全 文 ：2013 年第 3 期 植物检疫 PLANT QUARANTINE Vol.27 No. 3
DNA条形码在检疫性杂草银毛龙葵鉴定中
的应用研究
张 伟1 范晓虹2* 邵秀玲3 熊玉芬2 李春喜4
（1. 山东大学（威海）海洋学院 山东威海 264209；2.中国检验检疫科学研究院；3.山东出入境检验检疫局；4. 威海出入境检验检疫局）
Applying DNA barcode to identify quarantine weed Solanum elaeagnifolium Cav. Zhang Wei1,Fan
Xiaohong2*,Shao Xiuling3,Xiong Yufen2,Li Chunxi4(1.Marine College, Shandong University at Weihai, Weihai
264209,China;2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine;3. Shandong Entry - Exit Inspection and Quarantine
Bureau;4.Weihai Entry - Exit Inspection and Quarantine Bureau)
Abstract Solanum elaeagnifolium Cav. is an important quarantine weed in China and other countries. To date
there has been no molecular method for this species identifi cation. In this paper, we selected 26 samples (including
5 individuals of S. elaeagnifolium and its 15 relatives),using trnS-trnG, ndhF and waxy DNA regions to explore
the utility of DNA barcode for S. elaeagnifolium identification. Our results showed that S. elaeagnifolium can be
successfully discriminated from its closest relatives. In addition, the combination of the three DNA regions revealed
great discriminatory power and was suggested as the supplementary barcode in Solanum plants. Our establishment of
this detection method would strongly promote the quarantine of Solanum plant weeds.
Key words Solanum elaeagnifolium; DNA barcode; trnS-trnG; ndhF; waxy
摘要 银毛龙葵是我国进境植物检疫性有害生物，到目前为止我国还没有关于银毛龙葵的分子检
测方法。本研究收集26份茄属植物样品，包括银毛龙葵5个不同来源的个体以及它的15个近缘种，使用
了3个 DNA 区段 trnS-trnG、ndhF和 waxy来探讨银毛龙葵的 DNA 条形码检测方法。研究结果显示
银毛龙葵从其近缘种中被成功鉴定出；此外 trnS-trnG、ndhF和 waxy 3个片段由于具有较强的分辨
力而被建议作为茄属植物补充条形码。该研究对于银毛龙葵及其他茄属植物的检疫和监测具有重要
价值。
关键词 银毛龙葵；DNA 条形码；trnS-trnG基因间隔区；ndhF基因；waxy基因
中图分类号 S41-30
基金项目：国家质检总局科技计划项目（2010IK268）
*通讯作者：E-mail:fan98494@sina.com
收稿日期：2012-11-15
银毛龙葵（Solanum elaeagnifolium Cav.) 属
茄科茄属植物，因植物体密被银白色的星状毛而
得名。该物种竞争能力极强且能够分泌化感物
质，使农作物大量减产；此外，银毛龙葵体内的糖
苷生物碱能够毒害人和牲畜，如牛取食其体重的
0.1% 即产生中度中毒反应。银毛龙葵可以进行
营养繁殖，根及根状茎断裂后即使1 cm 的碎段仍
能生根发芽。主根粗大、深达2 m，能贮存营养物
质；侧根众多，向外扩展至2 m 有余，因此该物种
一旦暴发很难去除 [1-2]。
银毛龙葵起源于美国西南部和墨西哥北部，
目前已在阿根廷、澳大利亚、希腊、法国、西班牙、
南非、印度、中国台湾等30多个国家和地区发生，
被世界各国列为检疫杂草 [3]。银毛龙葵主要通过
种子长距离传播，目前口岸对其检测也主要依据
种子的形态特征。由于茄属种子的形态识别特征
有限，物种间的差别非常细微，仅少数专家能够对
其区分。此外，银毛龙葵的植株在非原产地的形
态往往变异较大，在很多情况下标本形态与相关
植物志记录有较大的差别，这也增加了其植株检
测的难度。
近年来，DNA 条形码技术作为一种新兴的
分子检测技术受到普遍关注。它是利用一段短的
标准 DNA 序列进行物种鉴定，该技术不受物种发
育阶段和形态的限制，准确高效、具有较强的通用
性 [4]。在动物中，线粒体基因 COI 已经被广泛应
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用于各类物种鉴定中 [5-7]。在植物中线粒体序列
进化慢、杂交、多倍化等进化事件导致条形码的选
择十分困难 [8]。虽然叶绿体基因 rbcL+matK组合
以及核基因 ITS 被提议作为陆生植物的核心条形
码（core barcode），但它们仅能解决较高阶元（科、
属）的鉴定问题，在物种水平分辨率较差，如单个
rbcL和 matK只能区别不到50% 的物种，其组合的
分辨力也不足70%[9-11]。为了更为精确的物种鉴
定，在核心条形码的基础上对特异类群探索增加
辅助条形码（supplementary barcode）是必要的。
本研究采集了银毛龙葵不同来源的5个个体，
使用来自不同基因组的3个 DNA 片段（trnS-trnG,
ndhF, waxy）建立了银毛龙葵分子快速检测技术，
在此基础上探讨 trnS-trnG, ndhF, waxy作为茄属
条形码辅助片段的可能性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
茄属分子系统学研究表明银毛龙葵属于茄亚
属分支(Leptostemonum)，该分支有350～450种，
在进化关系树上分属于10个亚支，银毛龙葵属于
银毛龙葵亚支(Elaeagnifolium Clade) [12]。 本研
究收集了银毛龙葵不同来源个体及其近缘种，共
16种26份样品（表1）。样品来自口岸截获、口岸
周边监测、与国外标本馆交换或从国外种子公司
购买。虽然很多样品的原产地不清楚，但同一物
种不同的获得途径也从一定程度上保证了其遗传
的多样性。
表1 实验材料
编号 中文名 拉丁文 来源
1 喀西茄 Solanum aculeatissimum Herbiseed公司
2 中美茄 Solanum adhaerens GenBank
3 牛茄子 Solanum capsicoides15 Herbiseed公司
4 北美刺龙葵 Solanum carolinense27 张家港截获
5 北美刺龙葵 Solanum carolinense814 张家港截获
6 丛林龙葵 Solanum drymophilum GenBank
7 银毛龙葵 Solanum elaeagnifolium GenBank
8 银毛龙葵 Solanum elaeagnifolium28 张家港截获
9 银毛龙葵 Solanum elaeagnifolium29 国外交换
10 银毛龙葵 Solanum elaeagnifolium2814
11 银毛龙葵 Solanum elaeagnifolium7814 B&T world seeds sarl 公司
12 白鳞茄 Solanum furfuraceum GenBank
13 橙果龙葵 Solanum luteum Herbiseed公司
14 橙果龙葵 Solanum luteum1 B&T world seeds sarl 公司
15 奎东茄 Solanum pseudolulo814 B&T world seeds sarl 公司
16 黄花刺茄 Solanum rostratum3 Herbiseed公司
17 黄花刺茄 Solanum rostratum814
18 蒜芥茄 Solanum sisymbrifolium3 东莞麻涌村
19 蒜芥茄 Solanum sisymbrifolium814 泉州
20 水茄 Solanum torvum2 东莞麻涌村
21 水茄 Solanum torvum3 国外交换
22 野生茄 Solanum tridynamum GenBank
23 夜茄 Solanum vespertilio GenBank
24 毛果茄 Solanum viarum Herbiseed公司
25 红果龙葵 Solanum villosum Herbiseed公司
26 红果龙葵 Solanum villosum1 B&T world seeds sarl 公司
注：拉丁文后面的数字表示个体号
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1.2 方法
1.2.1 DNA 提取、PCR扩增和测序
称取经硅胶干燥的植物叶片20 mg 或种子
3 ～ 5粒，用液氮研磨后使用植物基因组 DNA 提
取试剂盒（天根生物科技公司）提取总 DNA。
PCR 引物筛选参考以往分子系统学的研究，依据
扩增效率、分辨率和序列质量筛选到 ndhF、trnS-
trnG、waxy 3个 DNA 片段。ndhF 序列及其 PCR
反应条件参考Olmstead & Sweere[13]以及Bohs &
Olmstead[14]的结果；trnS-trnG参考 Hamilton[15]
和 Levin[16] 的结果；waxy 基因为本研究自行设
计的引物 (WAXYS: 5-ACT GCT ATA AAC GTG
GGG TTG ATC G-3; WAXYA2: 5-TGG AAC
CAA CAT AAA ATC AGC-3)，反 应程序如下：
94℃预热3 min; 94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1.5
min, 36个循环；72℃ 10 min。PCR 产物经纯化
试剂盒（天根生物科技公司）纯化后委托北京华
大生物科技公司进行双向测序。
1.2.2 数据分析
序列使用ContigExpress (Informax,Inc.)检
测峰图，去除两端低质量的序列区并将正反序列
拼接。利用Clustal X[17]进行多序列比对，并辅以
Bioedit version 7[18]人工调整。 使用Mega 4.0[19]
计算序列的变异信息和 K2P 遗传距离并构建 NJ
系统发生树，1000个重复，选取茄属 Morelloid亚
属的 S. villosum为外类群。根据 NJ 树系统发育
关系结果采用 Taxon DNA[20] 软件对银毛龙葵以
及和它亲缘关系最近的几个物种进行种间和种内
变异统计分析，分别使用 EXCEL 和 MVSP 构建
种间和种内变异的柱状图和散点图。
2 结果
2.1 序列分析
根据上述引物及 PCR 条件100% 扩增出了3
个片段的所有物种及样品。waxy PCR 产物为单
一条带，其中银毛龙葵 PCR 产物经克隆后随机挑
取的6个克隆序列信息一致，证实了 waxy在茄属
中为单一拷贝序列 [21]。在本研究的16个物种中
ndhF、 trnS-trnG和 waxy经排列后序列总长度分
别为1745bp、650bp 和1511bp。在这3个 DNA 区
段中 waxy变异位点306 (20.25%)和信息位点203
(13.43%)，数量和比例是最高的，此外这个片段的
种间平均遗传距离（0.0359）也最大（表2）。因
为单一片段分辨率有限，我们将这3个 DNA 片段
进行了合并分析，合并后序列的总长度为3905bp，
包括变异位点526bp，信息位点325bp, 种间平均遗
传距离0.0230（表2）。
表2 银毛龙葵及近缘种3个DNA片段及其片段组合信息
参数值 ndhF trnS-trnG Waxy ndhF+ trnSG+ Waxy
序列长度 /bp 1742～1744 556～607 1453～1503 3764～3841
排列后序列长度/bp 1745 650 1511 3905
变异位点数量 111 (6.36%) 109(16.77%) 306 (20.25%) 526 (13.47%)
信息位点数量 44 (2.52%) 55(8.46%) 203 (13.43%) 325(8.32%)
种间平均遗传距离 0.0117 0.0281 0.0359 0.0230
2.2 系统学分析
在 NJ 树图上16个物种分别聚成10支，除同属
于 Morelloid 亚属的 S. villosum 和 S. luteum 聚成
一支外，其余9支分别对应茄亚属的9个进化支（图
1）。在所选物种中，同属于相同亚支的物种聚在
一支，同属于相同物种的不同个体也以较高的支
持率聚在了一起，这表明所使用的3个基因区段
（ndhF、 trnS-trnG和 waxy）对茄属物种有较好的
分辨力。是否单系是 DNA 条形码研究中物种能
否被成功鉴定的最重要的标准之一，在本研究生
成的 NJ 树图中银毛龙葵不同来源的5个个体自成
单系并以100% 支持率聚在一起，这表明该方法可
以对银毛龙葵进行成功鉴定（图1）。
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2.3 Barcoding gap 分析
理想的条形码应该种间变异大于种内变异，
因此在两者之间形成了一个明显的遗传距离间
隔区，即barcoding gap[22]。我们认为如果一个物
种能够和它亲缘关系最近的物种分开，那么该物
种就可以与其他物种分开从而被成功鉴定。在
NJ 树图中，与银毛龙葵亲缘关系最近的物种是 S.
tridynamum，与银毛龙葵所在的 Elaeagnifolium
Clade 支系亲缘关系最近的支系是 Old World
Clade 支系（图1），因此我们计算了银毛龙葵种内
遗传距离以及它与 S. tridynamum、S. vespertilio、S.
furfuraceum的种间遗传距离并绘制了柱形图（图
2）。
从图2可以看出银毛龙葵种内的遗传距离变
异集中在数值较小的左侧（K2P 最大值1.0），而
银毛龙葵与其他3个近缘种的种间遗传距离变异
集中在数值较大的右侧（K2P 最小值1.5），两者
之间存在一个明显的遗传间隔（图2）。Barcoding
gap检验虽然是物种鉴定成功与否的一个标准，但
它并不能显示物种间或种内个体间的相对关系。
因此，基于 K2P 遗传距离我们绘制了这4个物种8
个个体间的散点图（图3）。从散点图上可以清晰
的看出银毛龙葵的5个个体聚在一起，并与其他物
种分开，从而被成功鉴定。
S.elaeagnifolium2814
S.elaeagnifolium7814
S.elaeagnifolium
S.elaeagnifolium29
S.elaeagnifolium28
图1 基于trnS-trnG、ndhF和waxy构建的NJ进化树
分支上方的数值显示的是大于90%的支持率，拉丁文后方的数字表示个体号，黑体为银毛龙葵
S.carolinense27
S.carolinense814
S.torvum 2
S.torvum 3
S.adhaeren
S.rostratum814
S.rostratum3
S.sisymbrifolium3
S.sisymbrifolium814
S.elaeagnifoliu 2814
S.elaeagnifoliu 7814
S.elaeagnifoliu
S.elaeagnifoliu 29
S.elaeagnifoliu 28
S.tridynamum
S.vespertilio
S.furfuraceum
S.drymophilum
S.viarum
S.aculeatissimim
S.capsicoides 15
S.pseudoluso814
S.luteum
S.luteum 1
S.villosum
S.villosum1
图2 银毛龙葵种间及种内遗传距离变异分布图
/
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3 结论与讨论
3.1 茄属辅助条形码
条形码的选择是通用性与分辨力的权衡。
通用性要求序列保守以便设计通用引物和序列
比对；而分辨力要求序列存在变异以便区分物
种。为了解决这对矛盾，一个分阶级分层次的方
法（a tiered method）被提出，即使用一个相对保
守的序列作为第一阶层区分高级分类阶元，如科
和属；在此基础上使用变异较快的序列作为第二
阶层区分物种 [23]。最近 matK+rbcL 组合以及 ITS
相继被提出作为陆生植物 DNA 核心条形码（Core
barcode）[9-11]，然而由于它们分辨力有限，很多
类群不能区分到种，需要进一步探索辅助条形码
（supplementary barcodes）。由于不同序列在不同
类群内的进化速率并不十分一致，因此辅助条形
码的选择可能因类群（科、属）而异。本研究结
果表明叶绿体基因组片段 trnS-trnG、ndhF和核
基因片段 waxy组合对茄属物种能够很好的区分，
可以作为该类群的辅助 DNA 条形码。
3.2 单一物种的DNA条形码研究
DNA 条形码研究大多针对一个类群的所有
物种，至少取到该类群75% 以上的物种，而每个物
种至少取3~5个个体 [24]。这样的取样要求对于一
些世界性的大属是极其困难的，比如茄属有1500
余种，至少需要3300多个个体才能满足上述要求。
中国仅有茄属植物41种，绝大多数物种分布在国
外，这更增加了取样的困难。而在实际应用中人
们往往关注具有重要经济价值或重要意义的物
种，比如检疫部门仅关注茄属植物中具检疫性的
4种杂草：黄花刺茄（S. rostratum）、北美刺龙葵
（S. carolinense） 、水茄（刺茄）（S. torvum）和银
毛龙葵（S. elaeagnifolium）。我们的研究通过特
殊的取样策略实现了对银毛龙葵的鉴定：在本研
究中，银毛龙葵属于茄亚属分支 Leptostemonum,
该分支是茄科茄属经典分类中的茄亚属，其主要
特征是具皮刺和星状毛，花药细长、锥形、顶孔开
裂 [12]。该亚属有350 ～ 450种，世界性分布，主要
集中于中南美洲、非洲和大洋洲。分子系统学研
究茄亚属分支又可以细分为10个亚支，银毛龙葵
属于Elaeagnifolium Clade分支。因此，我们的研
究对象集中在了Elaeagnifolium Clade，其他分支
仅取代表种类即可。根据序列相似性如果一个未
知物种和其他分支的物种聚在一起，表明它不是
Elaeagnifolium Clade分支中的物种，这也排除了
它是银毛龙葵的可能性。如果一个未知物种聚到
了Elaeagnifolium Clade分支，表明它可能是银毛
龙葵，再通过比对与之亲缘关系最近的姐妹种来
最终确定它的归属。如果一个物种个体间能够自
成单系并且能够与它亲缘关系最近的姐妹种分开
也就意味着该物种能够被鉴定，以此方法我们成
功建立了银毛龙葵的分子鉴定方法。
然而一些问题需要进一步研究：根据现有
的分子系统学资料 [12, 25] 我们认定 S. tridynamum
是银毛龙葵亲缘关系最近的物种，而另有形态学
观点认为S. esuriale Lindl. 和S. coactiliferum J.
Black 与银毛龙葵更加相似 [26]，遗憾的是本研究
既没有收集到这两个物种，也没有查到这两个物
种的相关分子信息，因此形态学认定的近缘种与
分子系统学的近缘种是否一致尚需后续研究来证
实。
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