全 文 ：2006年 第7卷 第6期
植物组织培养过程中形态发生的途径有两条,一是器
官发生,一是胚胎发生。器官发生是由愈伤组织产生不定
芽和不定根,进而形成植株;胚胎发生则是与合子胚相似
的胚胎发生过程,由愈伤组织先形成胚状体,再由胚状体
发育成完整植株。由于胚状体具有产生数量多、速度快、结
构完整的特点,所以其理论和应用研究受到很大的重视。
形态特征的变化是生理生化变化的外部反映,决定着分化
和形态建成的方向[1]。建立胚状体发生的生化标识系统,通
过改变外界因素诱导代谢向着有利于胚胎发生的方向进
行,具有重要的意义。本实验以蛇床幼茎愈伤组织为测验
材料,分析比较了未分化愈伤组织、分化不定芽愈伤组织
与分化胚状体愈伤组织在过氧化物酶活性和过氧化物同
工酶谱方面的差异,为分化机理的研究提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
供试材料为不同发育阶段的蛇床幼茎愈伤组织。未分
化愈伤组织取自MS+2,4-D1mg/L+KT0.4mg/L培养基;
分化不定芽愈伤组织(包括初生分化芽的愈伤组织和已分
化芽及根的愈伤组织)取自 MS+2,4-D0.2mg/L+ZT0.4
mg/L培养基;分化胚状体愈伤组织取自 MS+NAA0.2mg/
L+ZT0.4mg/L培养基。
1.2 实验方法
1.2.1 过氧化物酶的活性测定[2]
参照章骏德等编著的《植物生理实验法》,取分化程
度不同的愈伤组织各1g,冰浴研磨成匀浆,定溶至25mL,
1000rpm冰冻离心,取上清液1.0mL,加pH5.0的醋酸缓
冲液 1.0mL,0.1%愈创木酚 1.0mL,0.08%H2O2溶液 1.0
mL。在470nm处测OD值,通过标准曲线计算酶活性。酶
活性以每小时每克鲜重生成的4-邻甲基苯酚的量来表示。
1.2.2 过氧化物同工酶的测定[3~6]
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acr.)和胶联剂甲叉双
蛇床愈伤组织形态发生过程中过氧化物酶的变化规律研究 *
宋 强
(山西中医学院,山西 太原 030024)
摘要 目的：研究蛇床愈伤组织形态发生过程中过氧化物酶活性的变化与过氧化物酶同工酶的差异。方法：采用分光光
度法测定过氧化物酶活性,采用聚丙烯酰胺凝胶平板电泳分析过氧化物同工酶。结果：已分化愈伤组织的酶活性高于未
分化愈伤组织,未分化愈伤组织、产生胚状体的愈伤组织及分化芽和根的愈伤组织的酶活性成线性递增关系。不同分化
类型愈伤组织的过氧化物酶同工酶谱有明显的差异。三类愈伤组织都有酶带 1和 2,分化的愈伤组织都有 3和 5,分化
芽和根的愈伤组织还有酶带4,分化芽和根的愈伤组织的酶带 3比形成胚状体的愈伤组织的酶带3要宽,着色也深。结
论：过氧化物酶活性与愈伤组织分化程度呈正相关;酶带 1和 2显示的两种同工酶与愈伤组织的增殖有关,酶带 3和 5
是与分化有关的特异性蛋白质。酶带4可能催化器官发生特有反应,且对过氧化物酶的活性影响较大。
关键词 蛇床;愈伤组织;过氧化物酶;同工酶
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1671-0258(2006)06-0013-02
ChangeRegularityofPeroxidaseDuringCnidiumMonnieri
CalusMorphorlogicalOccurrence
SongQiang
(ShanxiColegeofTCM,TaiyuanShanxi030024)
Abstract Objective:Tostudythechangeregularityofperoxidaseactivityandthediferenceofperoxidaseisozymeduring
Cnidiummonniericalusmorphorlogicaloccurence.Methods:Theactivityofperoxidasewasdeterminedbyspectropho-
tometryandperoxidaseisozymewasanalyzedbypolyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE).Results:Theenzymaticactiv-
ityofdiferentiatedcaluswashigherthanthatofundiferentiatedcalus.Theenzymaticactivityofundiferentiatedcalus,
embryoidcalusandadventitiousshootandrootcalusshowedthelinearincrease.Theperoxidaseisozymepaternsofvari-
ousdiferentiatedcalushadobviousdiference.Theenzymaticbandings1and2wereseeninisozymepaternsofthree
caluses.Thebandings3and5wereseeninisozymepaternofdiferentiatedcalus,andbanding4wasobservedin
isozymepaternsofadventitiousshootandrootcalus.Theenzymebanding3ofadventitiousshootandrootcaluswas
wideranditspigmentationwasdeeperthanthatofembryoidcalus.Conclusions:Theactivityofperoxidasewaspositive
corelatedwiththediferentiateddegreeofcalus.Andtwoisozymeshadtheenzymebandings1and2werecorelated
withtheproliferationofcalus.Emzymebandings3and5indicatedspecialproteinconcerningdiferentiationoforgansand
afectingtheactivityofperoxidase.
Keywords Cnidiummonnieri;calus;peroxidase;isozyme
*山西省科技攻关项目(项目编号:2006031083-6)
宋强,男,讲师,从事中西医结合基础医学生物学教学与研究工作
实验中医药学
13
2006Vol.7No.6
丙烯酰胺(Bis.)在催化剂的作用下,聚合而成的具有三维
网状结构的凝胶。通过改变Acr.单体的浓度和交联度,可
以控制凝胶孔径的大小。在不连续电泳过程中,通过样品
的浓缩效应、凝胶分子筛效应以及一般分离的电荷效应,
把酶、蛋白质混合物浓缩成区带、分离。
本实验参照文献[3]的方法,采取 Acr.单体浓度为 7%
的凝胶板(制胶配方见表 1、表 2),用酶活性测定中相同的
材料及相同的方法制样,电泳,用联苯胺染色法染色。胶板
照相记录,并制干板保存。
2 结 果
2.1 不同分化程度的愈伤组织过氧化物酶活性
测定结果见表3。不同分化程度的愈伤组织过氧化物
酶的活性测定实验结果表明,分化芽和产生胚状体的愈伤
组织,酶活性高于未分化的愈伤组织,说明过氧化物酶活
性与愈伤组织分化程度呈正相关。
2.2 不同分化程度愈伤组织过氧化物同工酶的变化
不同分化程度愈伤组织过氧化物同工酶谱成规律性
变化,结果见图1。图1中a为未分化的愈伤组织的过氧化
物同工酶谱,b为初生分化
芽的愈伤组织的同工酶谱,
c为已分化芽和根的愈伤组
织同工酶谱,d为产生胚状
体的愈伤组织的同工酶谱。
3 讨 论
一般认为,过氧化物酶
的生理作用有三个:①具有
吲哚乙酸氧化酶的作用;②
具有木质化作用;③具有对
创伤、照射的保护作用。无
论是分化芽还是分化胚状
体,都需要维管系统的建
成,而过氧化物酶能使植物组织中所含C3-C6化合物转化
成木质素,从而促进芽和胚状体的发育。由此可见,过氧化
物酶活性是组织分化的一项重要指标[8]。芽分化时总是伴
随着过氧化物酶活性的增加。丁宝莲等[7]在研究烟草叶肉
细胞壁过氧化物酶时发现其活性从幼嫩叶片到成熟叶片,
有一个从低到高、呈S形变化的曲线。徐竹筠[8]对胡萝卜体
细胞胚胎发生的研究中发现,愈伤组织在分化或者形成胚
状体的形成阶段,过氧化物酶活性都有增大趋势。与本实
验研究结果相似。
另外,实验还发现四种状态愈伤组织的过氧化物酶活
性基本上呈线性递增关系。即初生分化芽、分化胚状体、分
化芽和根的愈伤组织的过氧化物酶活性分别是未分化的
愈伤组织过氧化物酶活性的2、3、4倍。这一结果可能与它
们各自的维管系统的建成程度有关。
在图1的同工酶谱中,四种材料电泳都存在酶带1和
2,说明酶带1和 2与愈伤组织的增殖有关,因为即使分化
芽和胚状体的愈伤组织块中也包含一些未分化的愈伤组织
薄壁细胞。发生分化的愈伤组织都有酶带3和酶带5,说明
这两条酶带与愈伤组织的分化有关。已分化芽和根的愈伤
组织的酶带 3着色最深,酶带最宽,形成胚状体的愈伤组
织的酶带3着色最浅。由于同工酶谱可以反映酶的相对活
性,所以酶带3显示同工酶催化愈伤组织向器官发生的方
向发展,且器官分化程度越高,相对酶活性越大。已分化出
芽和根的愈伤组织还有酶带4,酶带4和酶带3位置接近,
可能是一种与酶带3结构相似的同工酶。由于在产生胚状
体愈伤组织的酶谱中不含此带,说明这是催化胚状体发育
所没有的一种酶,在器官发生中起重要作用,可以作为区
别器官分化和胚状体发生两种形态发生途径的生化指标。
酶是基因的产物,是基因表达的结果。同工酶是一类分
子结构不同而催化同一反应的酶。每一个同工酶的出现可
能在代谢中都有它特殊的作用。同工酶谱的改变在一定程
度上反映了与植物生长、增殖、分化和发育有关的特异性基
因活动,因而在组织分化中通常作为分化的指标[9]。所以,药
用植物培养愈伤组织形态发生过程中过氧化物酶及其同工
酶的变化对于分化机理的研究具有极其重要的意义。
参考文献
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(收稿日期:2006-06-23 修回日期:2006-07-19)
表1 7%分离胶配方
序号 贮液名称 配方量
1 30%Acr.-0.8%Bis. 6.8(mL)
2 1MTis.-HClpH8.8 22.4(mL)
3 1%过硫酸铵 0.8(mL)
4 TEMED 40(μL)
表2 4%浓缩胶配方
序号 贮液名称 配方量
1 30%Acr.-0.8%Bis. 1.3(mL)
2 1MTis.-HClpH6.8 1.3(mL)
3 重蒸馏水 7.1(mL)
4 1%过硫酸铵 0.3(mL)
5 TEMED 15(μL)
表3 不同分化程度的愈伤组织过氧化物酶活性 (n=3)
序号 愈伤组织类型 酶活性(4-邻甲基苯酚/g鲜重/h)
1 松软型未分化的愈伤组织 1.534
2 松软型初生分化芽的愈伤组织 3.006
3 松软型已分化芽和根的愈伤组织 6.716
4 颗粒型产生胚状体的愈伤组织 4.635
实验中医药学
1
2
3
5
a b c d
4
图1 不同分化程度
愈伤组织过氧化物同工酶谱
a.未分化的愈伤组织;b.初生分化芽
的愈伤组织;c.已分化芽和根的愈
伤组织;d.产生胚状体的愈伤组织
-
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