全 文 ：中国不同地区蛇床的 rDNA ITS序列分析
蔡金娜1 , 周开亚＊ , 徐珞珊1 , 王峥涛1 , 沈　曦 , 王义权 , 李晓波1
(南京师范大学江苏省资源生物技术重点实验室 ,南京 210097;1中国药科大学生药学研究室 ,南京 210038)
摘要　目的:探讨不同分布区的蛇床 Cnidium monnieri 的 ITS 序列变异与其地理分布和化学成分的相关性。
方法:设计 2 对引物 , Pf+Pb 及 P5.8S ITS1+P5.8S ITS2 , PCR扩增产物纯化后用银染法或 ABI 310测序。结果:得
到核糖体 DNA 中的 ITS 及 5.8S rDNA 完全序列 , 18S 和 26S rDNA 部分序列 ,共约 700 bp。 5 个地点样品的 ITS-1
及 ITS-2 的序列大小分别为 210～ 217 bp 和 219 ～ 224 bp。 ITS-1碱基序列的遗传距离 0.00～ 1.93%, ITS-2 碱基序
列的遗传距离 0.46 ～ 2.34%, ITS-1 较为保守。以 NJ 法根据 ITS-2 序列数据重建系统发生树。哈尔滨样品聚为一
组 ,衡水与德州样品和郑州与高淳样品各自聚为一组。结论:ITS-2 序列的变异与中国产蛇床的纬度分布相关 ,而其
与蛇床化学型的关系尚需作进一步研究。
关键词　蛇床;rDNA内转录间隔区;纬度
　　蛇床 Cnidium monnieri (L.)Cuss.属伞形科
植物 ,为世界性分布的广布种 ,不仅分布区域广 ,而
且生态环境幅度大 ,在我国各地均有分布。该植物
的果实称蛇床子 ,为常用中药 ,有壮阳补肾 、祛风燥
湿 、杀虫之功效[ 1] 。
作者曾对在中国不同分布区域蛇床的果实(蛇
床子)进行了形态组织学 、孢粉学及化学等系统研
究 ,结果表明其在形态组织及孢粉学方面 ,随分布区
域的不同无显著变化 ,但其所含香豆素类成分有种
内变异 , 并与其地理分布有一定的相关性[ 1] 。近
年 ,根据 TLC 和 GC 分析结果结合地理分布 ,进一
步将蛇床按香豆素类化合物分为 3个化学型[ 2] :I
型 ,以角型呋喃香豆素为主要成分 ,不含蛇床子素
(osthol),分布于辽宁 、黑龙江 、内蒙古等温带针阔叶
混交林区域;II型 ,以蛇床子素和线型呋喃香豆素为
主要成分 ,不含角型呋喃香豆素 ,分布于福建 、浙江 、
江苏等亚热带常绿阔叶林区域;II I 型 ,同时含有蛇
床子素 、线型和角型呋喃香豆素成分 ,为混合的过渡
类型 ,分布于河南 、河北 、山西等暖温带落叶阔叶林
区域 。
核糖体 DNA 中的内转录间隔区(internal
transcribed spacer , ITS)序列的进化速率较快 ,且与
植物生活型呈相关性[ 3] ,近年已被广泛用于植物种
内变异和种间 、近缘属间的分子系统学研究[ 4～ 8] 。
收稿日期:1999-03-25
基金项目:江苏省资源生物技术重点实验室资助课题
＊联系人　Tel:(025)3598328 , Fax:(025)3598328 ,
E-mail:kyzhounj@jlonline.com
为此 ,本文测定了中国蛇床 5个居群植物的 ITS-1 、
5.8S rRNA 基因 、ITS-2全长序列及 18S 、26S rRNA
基因的部分序列 ,共约 700 bp ,探讨了 ITS 序列变
异与蛇床地理分布和化学成分的相关性。
材 料 和 方 法
1　材料　均为新鲜的叶片 ,除江苏高淳的样品直接
采自野外 ,其余均为 1997年采集野生的果实 ,当年
10月播种于中国药科大学药用植物园 ,1998年 2 ～
3月发芽 ,3 ～ 4 月采集叶片 ,用于 DNA提取 。材料
来源见表 1。
Tab 1　Samples of Cnidium monnieri used in the
present study
Code Locality
North
latitude
Chemo-type Date of
collect ion
HB1 Harbin , Heilongjiang 45.7° I 980408
HB2 Harbin , Heilongjiang 45.7° I 980408
HS Hengshui , Hebei 37.7° III 980326
DZ Dezhou , Shandong 37.4° II 980408
ZZ Zhengzhou , Henan 34.7° III 980408
GC1 Gaochun , Jiangsu 31.3° II 980305
GC2 Gaochun , Jiangsu 31.3° II 990704
2　DNA提取　取 2.5 g 新鲜叶片在液氮中研成
粉 ,置 15 mL 离心管中 , 加入 DNA 提取缓冲液(8
mol·L-1脲 , 0.35 mol·L-1 NaCl , 0.05 mol·L-1
T ris-HCl , pH 8.0 , 0.02 mol·L-1 EDTA ,2%蔗糖 ,
5%酚)5 mL 及 10%SDS 0.5 mL ,混匀 ,60℃保温
10 min , 其间倒转数次。酚-氯仿抽提 , 乙醇沉淀
·56· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2000 , 35(1)∶56～ 59
DNA ,70%乙醇洗涤 2 次 ,晾干 ,适量 ddH2O溶解 ,
4℃贮存备用。
3　引物设计　ITS的扩增引物(Pf , Pb)是根据东川
芎(Cnidium of f icinale) 18S rDNA[ 9] 及 菊 科
Hypochoeris属 26S rDNA[ 6]的序列设计:
Pf:5′-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3′;
Pb:5′-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG -3′;
此外 ,我们另设计一对测序引物:
P5.8S ITS1:5′-GCTACGTTCTTCATCGAT -3′;
P5.8S ITS2:5′-CCATCGAGTCTTTGAACGCAA-3′。
4　ITS的扩增和 PCR 产物的纯化　I TS 的扩增采
取Pf+Pb进行整段扩增 ,扩增程序为:95℃预变性
5 min后进入如下循环:98℃变性 15 s , 56℃退火 1
min ,72℃延伸 2 min , 35个循环后 ,72℃延伸 7 min。
扩增反应在 MJ/PTC-200-D 热循环仪上进行 ,反应
体积均为 50 μL ,其中含 KCl 50 mmol·L-1;Tris-
HCl 10 mmol·L-1;0.1% Tri ton X-100 , MgCl2 2
mmol·L-1;4种dNTP 各250μmol·L-1;1 u的 Taq
DNA聚合酶。
5　测序反应及检测　测序用 Promega 公司产银染
测序试剂盒 ,反应按操作手册进行。反应结束后 ,每
管中加入DNA测序终止液 3μL 停止反应并兼作电
泳时的载样缓冲液。测序反应液在 BIO-RAD
3000Xi 型测序电泳仪上进行电泳 , 银染测序
(Promega)。GC2样品用 ABI 310遗传分析仪测序。
6　序列的对位排列与分析　ITS-1及 I TS-2 的范
围参照五加科植物 Pseudopanax anomalus[ 10] 的
rRNA基因 ITS片段序列确定 ,用 CLUSTAL W 软
件对序列进行对位排列 ,然后手工适当校正 。以尽
量减少排列所需缺失的数目。得到的序列用
MEGA (Molecular Evolut ionary Genet ics Analysis
Version 1.02)软件进行系统发生分析 。在 Kimura
双参数法计算遗传距离的基础上 , 以邻结法
(Neighbor-joining method)重建系统发生树 。
18S rDNA ┃ ITS-1
HRB2 C TG CGGAAGG A TC A T T G T CG AA T C C TG C AA T AG C A-- GA A T GA C CC G C T A A C A C G T C AA C AA TT T G GG CA
HRB1 ......................................................................
GC1 ...AC .G .A .GAT ....................TCAT .................................
GC2 ? ? ? ? ? ? ? ? A .GAT .........................................................
DZ ......................................................................
ZZ ..- ..A .G .T .........- ......- .....CAT ..- ...- ............................
HS ......................................................................
HRB2 A G CG TCGGGG GG C C T CGG T C T C C TG T C TG C G AA TC CC T G G T AGG TGG TC A C TC T CGGG TG G CC A C T GG C C
HRB1 ......................................................................
GC1 ......................................................................
GC2 ......................................................................
DZ ......................................................................
ZZ .- ...............................- ....................................
HS ......................................................................
HRB2 T A C AAAA T CA T T T G GG CG CG GA A-T G CG C C A AGGA C CT T A AAA C T GAA T T G T A CG TC CG T A T C CC G T T A G
HRB1 ......................................................................
GC1 ......................................................................
GC2 ......................................................................
DZ ......................................................................
ZZ .......................A ..............................................
HS .................- ....................................................
┃ 5.8S rDNA
HRB2 C GGG C AG CGG C G TC A T T C CA AAA C A CAA C G A C T C TC GA C A A CGGA TA TC T C G G C TC T C G C A TCGA TGAAG
HRB1 ......................................................................
GC1 ......................................................................
GC2 ......................................................................
DZ ......................................................................
ZZ ......................................................................
HS ......................................................................
HRB2 A A C G T AG CGA AA TG C GA T A C T TG G TG TGAA T T G CAGAA TC C C G T GAA C C A T C GAG TC T T T G AA CG CAAG T
HRB1 ......................................................................
GC1 ........- .............................................................
GC2 ........- .............................................................
DZ ......................................................................
ZZ ......................................................................
HS ......................................................................
┃ ITS-2
HRB2 T-G C G C C C AA AG CC A C TAGG C TG AGGG CA C G TC TG CC T G G G T G T CA C G C A T CG TC T T G C C C A C AAA C T A C
HRB1 ...................................................................C ..
GC1 .A .........? ? ? ? ? ...................................................C ..
GC2 .A .................................................................C ..
DZ ....................................................................
ZZ .A .................................................................C ..
HS .A ....................................................................
·57·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2000 , 35(1)∶56～ 59
HRB2 T CA C A C-C TG A-AAG T T G TG CC GG T T T G GG GG CGGAAA C T G G C C T CC CG T A C C T TG T CG T G CGG T T G G CG
HRB1 ...........G ..........................................................
GC1 ......T ....G .............................................T ............
GC2 ......T ....G .............................................T ............
DZ ......T ....G .........- ........................- ..........T ............
ZZ ............- ........- .........- .........C ...GG ..........T ............
HS ...........G .............................................T ............
HRB2 G AAAAA CGAG T C TC C G G-C G A T GGA CG TC G C GA CA TC GG T GG T TG T A AAA G A CC C T C T TG T C T TG T CG CG
HRB1 ...........................................................C ..........
GC1 ......................................................................
GC2 ......................................................................
DD ......................................................................
ZZ ......................................................................
HS .....G .........A .A ....................................................
┃ 26S rDNA
HRB2 C GAA T CC T CG T C A T C T TA G C GAG C T CC AGG A C CC T T A GG C A G CA CA C A C T C TG TG C G CA T C GA C TG TG A C
HRB1 ......................................................................
GC1 ...................................................................AC .
GC2 ...................................................................AC .
DZ ......................................................................
ZZ ......................................................................
HS ......................................................................
HRB2 C C-AG G T C AG G CG GGA C TA -
HRB1 ....................
GC1 ....................
GC2 ....................
DZ ..C ................A
ZZ ..C .................
HS ..C .................
Fig 1　Alignment of ITS-1 , 5.8S rDNA and ITS-2 nucleot ide sequence of 7 samples of Cnidium monnieri.
Dots indicate sequence identi ty w ith HB2 , dashes deno te deletions.
结 果
1　碱基序列的大小　共测得 5 个居群 7个个体样
品的 I TS-1 , 5.8S rDNA 和-ITS-2 全序列及 18S
rRNA基因 3′端和 26S rRNA 基因 5′端部分碱基序
列 ,共约 700 bp(图 1)。其中 ITS-1 为 210 ～ 217
bp ,5.8S rDNA为 160 ～ 162 bp , I TS-2 为 219 ～ 224
bp(表 2)。
Tab 2 　Size and G+C contents of ITS-1 , 5.8S
rDNA and ITS-2 sequences of samples of Cnidium
monnieri from different localities
Code
ITS-1
Size/
bp
G +C
contents/
%
5.8S rDNA
S ize/
bp
G +C
contents/
%
ITS-2
S ize/
bp
G +C
contents/
%
Total/
bp
HB1 215 55.8 161 53.4 223 57.9 599
HB2 215 55.2 161 53.4 222 57.2 598
HS 214 55.1 162 53.1 224 56.7 600
DZ 215 55.8 161 53.4 221 56.6 597
ZZ 210 54.2 162 53.1 219 57.1 591
GC1 217 55.3 161 50.3 224 57.2 602
GC2 215 55.4 161 50.3 224 57.2 600
2　碱基序列的遗传距离　5 个居群间的 ITS-1 碱
基序列的遗传距离在 0.00 ～ 1.93%范围 , ITS-2 碱
基序列的遗传距离在 0.46 ～ 2.34%范围(表 3)。
ITS-1较为保守。因此只对 ITS-2 序列数据(对位
排列 225个位点)用邻结法(NJ)重建系统树。
Tab 3 　Values (×100 sites)of pairwise sequence
divergence between samples in ITS-1 (below)and
ITS-2(above)with Kimura 2-parameter distance
OTUs HB2 HB1 HS DZ ZZ GC1 GC2
HB2 0.0092 0.0140 0.0046 0.0186 0.0093 0.0093
HB1 0.0000 0.0234 0.0139 0.0186 0.0092 0.0092
HS 0.0048 0.0048 0.0093 0.0233 0.0140 0.0140
DZ 0.0000 0.0000 0.0048 0.0139 0.0046 0.0046
ZZ 0.0144 0.0144 0.0193 0.0144 0.0092 0.0092
GC1 0.0093 0.0093 0.0144 0.0093 0.0144 0.0000
GC2 0.0000 0.0000 0.0047 0.0000 0.0048
讨 论
蛇床植物 5个居群间的 ITS-1及 ITS-2的碱基
序列存在一定差异 ,说明广布种蛇床种内存在着不
同的分化类型。提示 ITS 序列不仅适用于较高分
类等级的系统分类研究 ,也能反映种内变异及多态
性 。哈尔滨和高淳各测了 2个样品 ,结果表明同居
群不同个体间的序列变异较小。
Fig 2　Phylogenet ic t ree reconst ructed using NJ w ith
Kimura distance based on ITS-2 nucleo tide sequence
of 7 samples of Cnidium monnieri.
·58· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2000 , 35(1)∶56～ 59
根据 I TS-2建立的系统发生树(图 2),蛇床的 7
个样品分为 3组 ,即哈尔滨居群聚为一组 ,分布的纬
度最高;衡水与德州居群聚为另一组 ,分布的纬度居
中;郑州与高淳居群也聚为一组 ,分布的纬度最低 。
说明 I TS-2序列的变异与蛇床的纬度分布相关。这
3个组之间 ,哈尔滨组与郑州-高淳组首先聚合 。然
后 ,这两个组与衡水-德州组相聚。提示在进化过程
中 ,有一个支系向南 、北两个方向扩散 ,并分化形成
了前两个组。
哈尔滨组属化学型的 I 型 。然而 ,郑州-高淳组
和衡水-德州组内都既有 II 型 ,也有 III 型。即北纬
31°～ 37°范围内有 II 型和 I II型并存。而且作者在
蛇床香豆素类成分的种内变异的研究中 ,发现在郑
州和济南所采的样品 ,在潮湿生境的属于 II 型 ,而
在干燥生境的属于 I II 型 ,提示香豆素类成分的变
化可能与生境相关 。所以 ,蛇床的 ITS 序列与其化
学型的关系 ,尚需对不同地点 、不同生境的蛇床样品
作进一步的研究 。
参 考 文 献
1　蔡金娜 ,徐国钧 , 金蓉鸾 , 等.蛇床子类专题研究.见:徐
国钧 , 徐珞珊.常用中药材品种整理和质量研究.南方协
作组 ,第一册 , 福州:福建科技出版社 , 1994.648～ 672
2　蔡金娜 ,张亮 , 王峥涛 , 等.国产蛇床中香豆素类成分的
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3　汪小全 , 李振宇.rDNA 片断的序列分析在苦苣苔亚科
系统学研究中的应用.植物分类学报 , 1998 , 36∶97
4　Baldwin BG , Sanderson MJ , Po rter JM , et al.The ITS
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evidence on angiosperm phylogeny.Ann Missouri Bot
Gard.1995 , 82∶247
5　Sang T , Crawford DJ , Stuessy TF.Documentation of
reticulate evolution in peonies (Paeonia) using internal
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implication for biogeography and concerted evolution.Proc
Natl Acad Sci USA , 1995 , 92∶6813
6　Cerbah M , Souza-Chies T , Jubier MF , et al.Molecular
phylog eny of the Genus Hypochaeris using internal
transcribed spacers of nuclear rDNA: inference fo r
chromosomal evolution.Mol Biol Evol , 1998 , 15∶345
7　Buckler ES IV , Holtsford TP.Zea systematics ribosomal
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8　Coleman AW , Jeffrey CM.Ribosomal DNA ITS-1 and
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9　Fushimi H , Komatsu K , I sobe M , et al.A new approach
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“ Chuanxiong” by 18S ribosomal RNA gene sequences.
Phy tomedicine , 1996 , 3∶387
10　Mitchell AD , Wagstaff SJ.Phylogentic relationships of
Pseudopanax species(Araliaceae)infer red from parsimony
analy sis of rDNA sequence data and morpholog y.Plant
Syst Evol , 1997 , 208∶121
RIBOSOMAL DNA ITS SEQUENCE ANALYSESOF CNIDIUM MONNIERI
FROM DIFFERENT GEOGRAPHICAL ORIGIN IN CHINA
Cai Jinna1 , Zhou Kaiya , Xu Luoshan1 , Wang Zheng tao1 , Shen Xi , Wang Yiquan and Li Xiaobo1
(J iangsu Provincial Key Laboratory of Resources Biotechnology , Nanj ing Normal University , Nanjing
210097 ;1Department of Pharmacognosy , China Pharmaceutical University , Nanj ing 210038)
ABSTRACT　AIM:To study the correlation betw een ITS sequence variation of Cnidium monnieri and
geographical distribution and chemo-ty pe of the plant.METHODS:Tw o pairs of primers P f+Pb and P5.8S
ITS1+P5.8S I TS2 were designed.The PCR products w ere purified and sequenced by silver staining DNA
sequencing technique and ABI 310.RESULTS:Complete sequcnce of ITS and 5.8S rDNA , and partial sequence
of 18S rDNA and 26S rDNA of Cnidium monnieri were obtained.They totaled about 700 bp.The sequences of
ITS-1 and ITS-2 ranged from 210 bp to 217 bp and 219 bp to 224 bp;respectively.Pairwese sequence
divergences of the samples ranged from 0% to 1.93% in ITS-1 , and from 0.46% to 2.34% in ITS-2.The
ITS-1 is more conservative.Phylogenetic tree based on ITS-2 sequence data (225 aligned sites)indicated that
the Harbin samples , Hengshui and Dezhou samples , and Zhengzhou and Gaochun samples clustered separately.
CONCLUSION:The sequence variation of ITS-2 is co rrelated to lati tude distribut ion of Cnidium monnieri in
China.Further studies are needed to clarify the relation between ITS sequence variation and chemo-type of
Cnidium monnieri.
KEYWORDS　Cnidium monnieri;rDNA internal transcribed spacer;latitude
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