全 文 ：黑果腺肋花楸原生质体分离研究
岳超君 , 张志东 , 吴　林 , 李亚东 , 杨瑞芹
吉林农业大学园艺学院 , 长春 130118
摘　要:为建立有效的原生质体分离体系 , 研究了黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa)原生质体酶解分离纯化
条件。结果表明:黑果腺肋花楸愈伤组织在 20 g/L 纤维素酶+0.5 g/ L果胶酶+13%甘露醇+5 mmol/ L MES
酶解液中黑暗静置酶解 10 h , 可获得高产量高活力的原生质体;采用 500 r/min离心 8 min分离纯化效果最好;
愈伤组织比组培苗叶片分离获得的原生质体产量与活力更高。
关键词:黑果腺肋花楸;原生质体;分离;纯化
中图分类号:S663.9　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2010)06-0639-05
Study on Protoplast Isolation of Aronia melanocarpa Elliott
YUE Chao-jun , ZHANG Zhi-dong , WU Lin , LI Ya-dong , YANG Rui-qin
College of Horticulture , Jilin Agricultural University , Changchun 130118 , China
Abstract:The establishment of efficient protoplast isolation system is one of the essential conditions to
cultivar improvement by using protoplast fusion technique.Studied on conditions of enzymolysis isolation
and purification of Aronia melanocarpa were conducted.The results showed that:the optimized combina-
tion to obtain protoplast with high yield and activity is 20 g/L Cellulase +0.5 g/L Pectinase +13%
mannitol+5 mmol/L MES for 10 h at dark and static condition;centrifugation at 500 r/min for 8 min;
from callus of Aronia melanocarpa rather than from leaves.
Key words:Aronia melanocarpa;protoplast;isolation;purification.
　　黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa Elliott)为
蔷薇科腺肋花楸属落叶灌木 ,是集食用 、药用 、园
林观赏等价值于一身的浆果树种[ 1-2] 。其果实和
植株中富含三萜 、黄酮 、类黄酮等化合物[ 3-4] 。黑
果腺肋花楸具有较强的抗病虫害能力[ 5] 、较强的
抗旱性[ 6]和很强的抗寒性[ 7] ,适宜栽培的范围较
广 ,也适于在寒冷地区栽培。但黑果腺肋花楸果
实中单宁含量高不宜直接鲜食等问题为品种改良
提出了新的要求 。同时果实色素含量高的特点也
可能使其成为被广泛利用的种质资源。黑果腺肋
花楸离体材料适宜在MS 培养基上生长 ,离体叶
片在MS+0.5 ～ 3.0 mg/L NAA上可被诱导出绿色
致密的愈伤组织和根 ,而在 MS +0.1 ～ 3.0 mg/L
2 ,4-D 上可被诱导出白色疏松的愈伤组织 , 在
MS+3.0 mg/L BA+0.5 mg/L NAA培养基上不定
芽分化率为30%[ 8] 。在种质资源创新方面 ,高等
植物的原生质体是遗传转化研究十分理想的受
体 ,同时通过原生质体融合可以克服远缘杂交难
以克服的障碍[ 9] 。本试验对黑果腺肋花楸原生质
体分离条件进行了研究 ,旨在建立高效的原生体
分离技术体系 ,为开展黑果腺肋花楸原生质体的
培养与融合奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　材料与设备
1.1.1　供试材料　供试材料采用由吉林农业大
学小浆果研究所提供的黑果腺肋花楸品种“墨楸”
的组织培养试管苗。

通讯作者
基金项目:公益性行业(农业)科研专项(nyhyzx07-028 , 2006-G25),农业部 948“十一五”重大专项(2006-G25), 吉林省科技发展计划
项目(20080713 ,20060714, 20040112 , 20075013),长春市科技局项目(长科技合 2009153号)
作者简介:岳超君 ,女 ,硕士研究生 ,研究方向:果树生物技术。
收稿日期:2009-12-21　　修回日期:2010-03-14
吉林农业大学学报　2010 ,32(6):639 ～ 643 ,649 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
1.1.2　药品与设备　纤维素酶 R-10(日本产 ,
型号 DH0521-1 ,北京鼎国生物技术有限公司分
装)。果胶酶 Y-23(日本产 ,型号 DH236-1 ,北
京鼎国生物技术有限公司分装),LD5-10型低速
离心机(北京医用离心机厂),HZS-HA 型水浴振
荡器(哈尔滨市东明医疗仪器厂), Ti-S 型倒置
荧光显微镜(日本尼康), CO11 型光学显微镜(日
本奥林巴斯)。
1.2　试验方法与设计
1.2.1　原生质体分离纯化　配制 CPW(CaCl2·
2H2O 1 320 mg/L , KH2PO4·H2O 30 mg/L , MgSO4·
7 H2O 250 mg/L ,KNO3 100 mg/L)溶液。分别配制
不同浓度 CPW—甘露醇溶液和 CPW-30%蔗糖溶
液。采用 CPW溶液按比例配制纤维素酶与果胶
酶混合酶液 ,并加入 5 mmol/L MES(吗啉乙基磺
酸),pH值调至 5.8。上述各溶液均经 0.45 μm微
孔滤膜过滤灭菌 。原生质体培养基为 MS 培养
基[ 10] ,附加 0.5 mg/L 2 , 4-D 、0.25 mg/L 6-BA 、
0.5 mg/L NAA 、90 g/L 葡萄糖 、10 g/L 蔗糖 、
300 mg/L半乳糖 , 0.45 mol/L 甘露醇。培养基 pH
值调至5.8 ,过滤灭菌。
选择在MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培
养基中培养 75 d 的组培苗 ,取顶端 1 ～ 5片完全
展开的叶片 ,在超净工作台上剪成宽 1 ～ 2 mm的
细条 。选择在 MS+2 , 4-D 1.0 mg/L 培养基中培
养15 d的第一代白色松软的愈伤组织 ,用研钵将
其轻轻磨碎 。将欲酶解的材料放入直径 6 cm 的
培养皿中 ,加入酶液(材料与酶液按质量体积比
1∶10),用Parafilm 封口 ,置于(25±1)℃恒温下酶
解。酶解一定时间后进行原生质体纯化 。首先用
孔径 0.12 mm 不锈钢筛网过滤酶解液 ,收集滤液
在10 mL 离心管中进行第一次离心 ,吸取上清液 ,
弃掉 。在离心管中加入 CPW-13%甘露醇溶液 ,进
行第二次离心 ,弃上清液 。用 6 mL CPW-30%蔗
糖溶液将离心管底部的沉淀重新悬浮 ,再沿离心
管内壁慢慢向蔗糖层上面加入 2 mL CPW-13%甘
露醇溶液 ,立即进行第三次离心。小心吸取蔗糖
溶液与甘露醇溶液界面上的原生质体悬浮液于另
外一离心管中 ,立即加入原生质体培养基进行第
四次离心。弃掉上清液 ,向沉淀的原生质体中加
入1 mL 原生质体培养基 ,悬浮备用 。在酶解和离
心纯化过程中 ,除了试验因素的不同水平处理外 ,
均采用相同的条件:20 g/L纤维素酶与1.0 g/L 果
胶酶的混合酶液 , 甘露醇 13%, 黑暗静置酶解
12 h ,离心速度 500 r/min ,离心时间 8 min。
1.2.2　试验设计　原生质体的分离采用组培苗
叶片和愈伤组织2种类型材料。分离原生质体的
酶液采用纤维素酶与果胶酶配制的混合酶液 ,共
设6个处理水平 ,见表 1。酶解溶液中渗透压调
节剂甘露醇含量设 5 个水平:7%, 9%, 11%,
13%,15%。材料酶解过程中采用黑暗静置和黑
暗低速振荡(摇床转速 30 r/min)2种方式。酶解
时间设 5个水平:8 , 10 ,12 , 14 ,16 h 。在原生质体
纯化过程中 ,离心时间设 5 ,8 ,10 min 3个水平 ,离
心速度设 500 ,800 r/min 2个水平 。
表 1　原生质体分离酶液组合
Table 1.Composition and concentration of enzyme solution
for protoplast isolation g/ L
酶液组合
No.of enzyme
solution
纤维素酶
Cellulase R-10 果胶酶Pectinase Y-23
1 20 0.1
2 20 0.5
3 20 1.0
4 20 2.0
5 10 1.0
6 30 1.0
1.2.3　原生质体产量与活力的测定方法　吸取
少量原生质体悬浮液于血球计数板上 ,在显微镜
下观察计数 ,重复 3次 ,计算原生质体总产量。
原生质体分离个数(个/mL)=(5个大格内原
生质体总个数/5)×10×1 000×稀释倍数;原生
质体产量(105/g)=原生质体分离个数/分离材料
的鲜质量 。
采用荧光素双醋酸脂(FAD)法[ 9]进行活力测
定。任选 3个视野调查 ,计算原生质体活力。
原生质体活力=(产生荧光的原生质体数/视
野内可见全部原生质体数)×100%;有效原生质
体产量(105/g)=原生质体产量×原生质体活力。
采用 DPS 数据处理系统对数据进行方差分
析。
2　结果与分析
2.1　酶的种类和质量浓度对原生质体产量和活
力的影响
在原生质体分离过程中 ,酶的种类及其质量
浓度对原生质体产量和活力都有较大影响。当纤
维素酶质量浓度为 20 g/L 时 ,无论是叶片还是愈
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Journal of J ilin Agricultural University 2010 , December
伤组织 ,随着果胶酶质量浓度由 0.1 g/L 增加到
2.0 g/L ,它们的原生质体产量呈现先增加后降低
的变化趋势(图 1),而原生质体活力则随果胶酶
质量浓度提高均出现降低趋势(图 2)。
图 1　酶液成分对黑果腺肋花楸原生质体产量的影
响
Fig.1.Effects of different enzyme compositions on
protoplasts yield of A.melanocarpa
图 2　酶液成分对黑果腺肋花楸原生质体活力的影
响
Fig.2.Effects of different enzyme compositions on
protoplasts viability of A.melanocarpa
　　当果胶酶为 1.0 g/L 时 ,纤维素酶为 10 g/L
的处理原生质体产量最低 ,其次是 30 g/L 处理 ,
最高的是 20 g/L处理 ,且20 g/L处理原生质体活
力也最高。从上述结果看 ,无论纤维素酶还是果
胶酶 ,浓度高时对原生质体的产量和活力都不利。
从材料种类看 ,愈伤组织原生质体产量和有效原
生质体产量普遍高于叶片(图 1 ,图 3);愈伤组织
原生质体活力普遍略低于叶片 ,且最高活力均出
现在 20 g/L纤维素酶与 0.1 g/L 果胶酶的酶液组
合。从有效原生质体产量看 , 20 g/L纤维素酶与
1.0 g/L果胶酶最适合叶片和愈伤组织原生质体
分离 ,并且采用愈伤组织的效果好于组培苗叶片。
其中愈伤组织的原生质体最高产量是叶片的 1.3
倍。
图 3　酶液成分对黑果腺肋花楸原生质体有效产量
的影响
Fig.3. Effects of different enzyme compositions on
protoplasts effective yield of A.melanocarpa
2.2　渗透压对原生质体产量的影响
不同甘露醇体积分数调节的渗透压对分离原
生质体产量的影响见图 4。
图 4　酶液中甘露醇含量对黑果腺肋花揪原生质体
产量的影响
Fig.4.Effects of mannite content in enzyme liquid on
protoplasts yield of A.melanocarpa
　　当酶液中甘露醇为 7%时 ,无论是叶片还是
愈伤组织其原生质体产量均很低 ,分别为 0.27×
10
5/g 和 1.52×105/g 。随着酶液中甘露醇添加量
的增大原生质体的产量也逐渐升高 。13%甘露醇
处理的叶片和愈伤组织原生质体产量均达到最
高 ,分别为 10.8×105/g 和 13.7×105/g 。但酶液
中甘露醇达到 15%时 ,原生质体产量明显下降。
原因可能是低浓度甘露醇产生的渗透压引起了原
生质体破裂 ,而高浓度甘露醇渗透压不能使原生
质体释放。在各个处理中 ,愈伤组织的原生质体
641岳超君等:黑果腺肋花楸原生质体分离研究
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
产量始终高于叶片的原生质体产量 。
2.3　酶解方式及时间对原生质体产量的影响
在摇床上黑暗低速振荡(30 r/min)酶解和黑
暗静置酶解不同时间的原生质体产量见表 2 。低
速振荡酶解时叶片原生质体产量最高值出现在酶
解12 h ,达到 12.56×105/g 。静置酶解的最高值
亦出现在酶解 12 h ,达到 13.53×105/g ,显著地高
于低速振荡酶解方式。在其他酶解时间段内 ,黑
暗静置方式获得的产量均显著高于低速振荡酶解
方式的产量。愈伤组织在这 2种方式酶解过程中
原生质体产量也表现出与叶片酶解的规律相同 ,
但原生质体产量最高值出现的时间比叶片提前
2 h ,均在酶解 10 h时 ,低速振荡和静置酶解的最
高产量分别达到 13.46×105/g 和 13.86×105/g ,
均高于相同酶解方式中叶片的原生质体产量 。所
以选择黑果腺肋花楸愈伤组织作为酶解材料是快
速获得高产原生质体的一种有效方法。这可能与
愈伤组织结构比较松散 、细胞间隙较大 、细胞间填
充物少 、酶液容易迅速发生作用等因素有关 。
表 2　酶解时间和酶解方式对黑果腺肋花楸原生质体产量的影响
Table 2.Effects of enzymolysis time and mode on yield of protoplasts of A.melanocarpa
酶解方式
Enzymolysis mode
酶解时间/ h
Enzymolysis time
原生质体产量/(105·g -1)
Yield of protoplasts
叶片 Leaf 愈伤组织 Callus
黑暗低速振荡(30 r/min)
Dark slow shake
8 8.63f 11.56d
10 9.36e 13.46b
12 12.56b 10.56f
14 10.50d 9.09i
16 8.80f 9.80g
黑暗静置
Dark stat ic
8 9.20e 11.83c
10 10.36d 13.86a
12 13.53a 11.00e
14 11.20c 9.50h
16 9.34e 10.52f
2.4　纯化离心时间和离心速度对原生质体产量
和活力的影响
控制适当的离心速度和离心时间对获得高产
原生质体很关键。由表 3可见 ,经过 3次纯化离
心后 ,以 500 r/min离心速度处理 8 min时叶片和
愈伤组织原生质体的产量均最高 ,分别为13.30×
10
5/g 和 13.40×105/g;以 800 r/min离心 5 min的
处理产量最高 ,叶片和愈伤组织的产量分别为
12.20×105/g 和 12.10×105/g 。而离心时间延长
(如 500 r/min 离心 10 min 和 800 r/min 离心 8 ,
10 min)会出现产量降低现象。从有效原生质体
产量看 ,500 r/min离心 8 min处理显著高于其他
处理 。
在离心速度 500 r/min 和 800 r/min 下 ,离心
5 min 和 8 min处理的原生质体的活力均保持较
高水平(89.00%～ 90.86%),且处理之间没有显
著差异(表3)。但延长离心时间到 10min时 ,2种
离心速度均引起原生质体活力下降(最低为
71.67%)。离心力持续长时间的作用引起部分原
生质体破裂或失活 ,可能是导致原生质体产量和
活力降低的原因之一 。
表 3　离心时间和速度对黑果腺肋花楸原生质体产量和活力的影响
Table 3.Effects of speed and time of centrifugation on yield and viability of protoplasts of A.melanocarpa
材料
Materials
离心速度/
(r·min-1)
Speed of centrifugation
离心时间/min
Time of centrifugation
原生质体产量/
(105·g -1)
Yield of protoplasts
原生质体活力/ %
Viabi lity of
protoplasts
有效原生质体产量/
(105·g -1)
Effective yield
of protoplast
5 7.60e 90.67a 6.89d
500 8 13.30a 90.33a 12.03a
叶片
Leaf
10 6.27f 83.00b 5.20e
5 12.20b 90.33a 11.02b
800 8 10.30c 89.60a 9.24c
10 5.30g 71.67d 3.86f
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Journal of J ilin Agricultural University 2010 , December
续表 3
材料
Materials
离心速度/(r·min-1)
Speed of centrifugation
离心时间/min
Time of centrifugation
原生质体产量/(105·g -1)
Yield of protoplasts
原生质体活力/ %
Viabi lity of
protoplasts
有效原生质体产量/(105·g -1)
Effective yield
of protoplast
5 7.47e 90.71a 6.78d
500 8 13.40a 90.00a 12.05a
愈伤组织
Callus
10 6.24f 80.00c 5.03e
5 12.10b 90.86a 11.94b
800 8 9.40d 89.00a 8.37c
10 5.70g 72.33d 4.14f
3　讨论与结论
越来越多的学者认为 ,起始材料是影响植物
原生质体分离和培养的重要因素 。吕长平等[ 11]
对刺葡萄 、黄枝英等[ 12] 对荔枝和李敬阳等[ 13]对
香蕉的研究结果表明 ,采用愈伤组织作为分离原
生质体的材料 ,均获得高活力原生质体 。其中刺
葡萄[ 11]愈伤组织分离原生质体产量高达 5.12×
10
6个/g ,高出叶片产量 20倍 ,活力高达 88.57%。
本研究采用黑果腺肋花楸愈伤组织作为起始材料
分离出的原生质体产量高 、活力高 ,优于组培苗叶
片材料 ,与上述的同类研究结果一致。
用于植物分离原生质体的酶类制剂主要有纤
维素酶 、半纤维素酶 、果胶酶和离析酶等 。冬枣花
药愈伤组织[ 14]和荔枝转基因胚性愈伤组织[ 12]原
生质体分离均采用纤维素酶和离析酶配比;在刺
葡萄[ 11] 和草莓[ 15] 原生质体分离中 ,采用纤维素
酶 、果胶酶和离析酶 3种酶。本试验采用纤维素
酶和果胶酶组合所获得的原生质体分离效果与香
蕉[ 13]愈伤组织原生质体分离效果相一致 ,但与人
参[ 16]愈伤组织细胞悬浮系所使用的 10 g/L纤维
素酶和5 g/L果胶酶浓度不同。
张学英等[ 15] 、黄枝英等[ 12]和吕长平等[ 11]在
草莓 、荔枝和刺葡萄的原生质体分离中均采用摇
床振荡获得高产量高活力的原生质体 ,与本试验
黑暗静置分离方式效果优于摇床振荡方式的结果
不同 ,其原因有待进一步探讨 。
本试验中采用 13%(0.7 mol/L)甘露醇调节
酶液渗透压时获得的原生质体产量最高 。在毛叶
枣与冬枣[ 17] 、巴西蕉[ 13] 、草莓[ 15] 、苹果[ 18]等原生
质体分离中 ,用 13%(0.7 mol/L)甘露醇也均获得
了高产量的原生质体 。但在刺葡萄原生质体分离
中用 9%(0.5 mol/L)甘露醇获得了高产量 、高活
力的原生质体[ 11] ,在皇帝蕉的原生质体分离时用
11%(0.6 mol/L)甘露醇产量和活力最高[ 13] 。说
明不同植物原生质体分离过程中所需要维持的渗
透压存在差异 。
在本试验中 ,以黑果腺肋花楸为材料进行的
原生质体分离过程中 ,采用愈伤组织比组培苗叶
片分离获得的原生质体产量与活力更高;最佳酶
液组成为 20 g/L 纤维素酶 +0.5 g/L 果胶酶+
13%甘露醇+5 mmol/L MES;在黑暗静置条件下
酶解 10 h ,并采用 500 r/min离心 8 min可获得高
产量高活力的原生质体。
参考文献:
[ 1] 　韩文中 ,马兴华.黑果腺肋花楸的生物学特性和应用价值
[ J] .辽宁林业科技 , 2005(4):40-42.
[ 2] 　姜镇荣 ,韩文中 , 郑崇玲 , 等.黑果腺肋花楸在干旱半干旱
地区的发展应用[ J] .林业实用技术 , 2007(9):14-15.
[ 3] 　于明 ,李宪.黑果腺肋花楸幼苗的化学成分[ J] .沈阳医科大
学学报 , 2006 , 7(23):425-426.
[ 4] 　Rune Slimestad , Kjell Torskangerpoll , Haavard S Nateland , et al.
Flavonoids from black chokeberries , Aronia melanocarpa[ J] .Jour-
nal of Food Composition and Analysis , 2005 , 18:61-68.
[ 5] 　姜镇荣 ,韩文忠 , 马兴华 , 等.黑果腺肋花楸病虫害特点及
其防治方法[ J] .防护林科技 , 2007 ,3(70):39-40.
[ 6] 　韩文中 ,马兴华.黑果腺肋花楸抗旱生理的初步研究[ J] .辽
宁林业科技 , 2004(6):12-14.
[ 7] 　Kashin V I , Kosyakin A S , LatushkinV A.Aronia a promising fruit
crop[ J] .Sadovodstvoi Vinogradarstvo ,1994(2):10-11.
[ 8] 　张春雨 ,张志东 , 李亚东 , 等.植物生长调节物质对黑果腺
肋花楸离体叶片愈伤组织诱导及再分化的影响[ J] .吉林农
业大学学报 , 2005 , 27(4):396-400.
[ 9] 　李浚明 ,朱登云.植物组织培养教程 [ M] .3版.北京:中国
农业大学出版社 , 2005:178-223.
[ 10] 　肖望 ,黄霞 ,魏岳荣 ,等 .`过山香 香蕉原生质体培养及植
株再生[ J] .园艺学报 , 2008 ,35(6):873-878.
(下转第 649页)
643岳超君等:黑果腺肋花楸原生质体分离研究
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
0.2 ～ 0.8时转化效率随侵染时间的延长先增加后
降低 ,随侵染时间的延长愈伤组织存活下降 ,从而
减少了抗性不定芽的分化 ,菌液侵染浓度(OD600)
为0.8 、侵染时间为 30 min 时 , 转化效率最高达
17.95%。试验结果表明转化愈伤组织 GUS 瞬时
转化表达成功 ,建立了农杆菌侵染紫穗槐茎段诱
导的愈伤组织遗传转化的体系 。GFP基因对紫穗
槐遗传转化的抗性 T0代植株 PCR检测结果表明
转化植株中外源基因达 85%,说明建立的农杆菌
转化紫穗槐的转化体系转化率较高而且较稳定。
参考文献:
[ 1] 　侯宽昭.中国种子植物科属词典[ M] .北京:科学出版社 ,
1982:261.
[ 2] 　赵淑梅 ,张从景.紫穗槐的综合利用及栽培技术[ J] .防护林
科技 , 2005 , 66(3):125-126.
[ 3] 　DeHaan1 L R , Ehlke N J , Sheaer C C , et al.Evaluation of diver-
sity among North American accessions of false indigo(Amorpha fru-
ticosa L.)for forageand biomass[ J] .Genetic Resources and Crop
Evolution, 2006, 53:1463-1476.
[ 4] 　Papanastasis V P , Platis P D , Dini-Papanastasi O.Productivi ty of
deciduous woody and fodder species in relation to air temperature
and precipitation in a Mediterranean environment [ J] .Agroforestry
Systems , 1997 ,37:187-198.
[ 5] 　姜泓 ,白丽萍 , 康廷国 , 等.紫穗槐果实化学成分[ J] .中药
材 , 2005 , 28(1):192-201.
[ 6] 　Jauhar P P.Cytogenetics of the Festuca-Lolium complex.Relevance
to breeding[ C] ∥Frankel R , Grossman M , Linskens H F , et al.
Monographs on theoretical and applied genetics.New York:Springer
Berlin Heidelberg , 1993.
[ 7] 　管清杰 ,罗秋香.紫穗槐茎段愈伤组织诱导及再生体系的建
立[ J] .辽宁林业科技 , 2009(6):8-11.
[ 8] 　Jefferson R A , Kavanagh T A , Bevan M W.GUS fusion:β-glu-
curonidase as a sensitive and versati le gene fusion marker in higher
plants[ J] .EMBO J , 1987 ,6:3901-3907.
[ 9] 　王瑾 ,唐益苗 ,赵昌平 ,等.转基因植物检测技术研究进展
[ J] .科技导报 ,2008 , 26(23):88-93.
[ 10] 　Shimomura O , Johnson F H , Saiga Y.Extraction , purification
and properties of aequorin , a bioluminescent protein from the lu-
minous hydromedusan , aequorea [ J] .J Cell Comp Physiol ,
1962 ,59:223-239.
[ 11] 　Jefferson R A.GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and
versatile gene fusion markerin higher plants[ J] .EMBO Journal ,
1987 ,6:3901-3907.
[ 12] 　Leslie E Sieburth , Meyerowitz E M.Molecular dissection of the
AG AMOUS control region shows that cis elements for spatial reg-
ulation are located intragenically[ J] .Plant Cell , 1997 , 9(3):
355-365.
[ 13] 　Sambrook J , Russell D W , Huang P T , et al.Molecular cloning:
a laboratory manual[ M] .3rd ed.Beijing:Science Press , 2002:
461-509.
[ 14] 　关淑艳 ,王丕武 ,刘广娜 ,等.玉米淀粉分支酶 sbe2a 基因反
义载体的构建及其转基因初步研究[ J] .吉林农业大学学
报 , 2009, 31(4):360-363.
[ 15] 　杨英军 ,周鹏.转基因植物中的标记基因研究新进展[ J] .
遗传 , 2005, 27(3):499-504.
(上接第 643页)
[ 11] 　吕长平 ,石雪晖 ,徐艳 ,等.刺葡萄原生质体分离研究[ J] .
湖南农业大学学报:自然科学版 , 2005 , 31(4):392-395.
[ 12] 　黄枝英, 赖钟雄.荔枝转基因胚性愈伤组织原生质体分离
条件的优化[ J] .福建农林大学学报:自然科学版, 2006 , 35
(3):266-271.
[ 13] 　李敬阳 ,张建斌 ,徐碧玉 ,等.香蕉愈伤组织原生质体分离
研究[ J] .分子植物育种 ,2008 , 6(4):819-824.
[ 14] 　刘晓光 ,刘孟军 ,宁强 ,等.冬枣花药愈伤组织的诱导及原
生质体分离[ J] .中国农学通报 , 2009 , 25(2):100-104.
[ 15] 　张学英 ,葛会波 ,刘艳萌 ,等.草莓原生质体分离条件的研
究[ J] .分子植物育种 ,2006 , 4(6):147-152.
[ 16] 　王义 ,杨晶 ,张颖 ,等.人参原生质体的分离培养[ J] .吉林
农业大学学报 , 2009 ,31(3):268-272.
[ 17] 　赵维峰,孙光明.毛叶枣与冬枣原生质体分离体系的建立
[ J] .热带作物学报 , 2006, 27(3):51-54.
[ 18] 　潘增光,邓秀新.苹果原生质体分离培养及植株再生[ J] .
园艺学报 , 2000 ,27(2):95-101.
649管清杰等:农杆菌介导的紫穗槐茎段愈伤组织遗传转化研究
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University