全 文 ：科技园地 AcademicField
PRACTICALFORESTRYTECHNOLOGY 7
二★一
一年第三期 林业实用技术
欧洲花楸组织培养快繁中污染率与相关因素分析
白荣芬
(辽宁省森林经营研究所 辽宁 丹东 118002)
[摘要 ] 欧洲花楸组织培养快繁中每年的 6 -9月污染率最
高。调查相关因素结果发现 , 污染率和制作培养基过程中的玻
璃瓶清洁状况 , 瓶口摩擦状况和用水有关;但是与灭菌锅消毒
过程中 0.05MPA时放气时间及空气的湿度和温度的关系最明
显。空气温度和湿度都大的季节 , 污染率高达 21.5%。
[关键词 ] 欧洲花楸 组织培养 污染率 相关因素
欧洲花楸 (Sorbusaucuparia)属蔷薇科 ,花楸属。
此树种树干通直挺拔 ,整个冬季至翌年 2月橘红色的
果实宿存于枝头 ,在东北作为园林树种植于庭园及风
景区具有很高的观赏价值 [ 1] 。它的叶子具有通便利
尿和抗坏血症 、祛痰的功效;果实具有收敛的药用功
效。在法国 、德国和澳大利亚 , 人们用欧洲花揪的果
实酿酒 。在波兰 , 其果实可用做伏特加酒的调味
剂 [ 2] 。另外 ,该树种木质中含有抗真菌的苯酚类化合
物 ,对某些特定的病原体有专门的抵御作用。其木质
硬 、纹理密 ,可用于制作工具的把手。鉴于其具有很
高的观赏 、药用和经济价值 ,我中心为适应国内苗木
市场需求 ,应用组织培养无性快速繁殖方法生产欧洲
花楸原种苗 ,但在繁育过程中除了要克服玻璃化 ,褐
化等问题外 ,在长期的生产和研究中 ,发现 ,在瓶苗繁
育过程中 , 每年 6月末至 9月初污染率最高可达
21.5%。可见 ,瓶苗污染的问题受到外界很多因素的
制约 ,笔者经调查研究和分析 ,希总结出下述规律供
生产参考 。
1 实验设置和材料
1.1 实验设置
试验在辽宁省森林经营研究所组培室 ,分为两个
环节的观察 ,分别试验是培养基污染率和欧洲花楸组
培瓶苗污染率观察 。培养基消毒后分别装箱 , (50瓶 /
箱)10d以后调查污染率;欧洲花楸组培瓶苗每个培
养架摆放 100瓶 ,每 10瓶 1组 ,连续观察 4个月 ,每隔
30 d继代 1次 ,记载污染率。材料均经过无菌操作台
Hgcl(0.1%)消毒 8min,并用无菌水冲洗 4次 ,经过 4
个周期的无菌继代培养后 ,在无菌台上严格筛选的无
菌苗 。
2 结果与分析
2.1 制备培养基过程中培养基污染的主要因素
组织培养过程中污染与培养基制备过程中的诸
多因素息息相关 ,所以设置了 6组不同的因素影响培
养基污染率的调查 ,分别观察玻璃瓶的清洁状况 、熬
制培养基用水状况 、培养瓶装锅前后摩擦状况 ,在相
同环境下灭菌后的培养基放置 20 d后平均污染率调
查结果如表 1。
表 1 影响培养基污染率的因素调查
月份
玻璃瓶清洁状况 瓶口摩擦状况 熬制培养基用水
洗衣粉
刷洗
自来水
冲洗
出锅后
装箱
出入锅
均装箱 自来水 蒸馏水
6 0 2 0 1 2 0
7 0 2 0 2 2 0
8 2 2 1 2 3 1
9 1 1 1 4 3 0
平均 0.75 1.75 0.5 2.025 2.25 0.25
由表 1可见 ,洗衣粉刷洗过的玻璃瓶污染率要低
于自来水冲洗 1%;减少瓶口间摩擦可减少封口膜渗
露 ,从而减少污染率 1.525%;蒸馏水熬制的培养基的
污染率要小于自来水熬制的培养基污染率 2%。
2.2 消毒过程中相关因子对培养基污染的影响
高压灭菌锅的消毒环节至关重要 ,我中心在生产实
验中为了彻底地排除锅体内的空气 ,加热消毒中锅体气
压到达 0.05MPA时放气 3次 ,通过观察研究发现污染
率与高压灭菌锅的放气时间有密切关系(见表 2)。
表 2 0.05 MPA时不同的放气时间对污染率的影响
月份 在 0.05 MPA时放气时间 /s与灭菌率 /%
15 30 45 60 90 180以上
6 3 0 0 0 0 2
7 3 1 0 0 2 5
8 4 2 0 0 2 30
9 3 0 0 0 0 10
平均 3.25 0.75 0 0 1.00 11.75
可见 ,操作过程中不仅要排除锅体的空气 ,还要
控制好排气的时间 ,排气的最佳时间在 45 ～ 60 s超过
180s时污染率反而要升高到时 11.75%。
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二★一
一年第三期 林业实用技术
2.3 无菌室内可考因素对培养瓶污染的影响
为了进一步考证培养室和接种室的各项因素对
污染率的影响 ,在 2010年 8月采用正交设计法对无菌
室的各种可考因素进行了相关性研究(见表 3)。
表 3 无菌室内各项因素对污染率的影响
试验
号
紫外灯消
毒时间 /min
甲醛消毒
间隔 /d
无菌室内
清洁度
无菌室封
闭状况
污染率
/%
C1 15 7 3 好 7.64
C2 15 15 3以上 良好 6.54
C3 15 15 3 好 4.68
C4 15 7 3以上 良好 15.3
C5 90 7 3以上 好 9.68
C6 90 15 3 良好 6.30
C7 90 7 3 好 12.10
C8 90 15 3以上 良好 3.58
T1 8.54 11.18 7.68 8.53 平均
T2 7.89 5.28 8.78 7.93
8.23极差 0.65 5.91 1.10 0.60
注:清洁度 3度以下代表地表有污渍 ,且操作台上有灰尘 , 3度以上
则表示无灰尘及污渍;无菌室封闭状况的评估是以实验操作前室内有
无其他操作人员进入为标准 ,如果实验前无人进入为好 , 曾经有人进入
为良好。
从表 3极差分析发现 ,无菌室内甲醛消毒次数对
污染率的影响最大 ,极差为 5.91 , 7 d消毒 1次的平均
污染率为 11.18%, 15 d消毒 1次的平均污染率为
5.28。紫外灯消毒时间和无菌室封闭状况对污染率
的影响最小 ,极差分别为 0.60和 0.65。通过正交实
验设计表 3可看出 ,紫外灯照射在 90 min+室内清洁
度 3度以上 +15 d甲醛灭菌 1次污染率最低 , 仅
为 3.58%。
2.4 气候因子对培养瓶污染的影响
组培环境虽然可以人为控制 ,但是在实践中发现
污染率和气候有明显地关系 ,每逢阴雨季节污染率是
一年之中最高的 ,作者连续统计了 2008— 2010年以来
6— 9月欧洲花楸的组培苗污染率与气候变化的关系
(见表 4)
表 4 污染率与培养室中温度和湿度的关系
月
份
2008年 2009年 2010年
温度
/℃
湿度
/%
污染率
/%
温度
/℃
湿度
/%
污染率
/%
温度
/℃
湿度
/%
污染率
/%
6 19 66 1.10 20.0 70.0 3.20 20.00 72 5.11
7 20 68 1.76 21.0 72.0 3.36 21.00 74 9.65
8 22 75 9.65 24.0 76.0 9.66 23.00 82 21.50
9 23 72 7.85 25.0 80.0 15.30 23.00 75 6.52
平均 21 70.25 5.09 22.5 74.5 7.88 22.25 75.75 10.70
由表 4可以看出 , 2010年 8月由于丹东地区持续
降雨空气湿度平均达 84%,污染率比往年同期最高高
出 11.84个百分点 ,虽然理论上培养环境的湿度应在
75% ～ 80%,但在阴雨季节空气湿度在 70以上污染率
就有可能随之增大 ,可见降低空气中的湿度是降低污
染率的有效途径 。
3 结果与讨论
(1)欧洲花楸虽然是很容易组培繁殖的树种 ,但
是在其实验生产过程中要想减少损失一定要严格遵
循每个环节的操作要求 ,如消毒环节要做到每个玻璃
瓶严格清洗 、烯纸包扎完的瓶口要注意减少摩擦 ,尽
量减少装箱的次数 ,如果条件具备尽量用蒸馏水熬制
培养基 。
(2)高压灭菌锅在加热过程中不断排气的过程
会使锅体内负压减小 ,空气会重新与锅体内气体混合
污染。因而 ,在第 2次和第 3次排气时 ,锅体温度达到
85 ℃以上时不要使压力表归 “0”,控制排气时间最好
在 45 ～ 60 s以内 ,不要超过 180s。
(3)接种室内采用紫外灯照射 90min+室内清洁
度 3度以上 +15d甲醛灭菌 1次的消毒方案污染率最
低;实验分析中发现 ,紫外灯的照射时间和污染率的关
系比较小 ,建议生产实验中紫外灯的照射时间在 15 ～
60 min即可。
(4)污染率与空气的温度和湿度有着明显的关
系 ,在空气潮湿度比较大的季节 ,最好采用硫磺熏蒸
等方法 ,使空气中的湿度降低在 70%左右 ,尽量消除
霉菌滋生的空间 ,从而降低污染率。
(5)培养基消毒待凝固后立即投入使用 ,不要使
用存放时间较长的培养基 。另外 ,廖俊杰[ 4]等在草莓
生产中 ,建议采用自来水代替蒸馏水配制培养基 ,本
次实验中建议在 6-9月最好采用蒸馏水 ,以降低此阶
段的污染造成的损失 。
参考文献:
[ 1] 刘 玮 , 李长海 , 庄 倩 ,等.欧洲花楸引种及生物学特
性 [ J] .东北林业大学学报 , 2007, (2):29-30.
[ 2] 余治家 , 于澎涛 ,王绪芳 , 等 .多用途树种欧洲花楸及其
引种 [ J] ,中国城市林业 , 2007, 5(6):56-59.
[ 3] 曹青爽 , 黄闽敏 , 李 萍.植物组织培养中的污染控制
[ J] .农村科技 , 2009;(6):55-56.
[ 4] 廖俊杰 , 李 艳 ,等 .工厂化生产草莓组培苗降低成本的
几项措施 [ J] .北京农业 , 2006, (1):18.★