0
0 0.5 30 21 70.0 2 ~ 7 18 60 3 ~ 5 健壮 ,后下部叶枯 0
0.01 0 30 27 90.0 2 ~ 4 0 0 1~ 2.5 健壮 0
0.01 0.1 30 28 93.3 3 ~ 10 0 0 2 ~ 5 健壮 1
0.01 0.3 30 27 90.0 2 ~ 5 0 0 3 ~ 7 健壮 0
0.01 0.5 30 29 96.7 2 ~ 7 12 40.0 3 ~ 5 部分健壮 ,部分细弱 0
0.03 0 30 24 80.0 2 ~ 5 0 0 3 ~ 5 健壮 0
0.03 0.1 30 26 86.7 2 ~ 5 10 33.3 3 ~ 7 健壮 6
0.03 0.3 30 30 100 3 ~ 6 16 53.3 4 ~ 5 健壮 0
0.03 0.5 30 30 100 >10 21 70 3 ~ 4 部分健壮 ,部分细弱 0
  比较表 4和表 5可以得出:丛生芽的诱导率和芽增殖系
数 , 玻璃化苗的发生率均随着 BA质量浓度的增加而增加。
但是以顶芽为外植体时 , 总的丛生芽的诱导率(73.06%)略
低于茎段外植体(78.61%), 玻璃化苗率则前者(30.28%)略
高于后者(26.94%)。而且从苗木生长状态来看也是后者优
于前者 , 甚至部分组合中会诱导出根。
从表 3,表 4和表 5中可以看出:在 NAA质量浓度一定的
情况下 , 随着 BA质量浓度的升高 , 诱导出丛生芽的外植体
数 、丛生芽的诱导率和增殖系数均增加 , 同时玻璃化苗的发生
率也随之增加。然而 , 随着 NAA和 BA总体激素质量浓度的
升高 ,诱导出的茎丛则变得越来越细弱 ,可见分裂素质量浓度
也是导致玻璃化现象的又一大主要原因。
2.2 花楸组培中玻璃化现象发生的原因及防治措施
基于本试验过程中培养环境条件和培养材料本身的生理
状态等因素 , 我们采用如下具体措施来控制玻璃化现象。
2.2.1 调整外源激素浓度防治玻璃化现象
从花楸腋芽继代增殖试验中发现 , 导致玻璃化现象的一
个主要原因是由于细胞分裂素质量浓度过高 , 或细胞分裂素
20            东 北 林 业 大 学 学 报               第 37卷
与生长素比例过高。 为了有效地防治玻璃化现象 , 我们采取
在接种 20d后 , 适当降低培养基中的生长素和细胞分裂素的
质量浓度进行转瓶 , 试验结果如表 6所示。由表 6可知:NAA
和 BA质量浓度越低 , 玻璃化苗转化为正常苗的百分率越高 ,
相反激素质量浓度较高时 , 玻璃化苗逆转为正常苗的转化率
低 , 但茎丛增生率高。 这与丁运华和王鸿博 [ 36]关于梅菜 、高
红兵等对酸樱桃 [ 37] 、丰峰和陈厝边对草莓 [ 38]试管苗玻璃化
现象及其转化研究的试验结果一致。由此我们可以得出 , 该
阶段不加任何激素可以有效地把玻璃化苗转化为正常苗。
2.2.2 调整培养基种类和封口膜防治玻璃化现象
从表 3和表 4中我们可以看出 , 以顶芽为外植体时 , 茎芽
虽然不增殖但小苗健壮且木质化程度高 , 后期大部分基部长
根 , 同时我们结合表 6的激素浓度对玻璃化苗逆转率的影响
结果 , 因此 ,我们选用 WPM和 MS2种不加任何激素的空白
培养基和 2种封口膜(市售组培专用封口膜和聚丙烯膜 , 即
带透气孔与不带透气孔), 作为解决玻璃化现象的措施来分
别接种前 1代培养基为 MS和 WPM培养基上发生玻璃化现
象的茎丛 , 试验结果如表 7所示。从表 7可以看出 , 在 MS诱
导培养基上产生的玻璃化苗接种到 MS继代培养基上时 , 无
论封口膜是否带透气孔 , 均可以全部解决玻璃化;而当诱导培
养基为 WPM时 , 接种到 MS和 WPM培养基上的玻璃化苗逆
转率结果明显不同 , 同时在培养基一致的试验条件下聚丙烯
膜对茎丛生根更为有利 , 即在解决玻璃化问题的同时部分茎
丛基部能长出根。由此 ,我们可以利用 MS或 WPM空白培养
基和带透气孔的封口膜来有效的解决玻璃化现象。
表 6 不同激素质量浓度对玻璃化试管苗逆转率的影响
NAA质量浓
度 /mg· L-1
BA质量浓度为
0的逆转率 /%
BA质量浓度为 0.1
mg· L-1的逆转率 /%
BA质量浓度为 0.3
mg· L-1的逆转率 /%
0 100 83.33 83.33
0.01 83.33 76.67 43.33
0.03 53.33 40.00 0
表 7 调整培养基种类和封口膜解决玻璃化现象情况表
发生玻璃
化培养基
解决玻璃
化培养基
重复

玻璃化苗
数量 /个
逆转玻璃化
苗数量 /个
玻璃化逆
转率 /%
封口膜是否
带透气孔
培养后期
是否污染 茎芽生长状态
MS MS 1 21 21 100 是 部分 苗壮 ,茎部分干枯 ,高 4cm
2 21 21 100 是 全部 茎芽干枯 ,高 2cm
3 21 21 100 是 部分 茎芽干枯
MS MS 1 21 21 100 否 无 苗壮 ,高 1.5 ~ 2cm
2 21 21 100 否 部分 苗壮 , >6cm
3 21 21 100 否 无 茎芽干枯
WPM MS 1 21 21 100 是 部分 茎芽干枯 ,高 4cm
2 21 21 100 是 部分 茎芽干枯
3 21 21 100 是 部分 茎芽干枯
WPM MS 1 21 7 33.3 否 无 苗壮 , 60%长辐射状根
2 21 10 47.6 否 无 苗壮 , 20%长辐射状根 ,苗高 2~ 4cm
3 21 21 100 否 无 苗壮 , 40%长辐射状根
WPM WPM 1 21 21 100 是 部分 70%长辐射状根
2 21 18 85.7 是 无 60%长辐射状根 ,高 2 ~ 4cm
3 21 16 76.2 是 无 40%以上长辐射状根
WPM WPM 1 21 15 71.4 否 无 70%长辐射状根
2 21 20 95.2 否 无 60%长辐射状根 ,高 2 ~ 4cm
3 21 16 76.2 否 无 80%长辐射状根
  在建立花楸组培体系的试验阶段我们采用三角瓶 , 用牛
皮纸封口没有发现玻璃化现象 。后来在大量繁殖花楸苗木时
采用罐头瓶 , 用牛皮纸封口 ,接种 1周后发现因瓶口大培养基
失水严重而变干 , 于是封口膜改用聚丙稀膜 , 就出现了严重的
玻璃化现象 , 由此看来 ,封口膜也是导致玻璃化现象的一个因
素。但是要大量繁殖花楸苗木 ,不可能采用小口的三角瓶 , 于
是我们采用的带透气孔的封口膜来解决玻璃化现象。正如表
7所示 , 带透气孔的封口膜比聚丙烯膜对防治玻璃化的现象
效果显著 , 不过 ,它的使用也带来一个负面的影响 , 即培养后
期容易污染甚至茎芽容易干枯死亡;这就缩短了继代时间 , 给
我们生产带来不便 , 无形中也增加了成本。
3 结论与讨论
花楸幼胚在 WPM诱导培养基上玻璃化苗发生率(59.9%)
明显高于 MS培养基(25%);WPM诱导培养基上诱导出的茎
丛不论接种到 WPM或 MS继代增殖培养基上几乎全部茎丛
玻璃化;MS诱导培养基上诱导出的茎丛接种在 MS继代增殖
培养基上 , 几乎没有玻璃化现象;然而当接种在 WPM增殖培
养基上时 , 玻璃化现象严重。由此可见培养基种类是导致玻
璃化现象的主要原因 , 因而在不定芽诱导和继代增殖阶段均
选择 MS培养基。
花楸腋芽增殖阶段总的玻璃化发生率的趋势为 WPM高
于 MS,随着外源激素质量浓度的增加而不断增加 , 因此我们
认为激素质量浓度是导致玻璃化现象发生的又一主要原因。
琼脂一直被认为只是培养基的固化剂起支撑培养物的作
用 ,一般采用 0.5% ~ 0.6%琼脂就可固化。但近几年来人们
发现较高琼脂质量浓度可降低试管苗的玻璃化 [ 39] 。在花楸
的诱导阶段琼脂质量浓度开始采用 6g/L, 结果发现约 20%
的茎芽出现玻璃化现象。根据前期研究琼脂质量浓度对花楸
幼胚丛生芽诱导的多重比较的结果可知 , 添加 6g/L与 7g/L
琼脂的培养基对丛生芽的诱导在 a=0.05水平上没有显著差
异 ,但与添加 8g/L的琼脂差异极显著 [ 35] 。 因此为了降低玻
璃化苗发生率而琼脂质量浓度均采用 7g/L。
试管苗生长期间 , 要求有足够的气体交换 ,气体交换的好
坏取决于外植体生长量 、瓶内空间 、培养时间和瓶盖种类等。
密封瓶口 、高温 、高质量浓度细胞分裂素等因子加快了外植体
生长速度 、加剧了瓶中气体组成的改变 ,对瓶内外气体交换的
要求更高 , 当这种要求不能满足时 , 便出现玻璃化;当温度过
21第 10期            王爱芝等:花楸组织培养中玻璃化现象的发生与防治         
高 、培养瓶内相对湿度过大时 , 很容易形成玻璃化苗。因此调
整环境条件如通风 、温度和光照条件是解决玻璃化现象的一
个有效措施。
有研究表明人工光源光照周期 10 ~ 12 h基本上能满足
大多数植物的生长要求 , 但光照时数少于 8h, 光照强度低于
1 000lx时 ,有些植物容易形成玻璃化苗;也有人发现许多植
物玻璃化苗放于自然光下几天后 , 茎 、叶变红 , 玻璃化逐渐消
失 , 原因是自然光中的紫外线等能促进试管苗成熟 、加快木质
化 , 但有的效果并不明显 [ 40] 。此外 , 有试验发现控制组培室
的湿度 , 适当低温处理 , 避免过高的培养温度 , 采用昼夜变温
交替比恒温效果好。 而我们试验采用日光灯照射 , 每天光照
16h/黑暗 8h, 光强 3 000 lx, 温度(25 ±2)℃, 湿度 70% ~
80%, 同时将玻璃化现象不严重的培养物从培养架的上层转
移到底层或放在空调扇页口正对的培养架上 , 气流能够直接
对准培养物 , 有的放在自然光下培养一段时间后效果并不明
显 , 有的可逐渐转化为正常健壮的苗。因此我们认为花楸组
培过程中培养的环境条件不是造成玻璃化的主要原因。
为了防止花楸组培中玻璃化现象 , 我们采取了调整外源
激素质量浓度 、培养基种类 、琼脂质量浓度 、封口膜以及培养
环境等措施来防治玻璃化现象 ,试验结果表明:在不添加任何
激素的 MS和 WPM培养基上 ,琼脂质量浓度选用 7g/L, 用带
透气孔的封口膜 , 大部分玻璃化苗可转化为正常健壮的苗 , 而
且在 WPM空白培养基上 ,玻璃化苗在转化为正常苗的同时
有 60% ~ 80%的茎丛基部长出辐射状根。
本研究只针对试验过程中发生的玻璃化现象进行了常规
的措施调整即可解决玻璃化现象。前人的研究表明某些添加
物也可有效地减轻或防治玻璃化 , 如在培养基中添加 Ag-
NO3 [ 41] 、青霉素 [ 42] 、赤霉素 [ 43]多效唑 [ 44]和 AsA[ 45]等可抑制
玻璃化现象的发生。本试验没有进行添加附加物这方面的探
讨 , 今后将逐步进行深入研究。此外 ,在解决玻璃化现象的同
时茎芽基部生根的原因还有待进一步探讨和研究。
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