全 文 ：第 27 卷　第 3期
2005 年 5 月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.27 , No.3
Mar , 2005
收稿日期:2004--03--30
http: journal.bjfu.edu.cn
基金项目:国家留学基金管理委员会资助项目.
第一作者:李艳菊 ,博士生 ,副教授.主要研究方向:经济植物利用.电话:010- 86800188　Emai l:liyanju@hotmail.com　现工作单位地址:
100081 北京中关村南大街 12号中国农科院农业资源与农业区划研究所.
元 宝 枫 组 织 培 养 研 究
李艳菊 陶加洪
(北京林业大学资源与环境学院) (山东博兴县京博集团)
王兰珍 久岛 繁
(北京林业大学生物科学与技术学院) (日本筑波大学应用生物化学系)
摘要:该文对元宝枫茎段组织培养中的外植体灭菌 、褐变预防 、增殖培养 、根诱导等进行了试验研究.结果表明:元
宝枫外植体最佳取材时期为 4月份 , 由 4年生和 20 年生母树上取材的外植体 , 经0.1%HgCl2 灭菌 6 min 后 ,污染率
分别降为 16.67%和 14.29%;对于 4 龄和 20 龄母树上取材的外植体进行培养时 , 在培养基中分别添加 500 及 750
mg L PVP ,可以较好地控制褐变;当MS 培养基中附加 0.01 ～ 0.05 μmol L TDZ 时 ,可有效地促进外植体增殖和生长;
适宜的生根培养基为1 2MS+0.1 μmol L IBA , 每天光照 16 h , 生根率可达 90.91%;幼苗经炼苗后盆栽 , 成活率在
95%以上.
关键词:元宝枫 , 组织培养 ,灭菌 , 褐变 ,快速繁殖
中图分类号:S792.35　　文献标识码:A　　文章编号:1000--1522(2005)03--0104--04
LI Yan-ju1;TAO Jia-hong2;WANG Lan-zhen3;HISAJIMA Shigeru4.Tissue culture of Acer truncatum.
Journal of Beijing Forestry University(2005)27(3)104--107[Ch , 12 ref.]
1 College of Resources and Environment , Beijing Forestry University ,100083 ,P.R.China;
2 Jingbo Group ,Boxing County ,Shandong Province ,256500 ,P.R.China;
3 College of Biological Sciences and Biotechnology , Beijing Forestry University ,100083 ,P.R.China;
4 Institute of Applied Biochemistry ,University of Tsukuba , Ibaraki 305 Japan.
The stem segments of Acer truncatum were used as explants to study sterilization techniques , browning
prevention , proliferation and rooting in vitro.The results show that the optimum season for explant collection is
April , the contamination rates of the explants from the 4- and 20-years-old trees are 16.7% and 14.3% after
the explants are sterilized in 0.1%aqueous mercuric chloride for 6 min;for the explants from the 4- and 20-
years-old trees the addition of PVP of 500 mg L and 750 mg L in the medium can prevent browning effectively.
The MS medium containing 0.01 ～ 0.05μmol L TDZ is most efficient in the proliferation of Acer truncatum.
The ratio of rhizogenesis is 90.91% in the optimum rooting medium of 1 2 MS medium supplemented with
0.1μmol L IBA and under 16 h of photoperiod;the survival ratio of transplanting is 95% after training
seedling.
Key words　Acer truncatum , tissue culture , sterilization ,browning , propagation
　　元宝枫(Acer truncatum Bunge)属槭树科落叶乔
木 ,是一种集油料 、蛋白 、鞣料 、医药 、观赏和生态效
益等于一身的经济树种[ 1] .目前生产上主要采用播
种育苗方式进行繁殖 ,得到的苗木良莠不齐.无性繁
殖虽然能保持母株优良特性 ,但由于该树种扦插难
成活[ 2] ,嫁接技术要求高且优质母穗数量有限等原
因[ 3] ,使得优良种质推广受到限制.有关元宝枫组织
培养方面的研究 ,国内外少见报道.为了加快元宝枫
优树快繁和推广 ,本文对元宝枫组织培养中外植体
灭菌 、防褐变方法 、增殖培养以及根诱导等关键技术
问题进行了探索研究.
1　材料与方法
1.1　材　料
在陕西杨凌地区 ,于 2001 、2002年 4月 、6月和
10月 ,分别采集元宝枫不同龄级母树上的当年生枝
DOI :10.13332/j.1000-1522.2005.03.023
条作试材.
1.2　方　法
1.2.1　外植体的灭菌
从元宝枫母树上采集枝条 , 剪去叶片(留叶柄
1.00 cm左右),将枝条切割成 1.5 ～ 2.0 cm 长的带
腋芽茎段 ,浸泡在饱和洗衣粉水中 4 ～ 5 min 后 ,流
水冲洗2 ～ 3 h ,转入 70%的酒精中处理 30 s ,然后分
别选用饱和漂白粉溶液 、10%的 H2O2 或 0.1%的
HgCl2 等灭菌剂进行灭菌处理 ,最后用无菌水冲洗 4
～ 6遍 ,接种于 MS+TDZ 0.01 μmol L 培养基上.每
个处理接种 30 ～ 40个外植体 ,培养 2个星期时 ,统
计外植体污染 、褐变和存活生长状况 ,并按下式计算
有关参数:
污染率=污染株数/接种株数×100% (1)
褐变死亡率=褐变死亡株数/接种株数×100% (2)
存活率=(接种株数-污染株数-褐变死亡株数)/
　　接种株数×100% (3)
1.2.2　抗氧化剂和吸附剂处理
在培养基中添加抗氧化剂维生素C(Vc)和硫代
硫酸钠(SH),吸附剂活性炭(AC)和聚乙烯吡咯烷酮
(PVP),每个处理接种 30个外植体 ,在接种后的第 7
d 观测培养基中褐色斑点直径大小 ,比较各附加物
对褐变的抑制效果.
1.2.3　生长调节剂正交试验
以MS 为基本培养基 ,选定 Thidiazuron(TDZ)、
Indole-3-butyric acid(IBA)和 Zeatin(ZT)3 种生长调
节剂进行 L9(34)正交试验 ,接种培养 4周时 ,观测茎
段抽枝数量和抽枝高度 ,确定茎段生长的最佳生长
调节剂添加量.培养温度(27±2)℃,光照强度 2 000
～ 2 500 lx ,每日光照 16 h.
1.2.4　生根培养和移植
将长度约为 2 cm 的嫩茎剪下 ,转入 MS 、1 2MS
生根培养基中 ,进行根的诱导.培养基中附加蔗糖
10 g L、gellum gum 2 g L和不同浓度的 IBA(0 、0.10 、
1.00 、5.00 μmol L),在光照周期为 16和 12 h d条件
下培养 30 d ,统计生根率 、生根条数和根长度等指
标.
生根幼苗移入灭过菌的泥炭土∶珍珠岩∶蛭石为
1∶1∶1的基质中 ,炼苗 2星期 ,移入盆中栽植.
2　结果与分析
2.1　外植体表面灭菌方法与取材时间
2.1.1　不同灭菌剂的灭菌效果
由试验得知(见表 1), 3 种不同的灭菌剂 ,对 4
月份采集的元宝枫茎段的灭菌效果不同.其中以
HgCl2 灭菌效果最好 ,污染率 、褐变死亡率相对最
低 ,其次为饱和漂白粉水溶液处理 , H2O2 的灭菌效
果最差 ,其存活率最低.
表 1　不同灭菌剂对外植体灭菌效果 %
TABLE 1　Effects of sterilization on explants with
different sterilization matters
灭菌处理
母树龄级
4年生
污染率 褐变死亡率 存活率
20年生
污染率 褐变死亡率 存活率
0.1%HgCl2 5 min 23.8 12.4 63.8 24.5 13.0 62.5
饱和漂白粉水 15min 29.6 26.5 43.9 23.5 33.0 43.5
10%H2O2 10 min 44.7 50.0 5.3 42.5 45.0 12.5
2.1.2　外植体取材时间的确定
选用 0.1%HgCl2 ,对 4月 、6 月和 10 月份采集
的元宝枫外植体进行不同时间灭菌处理.结果(见表
2 、3)显示 ,随着 HgCl2 灭菌时间延长 ,污染率降低 ,
但是褐变死亡率升高 ,存活率下降;4月份取材于 4
年生和 20年生母树上的外植体 ,用 0.1%HgCl2 灭
菌 6 min效果最好 ,污染率可分别控制在 16.7%和
14.3%,存活率最高 ,可分别达到 67.6%和 71.1%;
对 6月份采集的外植体 ,用 0.1%HgCl2 灭菌 3 min
较好 ,污染率和褐变死亡率相对较低 , 4年生和 20
年生两个龄级外植体的存活率分别为 48.0%和
47.7%;进入 10月份 ,元宝枫当年生枝条已经木质
化 ,树芽逐渐进入休眠状态 ,此时采集的外植体经
70%酒精处理 30 s后 ,分别使用 0.1%HgCl2 灭菌 5
～ 12 min ,接种的外植体全部污染和发生褐变 ,即污
染率和褐变率均为 100%.所以 ,不宜在 10月份采集
元宝枫组培材料.
表 2　4 月份采集的元宝枫外植体灭菌效果比较 %
TABLE 2　Effects of sterilization on explants collected
in April with different sterilization time
0.1%HgCl2
处理时间 min
母树龄级
4年生
污染率 褐变死亡率 存活率
20年生
污染率 褐变死亡率 存活率
5 23.8 12.4 63.8 24.5 13.0 62.5
6 16.7 15.7 67.6 14.3 14.6 71.1
8 13.5 34.2 52.3 13.5 21.5 65.0
12 10.3 40.8 48.9 9.3 37.2 53.5
表 3　6 月份采集的元宝枫外植体灭菌效果比较 %
TABLE 3　Effects of sterilization on explants collected
in June with different sterilization time
0.1%HgCl2
处理时间 min
母树龄级
4年生
污染率 褐变死亡率 存活率
20年生
污染率 褐变死亡率 存活率
3 25.0 27.0 48.0 26.8 25.5 47.7
4 24.0 29.0 47.0 26.8 26.5 46.7
5 22.3 40.6 37.1 24.0 37.1 38.9
105第 3期 李艳菊等:元宝枫组织培养研究
　　综上所述 ,元宝枫茎段外植体的灭菌效果随采
样时期不同存在较大差异.4 ～ 6 月份取材 ,能达到
较好的灭菌效果 ,尤其以 4 月份是元宝枫初代培养
的最佳取材时期.10月份采集的外植体 ,因污染 、褐
变严重 ,故不宜在此期间取材.
2.2　不同抗氧化剂和吸附剂对预防褐变的效果
在对元宝枫茎段培养时发现 ,外植体褐变非常
严重.为此 ,选用不同抗氧化剂和吸附剂 ,对元宝枫
外植体褐变的抑制效果进行比较研究.结果(见表
4)表明 ,PVP 抑制元宝枫外植体褐变的效果最好 ,其
次为活性炭(AC),最差的为硫代硫酸钠(SH)和维生
素C(Vc).比较两个母树龄级的试验结果可知 ,4年
生比 20年生树上采集的外植体褐变程度要轻.
在上述试验基础上 ,对培养基中添加不同浓度
的PVP 进行试验 ,结果(见表 5)显示 ,随着 PVP 添加
量的增加 ,外植体褐变减轻.PVP适宜的添加量随着
母树龄级的不同而有差异 ,对 4龄和 20龄母树的外
植体进行初代培养时 , 在培养基中分别添加
500 mg L和750 mg L的 PVP ,可以较好地控制褐变.
表 4　抗氧化剂和吸附剂对控制元宝枫外植体褐变的影响
TABLE 4　Effects of antioxidant and adsorbent on browning
prevention in vitro
附加物
种类 加入量 (mg·L-1)
母树龄级
4年生
褐斑直
径 cm 斑点色泽
20年生
褐斑直
径 cm 斑点色泽
CK 0 0.9 浅褐 1.3 褐色
Vc 10 0.7 浅褐 0.9 褐色
SH 1 000 0.9 褐色 0.9 褐色
AC 500 0.5 淡褐 0.8 浅褐
PVP 500 0.0 无色 0.2 色淡
表 5　PVP不同浓度对控制元宝枫外植体褐变的影响
TABLE 5　Effects of different levels of PVP on browning
prevention in vitro
PVP添加量
(mg·L-1)
母树龄级
4年生
褐斑直径 cm 斑点色泽
20年生
褐斑直径 cm 斑点色泽
0 0.8 浅褐 1.2 褐色
250 0.1 淡褐 0.2 淡褐
500 0 无色 0.1 浅棕
750 0 无色 0 无色
2.3　生长调节剂正交组合对茎段生长的影响
首先对 TDZ 、BAP(N--benzylaminopurine)和 ZT 等
生长调节剂不同浓度单因素进行试验 ,发现 TDZ 对
元宝枫外植体的生长促进作用最大 ,其次为 ZT.在
此基础上 ,选择 TDZ 、IBA和 ZT 3种生长调节剂 ,进
行 L9(34)正交试验 ,观测不同处理对侧芽萌发成枝
数量和抽枝高度的影响 ,试验结果见表 6.
由极差数据分析得知 ,在诱导枝条数量方面 ,3
种生长调节剂的最佳配比为A3B1C3 ,其对应浓度分别
为TDZ 0.05μmol L、IBA 0μmol L、ZT 0.50μmol L ,其
中 ,TDZ 的作用最大 ,其极差值为 0.46 ,其次为 IBA ,
ZT的影响作用较小;在促进高生长方面 ,3种生长调
节剂的最优组合为A2B3C2 ,其对应浓度依次为 TDZ
0.01 μmol L、IBA 0.10 μmol L、ZT 0.10 μmol L ,其中 ,
TDZ 促进高生长作用最大 ,其极差值为 0.45 , IBA 和
ZT的作用相对较小 ,极差值分别为 0.11和0.10.
表 6　生长调节剂 L9(34)正交试验排列及试验结果
TABLE 6　Results of treatments crossed with all factors
with different levels
培养基
编号
A(TDZ)
(μmol·L -1)
B(IBA)
(μmol·L-1)
C(ZT)
(μmol·L-1)
枝条数量＊
>0.5 cm
抽枝高
度＊＊ cm
1 1(0.005) 1(0) 1(0) 1.10 2.33
2 1(0.005) 2(0.01) 2(0.10) 1.00 2.11
3 1(0.005) 3(0.10) 3(0.50) 1.00 2.50
4 2(0.01) 1(0) 2(0.10) 1.33 2.91
5 2(0.01) 2(0.01) 3(0.50) 1.43 2.81
6 2(0.01) 3(0.10) 1(0) 1.00 2.56
7 3(0.05) 1(0) 3(0.50) 1.60 2.37
8 3(0.05) 2(0.01) 1(0) 1.50 2.54
9 3(0.05) 3(0.10) 2(0.10) 1.38 2.73
枝 K1 1.03 1.34 1.20
条 K2 1.25 1.31 1.24
数 K3 1.49 1.13 1.34
量 极差 R 0.46 0.22 0.14
抽 K1 2.31 2.54 2.48
枝 K2 2.76 2.49 2.58
高 K3 2.55 2.60 2.56
度 极差 R 0.45 0.11 0.10
注:＊为长度大于 0.5 cm的枝条数量;＊＊为各株幼苗最大抽枝高度的
平均值.
2.4　根的诱导培养
由表 7得知 ,在基本培养基为 MS的条件下 ,每
天光照 12 和 16 h , 幼茎的最高生根率分别为
16.67%和 72.73%;而在 1 2MS培养基中 ,每天光照
16和 12 h ,幼茎的最高生根率可分别高达 90.91%
和 80.0%.由此可见 ,每天光照 16 h有助于元宝枫
幼茎生根 ,而且1 2MS培养基优于MS培养基.
由试验结果同时得知 ,随着培养基及光照时间
的不同 ,适宜的 IBA添加浓度不同.当 IBA的添加浓
度为0.1 μmol L ,培养基为 1 2MS ,每天光照 16 h 时 ,
幼茎的生根率最高为90.91%,平均根长为 3.79 cm.
2.5　移　植
将已生根的元宝枫试管苗从培养瓶中取出 ,用
无菌水冲洗干净根部的培养基后 ,移入已灭过菌的
由泥炭土∶珍珠岩∶蛭石为 1∶1∶1 组成的培养基质
中 ,保持高湿度培养 7 d左右 ,然后逐渐降低湿度 ,
继续培养 1 周左右后 ,转入盆中栽植 ,成活率达到
95%以上.
106 北　京　林　业　大　学　学　报 第 27卷　
表 7　诱导生根试验结果
TABLE 7　Experimental results of root induction
培养基 IBA 浓度 (μmol·L-1)
12 h光照
生根
率 %
生根条
数 株
平均根
长 cm
16 h光照
生根
率 %
生根条
数 株
平均根
长 cm
MS 0 — — — 16.32 1.00 4.64
MS 0.10 12.50 2.00 6.80 72.73 1.25 4.68
MS 1.00 16.67 3.06 0.84 45.45 2.40 4.43
MS 5.00 12.50 3.10 0.60 33.33 2.25 4.41
1 2MS 0 — — — 32.11 1.23 4.71
1 2MS 0.10 62.50 2.20 2.28 90.91 1.70 3.79
1 2MS 1.00 80.00 4.25 2.99 41.18 2.60 3.33
1 2MS 5.00 33.33 7.67 2.65 22.22 2.50 2.84
3　结论与讨论
试验结果显示 ,元宝枫不同时期取材 ,外植体的
污染率 、褐变死亡率和存活率不同.其中 , 4月份枝
条抽生旺盛 ,分生能力强 ,为元宝枫初代培养的最佳
取材时期 ,由母树上采集的当年生嫩茎段 ,经 70%
的酒精处理 30 s ,0.1%HgCl2 溶液处理 6 min ,外植
体的污染率 、褐变死亡率相对较低 ,存活率最高;6
月份采集的外植体的存活率次之;进入 10月份后 ,
由于外植体灭菌困难 ,而且褐变严重 ,故不宜采集组
培试材.
在许多植物组织培养中 ,减轻和控制外植体褐
变是一项重要的研究内容.组培过程中褐变的发生
与多酚氧化酶(PPO)活力及总酚含量等有关[ 4-6] ,在
培养基中加入抗氧化剂和吸附剂等可以起到抑制或
减轻褐变的作用[ 4, 5] .元宝枫叶片和枝条中分别含有
11.4%和 7.91%单宁[ 7] ,组培时 ,外植体容易发生褐
变.由试验得知 ,在培养基中加入 PVP 可以较好地
防止元宝枫外植体褐变.PVP 适宜的添加量随着母
树龄级不同而有差异 ,对取材于4龄或 20龄母树上
的外植体进行培养时 ,在培养基中分别添加 500和
750 mg L的 PVP ,可以较好地控制褐变.
TDZ是一种有效的细胞分裂素[ 8] ,对外植体芽
的增殖和生长具有较好的促进作用 ,目前 ,已在不少
的木本植物及 槭(Acer saccharinum)等槭属植物组
培中得到应用[ 9-12] .通过试验发现 , 在元宝枫组培
中 ,TDZ对促进外植体增殖生长作用明显 ,适宜的添
加浓度为 0.01 ～ 0.50μmol L.在诱导枝条数量方面 ,
生长调节剂最佳浓度配比为 TDZ 0.50 μmol L、ZT
0.50μmol L;在促进高生长方面 ,生长调节剂的最优
浓度配比为 TDZ 0.01 μmol L、IBA 0.10μmol L、ZT
0.10μmol L.
在 1 2MS 培养基中 ,附加0.1μmol L IBA ,每天
光照 16 h ,元宝枫幼茎生根率最高 ,为 90.91%.幼苗
经炼苗后盆栽 ,成活率达 95%以上.
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(责任编辑　董晓燕)
107第 3期 李艳菊等:元宝枫组织培养研究