全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2016)03 － 0541 － 04 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2016． 03． 014
收稿日期:2015 － 01 － 11
基金项目:云南省级环境保护专项资金项目(2014BI006) ;云南
省科技计划项目(2015FB161)
作者简介:狐小斌(1990 －) ，男，硕士研究生，E-mail:412836642
@ qq． com，* 为通讯作者，E-mail:penzhji@ 126． com。
特异资源绿天麻和乌天麻光合色素合成特性研究
狐小斌1，2，张智慧1，季鹏章1* ，王 丽1，简帮丽3，王家金1，朱新焰1，刘大会1，石亚娜1
(1．云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650223;2． 云南农业大学食品科技学院，云南 昆明 650092;3． 云县农业局，
云南 云县 675800)
摘 要:以乌天麻和绿天麻为材料，研究其叶绿素光合色素合成特性，从而揭示其光合色素生物合成及其调控的机理。测定乌天
麻和绿天麻叶绿素合成途径中的前体物质的含量，包括﹠-氨基乙酰丙酸(ALA) ，胆色素原(PBG) ，尿卟琳原 III (Urogen III) ，原卟
琳 IX (Proto IX)和原脱植基叶绿素(Pchlide) ，镁原卟琳(Mg-Proto) ，原脱植基叶绿素(Pchlide)到脱植基叶绿素(Chlide)光转化效
率的测定和叶绿素、类胡萝卜素的含量的测定。结果表明，叶绿素前体物质中，乌天麻原卟琳 IX (Proto IX)含量为绿天麻的 2． 3
倍，乌天麻镁原卟琳(Mg-Proto)的含量仅为绿天麻的 3 /5，而原脱植基叶绿素(Pchlide)到脱植基叶绿素(Chlide)光转化效率并未检
测到有吸收，乌天麻胡萝卜素为绿天麻的 6． 3 倍。通过叶绿素合成途径方向揭示了绿天麻和乌天麻的光合色素合成特性。
关键词:天麻;光合色素;合成;研究
中图分类号:S567． 23 文献标识码:A
Study on Characteristics of Photosynthetic Pigment Synthesis of
Gastrodia elata Bl． f． viridis and G． elata Bl． f． glauca S． Chow
HU Xiao-bin1，2，ZHANG Zhi-hui1，JI Peng-zhang1 * ，WANG Li1，JIAN Bang-li3，WANG Jia-jin1，ZHU Xin-yan1，LIU Da-hui1，SHI Ya-na1
(1． Institute of Medical Plant，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yunnan Kunming 650223，China;2． College of Food Sciences
and Technology，Yunnan Agricultural University，Yunnan Kunming 650092，China;3． Yun County Agricultural Bureau，Yunnan Yun Coun-
ty 675800，China)
Abstract:We studied the synthesis of chlorophyll and photosynthetic pigment by using the material of Gastrodia elata Bl． f． viridis and G． ela-
ta Bl． f． glauca S． Chow，and revealed the mechanism of photosynthetic pigment biosynthesis and its regulation． The contents of the precur-
sors in the chlorophyll synthesis pathway of Gastrodia elata Bl． f． viridis and G． elata Bl． f． glauca S． Chow were determined，including de-
termination of chlorophyll of ALA，bile pigment(PBG) ，Urinary porphyrin III (Urogen III)and protoporphyrin IX (proto IX)and the origi-
nal dechlorophyllide (Pchlide) ，primary magnesium porphyrin (Mg-Proto) ，removal chlorophyllide (Pchlide)to degraft chlorophyllide
(Chlide)light conversion efficiency，and determination of carotenoid content． The results showed that the chlorophyll material premise，G．
elata Bl． f． glauca S． Chow protoporphyrin IX (proto IX)content was 2． 3 times of Gastrodia elata Bl． f． viridis，G． elata Bl． f． glauca S．
Chow magnesium protoporphyrin Mg-Proto content only for three fifths of the green of Gastrodia elata Bl． f． viridis，and the original off chloro-
phyllide (Pchlide)to degraft chlorophyllide (Chlide)optical conversion efficiency was not detected by absorption，G． elata Bl． f． glauca
S． Chow carrots for 6． 3 times Gastrodia elata Bl． f． viridis． The photosynthetic pigment synthesis of green and black was revealed by the way
of chlorophyll synthesis．
Key words:Gastrodia elata Bl;Photosynthetic pigment;Synthesis;Study
天麻又名赤箭、定风草、独摇芝，为兰科天麻属
植物天麻的肉质块状，多年生寄生草本，主要产于中
国云南、贵州、四川、陕西等地，是中国名贵的中药之
一［1］。天麻属兰科多年生共生异养草本植物，依靠
同化侵入其体内的蜜环菌等获得营养，其块茎具有
很高的药用和保健价值，是中国的传统常用名贵中
药，被列入《国家重点保护野生植物名录》和《中国
珍稀濒危保护植物名录》。中国天麻属植物已发现
有 6 个种，即毛天麻(Gastriodia elata Bl． f． fera．
Tuyama)、绿天麻(G． elata Bl． f． viridis Mak．)、乌
天麻(G． elata Bl． f． glauca S． Chow)、松天麻 G．
elataBl． f． alba S． Chow)、红天麻(G． elata Bl． f．
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2016 年 29 卷 3 期
Vol. 29 No. 3
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
elata)和黄天麻(G． elata Bl． f． flavida S． Chow) ，主
要产于四川、云南、贵州、陕西、湖北、西藏等地［2 － 3］。
乌天麻(G． elata Bl． f． glauca S． Chow)亦称铁
干天麻，花茎灰褐色，带有明显的白色纵条斑。花黄
绿色，果实有棱、间隔淡黄绿色与褐色条斑，为上粗
下细的倒圆锥形。块茎短柱形，淡黄色。主产中国
贵州西部、云南，在云南栽培的天麻多为此变型种。
绿天麻(Gastrodia elata Bl． f． viridis) ，花茎黄绿至蓝
绿色，花黄色，果卵圆形绿色，块茎圆锥形，种子发芽
率及繁殖率较高，是较稀有的栽培天麻。茎淡蓝绿
色，主要产东北至西南诸省区［4］。
高等植物的植物叶绿素合成的主要步骤为 Glu
→ALA→PBG→Urogen Ⅲ→Coprogen Ⅲ→Proto Ⅸ
→Mg-proto Ⅸ→Pchlide→Chlide→Chla→Chlb［5］，理
论上说，任何一步发生障碍，都有可能造成叶绿素合
成受阻。本研究以乌天麻和绿天麻 2 个品种为材
料，对其光合色素合成特性进行了初步研究［6］，从
而揭示其光合色素生物合成及其调控的机理，为天
麻光合色素合成特性相关研究以及天麻的物种进化
演变等提供新的参考和借鉴，同时对高等植物光合
作用的分子机理研究以及光合色素的生物合成与降
解机制等，具有十分重要的指导意义和参考价值。
1 材料与方法
1． 1 实验材料与设备
材料:包括新鲜幼嫩的绿天麻幼嫩绿色茎杆
(G． elata Bl． f． viridis Mak．)、乌天麻幼嫩茎杆(G．
elata Bl． f． glauca S． Chow) ，样品均由云南省农业
科学院药用植物研究所提供。凭证标本保存在云南
省农业科学院药用植物研究所标本馆。
设备:高速冷冻离心机 HＲ/T16M(湖南赫西仪
器装备公司) ，分析天平(奥豪斯仪器公司) ，HWS26
型恒温水浴锅(上海一恒科技公司) ，日立 F-7000 荧
光分光光度计(日立高新技术公司)。
1． 2 叶绿素前体物质的测定
1． 2． 2 ﹠-氨基乙酰丙酸(ALA)的测定 依据
Del［7］等人的实验方法，分别称取 0． 5 g 新鲜幼嫩的
绿天麻，乌天麻的茎部位，用 3 遍 5 mL 4 %的三氯
乙酸及少量石英砂研磨，合并上清液后定容至 20
mL。18 000 r /min离心 15 min。取 5 mL上清液，加
入 2． 4 mL 的 1 mol /L 的醋酸钠和 0． 15 mL 的乙酰
丙酮。沸水浴 10 min，之后冷却至室温，各取其中的
2 mL加入 2 mL 显色液(Ehrlich-Hg) ，黑暗条件下
15 min后，分别测定 553 nm的 OD值。
Ehrlich-Hg试剂:1 g P-二甲氨基苯甲醛溶解于
30 mL冰醋酸中，加入 8 mL70 %的高氯酸(高氯酸
遇有机溶剂易爆炸) ，用冰醋酸稀释到 50 mL，最后
加入 0． 2 g升汞．此溶液存于棕色瓶中，外面用锡纸
包裹，可以在 4 ℃长期保存。
ALA 含量以 553 nm 的摩尔消光系数 7． 2 ×
104 /(mol·cm)计算。
按下列公式计算 ALA 摩尔浓度:A = eCL
其中，A为吸光值，e 为摩尔消光系数，C 为摩尔浓
度，L为测试液液层厚度。
1． 2． 3 胆色素原(PBG)的测定 根据 Bogorad［8］的
方法，分别称取 0． 5 g新鲜绿天麻，乌天麻的茎秆部
位，加入液氮少许研磨成粉末状后，加入 5 mL 提取
缓冲液(0． 6 M tris，0． 1 M EDTA，用盐酸调至 pH =
8． 2) ，18 000 r /min 下离心 10 min。取其中的 2 mL
加入 2 mL Ehrlich-Hg试剂，黑暗条件下 15 min 后，
测定 533 nm的 OD值。
PBG 含量以 553 nm 的摩尔消光系数 6． 1 ×
104 /(mol·cm)计算。
1． 2． 4 尿卟琳原 III (Urogen III)的测定 参照
Bogorad等人的方法加以改进。1 g叶片用液氮研磨
后，加入 10 mL提取缓冲液(0． 067 mol /L pH值 6． 8
磷酸缓冲液) ，过滤或 18 000 g 离心 10 min。取 5
mL 加入 0． 25 mL 1 %的 Na2S2O3，剧烈震荡，再用强
光照射 20 min。加入 1M甲酸(或冰醋酸)至 pH 值
3． 5。用 10 mL 乙醚萃取 3 次，分层后测水相的
405． 5 nm的 OD值。
Urogen Ⅲ含量以 405． 5 nm 的摩尔消光系数 5．
48 × 105 /(mol·cm)计算。
1． 2． 5 原卟琳 IX (Proto IX)和原脱植基叶绿素
(Pchlide)的测定 根据 Ｒebeiz 等人［9］的方法。叶
片 1 g冰浴研磨，溶于 20 mL丙酮-0． 1M NH3·H2O
(9∶ 1，v /v)溶液中。用等体积的正己烷萃取丙酮溶
液。测丙酮项的荧光发射强度 E400 F633，E400 F622和
E440F640。根据下列公式计算原叶琳 IX 和原脱植基
叶绿素(Pchlide)的含量。
Proto(E400F633)=(E400F633 － 0． 25 × E400F622 － 0．
24 × E400F640)/0． 95，Pchlide(E440 F640)=(E440 F640 －
0． 03E400F633)/0． 99
1． 2． 6 镁原卟琳(Mg-Proto)的测定 采用 Terry 和
Kendrick法［10］。叶片用正己烷萃取过的丙酮提取
镁原叶琳混合物(方法同上)。镁原卟琳的含量直
接用 E410F595发射荧光强度直接表示其含量。
1． 2． 7 原脱植基叶绿素(Pchlide)到脱植基叶绿素
(Chlide)光转化效率的测定 按 lay［11］等人的方法
取未经光照的叶片用 NaHCO3 饱和的 80 %丙酮在
冰浴研磨，过滤或离心除杂质。用 1 /2 体积的正己
烷萃取丙酮，剧烈摇动。测丙酮相的激发荧光，440
245 西 南 农 业 学 报 29 卷
表 1 叶绿素前体物质的含量
Table 1 Content of chlorophyll precursors
类型 ALA PBG Urogen III Proto IX Mg-Proto Phlide Ch1 类胡萝卜素
Type (μmol /g) (nmol /g) (nmol /g) (%) (%) (%) (μg /g) (μg /g)Carotenoid
乌天麻 0． 238 1． 05 0． 567 7． 36 2． 73 9． 5 2． 58 9． 4
绿天麻 0． 263 1． 46 0． 39 3． 1 4． 34 9． 6 2． 62 1． 5
图 1 叶绿素生物合成前体物质相对含量的比较
Fig． 1 Comparison of amounts of chlorophyll synthesis precursors
nm激发，扫描 600 ～ 720 nm。
再用单个白炽灯照射叶片 60 s，提取样品再一
次扫描 600 ～ 720 nm。照射后避光 90 min，再次提
取样品，扫描 600 ～ 720 nm。测定和提取样品时全
程避光。
1． 2． 8 叶绿素和类胡萝卜素含量的测定 取样品
放入研钵中，加入 2 ～ 3 mL 95 %乙醇和少量石英
砂，碳酸钙充分研磨至匀浆，再加 5 mL无水乙醇，继
续研磨至组织白色，静置过滤定容至 10 mL管中，以
95 %乙醇为空白，分别测定 665、649 和 470 nm 处
的吸光值。
计算公式为:叶绿素 a 的浓度 Ca = 13． 75A665 －
6． 88A649;叶绿素 b浓度 Cb = 24． 96A649 － 7． 32A663;叶
绿素总浓度 Ct = Ca + Cb;则叶绿素的含量为 Ct × V
× N /W。(其中 V 为浸提液定容的体积，N 为稀释
倍数，W为材料的重量)。
1． 3 数据处理
实验所得数据采用 EXCEL2003 进行数据分析
和挖掘。
2 结果与分析
乌天麻，绿天麻叶绿素生物合成主要前体物质
含量的变。对叶绿素生物合成过程中的主要前体物
质 ALA、PBG、Urogen III、Proto IX、Mg-Proto、Proto
IX、Pchtide、Ch1 和类胡萝卜素含量的测定结果(表
1 和图 1)表明，无论是绝对含量还是相对含量(设
绿天麻各物质的量为 100 %，乌天麻各物质的含量
换算成绿天麻各物质的百分比) ，其中乌天麻中间
产物 ALA与绿天麻差别不大，而乌天麻中间产物
PBG的含量低于绿天麻，从 PBG后乌天麻产物含量
呈上升趋势，其中乌天麻的 Proto IX 的产物累积达
到绿天麻的 2． 3 倍，Mg-Proto 的含量只有绿天麻的
3 /5 倍，之后 Phlide的积累量又达到同一水平，测定
的乌天麻和绿天麻原脱植基叶绿素(Pchlide)到脱
植基叶绿素(Chlide)光转化效率(图 2) ，结果表明
从原脱植基叶绿素(Pchlide)到脱植基叶绿素
(Chlide)光转化效率并未检测到有吸收波长，而叶
绿素含量并无差异，其中类胡萝卜素乌天麻为绿天
麻 6． 3 倍。
3 讨 论
通过分析叶绿素生物合成中间产物累积量的变
化，在分析色素突变体突变机制的研究中此方法常
被采用，叶绿素的生物合成是一个多酶参与的复杂
过程，其最终结果是将前体 δ-氨基乙酰丙酸(ALA)
转化为最终产物 Chla 和 Chlb。首先 Glu-trNA 经过
反应形成带有不完整碳环结构的 δ-氨基乙酰丙酸
(ALA) ，两分子 ALA 脱水缩合成单卟啉胆色素原
(PBG) ，随后四分子 PBG 由胆色素原脱氨酶催化
聚合形成线性四吡咯分子羟甲基色原，后者迅速异
构化成环状尿卟啉原 III(Urogen III) ，经卟啉环侧链
脱羧生成粪卟啉原 III(Coprogen III) ，继而氧化形成
原卟啉 IX(Proto IX)。随后，在多亚基 Mg-螯合酶的
催化下 Mg2 +加入形成镁-原卟啉(Mg-proto IX) ，经
甲基化和环化后形成原脱基叶绿素 a(Pchlide a) ，
后者照光后形成脱植基叶绿素 a(Chlide a) ，再经还
原反应最终生成 Chla，部分 Chla再转化为 Chlb［12］。
这个过程的某一步合成出现受阻的话，受阻以
前的前体物质就会积累，而其后的前体物质会减少。
由图 1 可以看出，乌天麻的 Proto IX 合成量是绿天
麻的 2． 3 倍，而之后乌天麻 Mg-proto 产物量急剧下
降，只达到绿天麻的 63 %，很可能是 Mg-proto 产物
合成受阻，镁螯合酶活性降低，所以 Mg-proto的产物
积累效率变低，之后 Phlide产物量又达到同一水平，
而从原脱植基叶绿素(Pchlide)到脱植基叶绿素
(Chlide)光转化效率的测定也并未检测到有吸收，
而 2 种天麻叶绿素含量差异不大，但乌天麻类胡萝
卜素含量却远高于绿天麻，其乌天麻类胡萝卜含量
3453 期 狐小斌等:特异资源绿天麻和乌天麻光合色素合成特性研究
A 为完全避光条件下;B 为见光 1 min 时;C 为见光 1 min 后转为黑暗下 90 min
A Etiolated seedlings grown in dark;B Exposed to light for 1 min;C 90 min in dark after 1 min illumination
图 2 荧光发射光谱测定原脱植基叶绿素到脱植基叶绿素的光转化效率
Fig． 2 Efficiency of Pchlide converted to Chlide tested by the fluorescence
为绿天麻类胡萝卜素锝 6． 3 倍，这两个方面可能是
乌天麻和绿天麻植株颜色呈现明显差异的重要原
因。
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(责任编辑 王家银)
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