全 文 ：琐琐葡萄提取物多糖 、黄酮对肝癌细胞
HepG2的增殖抑制作用＊
张　琳＊＊, 马　龙＊＊＊, 刘　涛 , 苏德奇 , 俞　丹 , 赵　晨
(新疆医科大学公共卫生学院毒理学教研室 , 新疆　乌鲁木齐　830011)
摘要:目的:研究琐琐葡萄提取物多糖(VTP)、黄酮(VTF)在体外对肝癌细胞 HepG2 增殖的抑制作用。方
法:用不同 VTP、VTF剂量组对体外培养的 HepG2 细胞分别干预 24 、48 、72 h 后 , 用 M TT 法来观察其对 HepG2
细胞增殖的抑制作用。结果:(1)琐琐葡萄提取物 VTP、VTF对 HepG2 细胞增殖在 24 h 未表现出抑制作用;(2)
与阴性对照组相比 , 除 72 h VTP剂量组(12 500 mg/ L)外 , 48 h 和 72 h 其余剂量组均表现出对 HepG2 细胞株的
抑制作用 ,其作用差异有统计学意义(P <0.05);VTP和 VTF所有剂量组 48 h 均显出统计学意义(P <0.001);
(3)重复测量设计资料的方差分析证明了琐琐葡萄提取物 VTP、VTF 对肝癌细胞株 HepG2 细胞的增殖有一定的
抑制作用 ,测定时点与药物剂量分组存在交互作用;综合时间抑制曲线 , 琐琐葡萄提取物 VTP 和 VTF在 48 h 对肝
癌细胞 HepG2 的抑制效果最佳。结论:通过体外对肝癌细胞株 H epG2 增殖的抑制初步证实 , 琐琐葡萄提取物多
糖和黄酮具有一定抑制肝癌细胞增殖的作用。
关键词:琐琐葡萄;VTP;VTF;HepG2 细胞;MTT
中图分类号:O629.12;R735.7　　文献标识码:A　　文章编号:1009-5551(2009)05-0529-04
Study on the inhibiting capacity of flavonoid and polysaccharide extracted
from SuoSuo Grape to HepG2 Cells′reproductive activity
ZHANGLin , MA Long , LIU Tao , et al
(Department of Toxicolog y , College of Public Heal th , X inj iang Med ical Universi ty ,
Urumqi 830011 , China)
Abstract:Objective:To observe the inhibi ting effect on f lavonoid (VTF)and po lysaccharide (V TP)ex-
t racted f rom SuoSuo G rape to HepG2 Cells′reproductive act ivity by M TT method in vi tro.Methods:
HepG2 cells w ere cultured in vi t ro and interfe red by dif ferent concentrat ions o f V TF and VTP for 24 , 48 ,
72 hours re spectively.The inhibition of VTF and V TP ex tracted f rom SuoSuo Grape to HepG2 cells w ere
detected by M TT Method.Results:(1)The HepG2 cells kept proliferat ing in 24 hours in all g roups.(2)
The V TF and V TP ex tracted f rom SuoSuo Grape show the inhibition to HepG2 cells compared w ith the
negat ive control g roup at 48h and 72 h(P <0.05), except 72 h VTP (12 500 mg/ L).(3)Repeated analy-
sis proved that VTP and VTF extracted f rom SuoSuo Grape have an inhibiting ef fect on the proliferation of
HepG2 cells.At the same time an interaction ef fect betw een t ime and dose can be observed.Conclusion:
The resul ts proved the inhibition o f V TP and V TF.V TF and V TP ex tracted f rom SuoSuo Grape show the
best inhibit ing ef fect on the pro liferation of HepG2 cells at 48 h.
Key words:SuoSuo Grape;flavonoid and poly saccharide;HepG2 cells;MT T
　　琐琐葡萄(Vitis vini f eral L .)为葡萄科葡萄
属落叶藤本植物葡萄的成熟果实 , 既是居民喜爱并
长期食用的果品 , 又被维吾尔医学用作滋补强壮 、
软坚驱寒 、补肝利胆的药物[ 1] , 同时 , 又是传统医
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＊＊
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基金项目:国家自然科学基金资助项目(30660157);新疆维吾尔自治区高校科研计划重点项目(XJEDU2004I29)
作者简介:张　琳(1983-),女 ,硕士研究生 ,研究方向:新疆特色药食兼用植物的开发应用研究。赵晨为新疆医科大学预防医学 2004
级本科生。
通讯作者:马　龙 ,男 ,教授 ,博士研究生导师 , E-mail:m l@xjmu.edu.cn。
学常用补气药[ 2] 。古书记载葡萄具有主筋骨 、利湿
痹 、健脾胃 、滋肾液 、益阴肝 、止渴等作用 ,民间用于
治疗小儿麻疹和肝炎等症[ 3] 。目前有文献报道 ,植
物体外抗肝癌细胞生长活性成分研究 ,归纳总结出
具有抗肝癌作用的植物源天然产物包括多糖 ,黄酮 ,
萜类 ,酚类等化合物[ 4] 。利用 HepG2细胞株筛选中
草药抗肝癌活性的实验研究发现 ,植物中的三萜 ,黄
酮和多糖类化合物可显著抑制癌细胞增殖及对癌细
胞凋亡起到一定作用 。本实验中选用的琐琐葡萄提
取物多糖(VTP)和黄酮(V TF)在前期研究中显示
出在体内外皆有一定的抗 HBV 作用和对免疫性肝
损伤的保护作用 ,但这些成分是否具有抑制肝癌细
胞增殖作用尚不清楚 。本研究选用单位质量活性成
分含量较高的且维吾尔医药用葡萄 —琐琐葡萄作为
研究对象 ,利用 HepG2 细胞株在体外筛选琐琐葡
萄抗肝癌的潜在目标化合物 ,并采用重复测量方差
分析 , 判断 VT P , V TF 在体外抑制肝癌细胞株
HepG2的作用及效果 ,为进一步研究其抗癌机制提
供最初实验依据和线索。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　细胞　肝癌 HepG2细胞株 ,该细胞分泌多
种血浆蛋白:清蛋白 、α2-巨球蛋白 、血纤维蛋白溶酶
原 、铁传递蛋白等。能大容量培养 ,乙肝表面抗原阴
性 ,对 G418有抗性 ,对人生长激素有刺激反应(新
疆医科大学营养与食品卫生学教研室)。
1.1.2　试剂　DMEM 培养基(GIBCO 公司);胎
牛血清(杭州四季青生物制品公司);青霉素-链霉素
(哈药六厂);MT T 和二甲基亚飒(DMSO)(Sigma
公司);L-谷氨酰胺(Amresco公司);0.025%胰蛋白
酶(Amresco公司)。
1.1.3　药物　阳性对照 5-氟尿嘧啶(5-FU)购自
上海旭东海普药业有限公司 ,批号 H31020593);琐
琐葡萄多糖(V TP)及琐琐葡萄总黄酮(V TF)由本
课题组提取分离。其中 VTP 和 5-FU 用无血清
DMEM 溶解 , VTF 用 DMSO 助溶 ,加一定量培养
液稀释 ,用 0.2微米孔径微孔滤膜滤过除菌 ,备用 。
1.1.4　仪器 　CO 2 培养箱(HEA L FORCE 公司
HF-212 UV);离心机(上海安亭 TDL-40B);自动酶
标仪(M-K3 型酶标仪);倒置显微镜 (MO TIC 公
司 101M );高压锅;水浴震荡器;烘箱;分析天平;
96孔细胞培养板(Co rning 公司)。
1.2　方法
1.2.1　实验设计　采用成组设计 ,分别研究不同浓
度琐琐葡萄提取物 V TP(50 000 、25 000 、12 500 、
6 250 、3 125 、1 562.5 、781.25 、390.63 、195.31 、
97.66μg/ml)和 VTF(8.00 、 4.00 、2.00 、1.00 、
0.50 、0.25 μg/ml)及阳性对照药物 5-FU(0.19 、
0.38 、0.76 、1.53 、3.05μg/ml)对 HepG2 细胞在加
药后 24 、48和 72 h的抑制作用。
1.2.2　样品溶液的配置 　精密称取 V TP 5 g ,用
50 m l DMEM 溶解 , 用磁力搅拌器低速搅拌 30
min ,配制成 100 mg/ml 的贮备液;精密称取 VTF
0.1 g ,用1 ml DM SO溶解 ,配制成 100 mg/ml贮备
液 。再根据需要分别以 1∶1的比例配制混合样品
贮备液 。取 1只 5-FU 注射剂 ,用不加血清 DMEM
经过倍比稀释得到需要浓度的贮备液 。以上各贮备
液放置 4℃保存备用 。
细胞 MTT 毒性试验临用前 ,分别吸取各贮备
液 ,用 DMEM 培养基倍比稀释至使用浓度。每个
样品复 3孔上样。
1.2.3　细胞培养　将 HepG2细胞接种于 25 cm2
细胞培养瓶中 ,加入高糖 DMEM 培养基(每 100 m l
含 10%灭活胎牛血清 、青霉素 100 U/ml 、链霉素
100μg/ml , L-谷氨酰胺 1 m l , HEPES 2 ml),用 50
mg/ L N aHCO 3 调 pH 7.2 ～ 7.4 , 37℃, 5%CO 2 培
养箱中培养 ,每 2天换液一次 ,3 ～ 4天传代[ 5] ,本次
实验选用第五代细胞。
1.2.4　MT T 试验　实验设阴性对照组 ,空白组 ,
阳性对照组和不同浓度药物组 ,采用 MT T 法测定
细胞抑制率[ 6] 。收集对数期细胞 ,用 0.025%的胰
蛋白酶消化 ,采用白细胞计数板计数 ,并用培养基稀
释为 7×104 个/ml ,分别加入 96孔细胞培养板中 ,
每孔加入 100 μl ,铺板使待测细胞调密度至 7 000
个/孔 ,置 5%CO 2 ,37℃孵育 。接种 24 h ,镜下观察
到细胞单层铺满孔底 , 弃去培养基 , 分别加入用
DMEM 培养基稀释的不同浓度样品 ,每孔 100 μl ,
每个浓度 3个复孔 ,同时每板设 8 个空白孔和 6个
阴性对照孔 ,置 5%CO 2 , 37℃孵育 24 、48和 72 h。
至各时间点时 ,在细胞培养孔中加入 5 mg/ml的
MT T 溶液 ,每孔 40 μl ,置 37℃继续孵育 4 h 后 ,加
入 DMSO ,每孔 150 μl ,混匀 ,用振荡器振荡 ,使甲臜
完全溶解 ,用酶标仪在 492 nm 波长下比色 ,测定各
孔的吸光度 OD 值[ 7] 。以相同条件 ,无药物细胞对
照组作为对照 ,按以下公式计算细胞抑制率 ,以样品
浓度为横坐标 ,生长抑制率为纵坐标绘制出浓度–
抑制率曲线 ,并按照多组方差分析 LSD检验和重复
测量方差分析对各组吸光度值进行综合分析。
抑制率(%)=(1-OD 给药组/OD 细胞对照
组)×100%[ 8]
式中给药组为给予不同浓度的药物实验组 ,细
胞对照组为不加药物处理的细胞对照组。
1.3　统计学处理　使用 SPSS16.0统计分析软件 ,
实验数据以( x ±s)表示 ,各实验组的吸光度同阴性
对照组相比采用 LSD两两比较;不同时间各组剂量
比较采用重复测量方差分析 。若组间方差不齐则采
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用非参数秩和检验 ,检验水准α=0.05。
2　结果
2.1　琐琐葡萄提取物黄酮 、多糖作用 24 、48和 72 h
后对 HepG2细胞增殖的抑制率　在 24 h 各试验组
对 HepG2细胞增殖无抑制作用 ,但随着受试物作
用时间增长 ,除 72 h V TP 剂量组 12 500 mg/ L 外 ,
在 48 h和 72 h VTP 、VTF 对 HepG2细胞增殖均
表现出抑制作用 ,与阴性对照组相比差异均有统计
学意义(P <0.05 ～ 0.01)(表 1)。
表 1　琐琐葡萄提取物黄酮 、多糖作用 24 h、48 h、72 h后对 HepG2 细胞增殖的抑制率(%, x±s)
组别 剂量(m g/ L) 24 h
A 492值 IR
48 h
A 492值 IR
72 h
A 492值 IR
空白对照 同体积 0.20±0.02 —　 0.10±0.04 — 0.21±0.03 —
阴性对照 同体积 0.09±0.02 0　 0.47±0.08 0 0.56±0.06 0
黄酮 0.25 0.10±0.03 -14.98 0.20±0.02＊＊ 58.13 0.39±0.00＊＊ 30.86
0.50 0.01±0.01 -11.61 0.20±0.03＊＊ 58.36 0.41±0.03＊ 27.08
1.00 0.11±0.02 -28.84 0.34±0.03＊＊ 27.18 0.40±0.05＊ 28.55
2.00 0.09±0.01 -6.37 0.27±0.04＊＊ 42.32 0.42±0.02＊＊ 25.66
4.00 0.13±0.01＊＊ -45.32 0.42±0.04＊＊ 10.19 0.45±0.04＊ 20.65
8.00 0.21±0.03＊＊ -138.95 0.30±0.05＊＊ 36.61 0.46±0.04＊ 17.88
多糖 97.66 0.10±0.06 -14.98 0.21±0.04＊＊ 55.46 0.34±0.14＊＊ 39.30
195.31 0.11±0.03 -23.22 0.22±0.03＊＊ 52.30 0.41±0.03＊ 27.73
390.63 0.11±0.04 -26.21 0.21±0.07＊＊ 56.17 0.46±0.02＊＊ 18.23
781.25 0.12±0.03 -32.96 0.22±0.07＊＊ 53.27 0.39±0.10＊ 31.50
1 562.50 0.15±0.05 -64.42 0.25±0.09＊＊ 47.51 0.45±0.04＊ 20.35
3 125 0.18±0.07 -101.87 0.27±0.03＊＊ 42.79 0.45±0.03＊ 20.77
6 250 0.14±0.03 -56.55 0.27±0.05＊＊ 43.24 0.44±0.04＊ 22.95
12 500 0.14±0.06 -52.06 0.26±0.04＊＊ 45.34 0.50±0.00 11.59
25 000 0.16±0.05 -84.64 0.19±0.04＊＊ 60.30 0.34±0.06＊＊ 40.47
50 000 0.15±0.03 -71.54 0.19±0.02＊＊ 59.95 0.13±0.07＊＊ 77.70
5-FU 0.19 0.06±0.05 56.55 0.30±0.09 43.26 0.38±0.04 52.45
0.38 0.04±0.01 34.46 0.36±0.02 40.32 0.47±0.09 40.41
0.76 0.06±0.01 31.46 0.21±0.03 54.97 0.21±0.03 25.19
1.53 0.06±0.01 31.46 0.27±0.06 22.53 0.34±0.05 16.10
3.05 0.04±0.02 29.21 0.28±0.08 35.69 0.27±0.04 32.15
　　注:与阴性对照组相比 , ＊P <0.05 , ＊＊P <0.01
2.2　琐琐葡萄提取物黄酮 、多糖作用 24 、48和 72 h
的重复测量方差分析结果
2.2.1　球形检验和分组主效应方差分析结果　本
实验采用 V TP 、VTF 各剂量组不同时点对 HepG2
细胞抑制率的研究 ,符合重复测量的实验设计 ,故选
用重复测量方差分析 ,旨在阐明分组因素和时间因
素分别对肝癌细胞抑制率的作用和两因素是否存在
交互作用 。
从 Mauchly 球形检验结果得出本实验数据满
足球形假设(P >0.05), 则不需要进行校正 ,即可
以使用重复测量方差分析进行数据统计 。进一步分
析时将 VTF 、V TP 和 5-FU 三组药物进行比较 ,发
现分组因素为主效应时这三组药物对肝癌细胞株
HepG2细胞的抑制影响差异无统计学意义(F =
1.392 , P =0.274)。将 VTF 、VTP 和阴性对照三
组药物进行比较 ,发现分组因素为主效应时三组药
物对肝癌细胞株 HepG2细胞的抑制影响差异存在
统计学意义(F =3.973 , P =0.043);证明了琐琐
葡萄提取物 VTF 、V TP 有类似明确抗癌药物 5-FU
的作用 ,对肝癌细胞株 HepG2 细胞的增殖有一定
的抑制作用。
2.2.2　时间因素主效应和时间因素与分组因素交
互效应方差分析结果　以时间因素为主效应时 ,不
同试验药物对肝癌细胞株 HepG2细胞抑制影响的
差异有统计学意义(F =135.15 , P <0.001);测定
时点与药物剂量分组存在交互作用(F =2.809 , P
<0.05);试验药物对肝癌细胞株 HepG2 细胞的抑
制影响(图 1)。
图 1　时间因素与分组因素交互效应轮廓图
3　讨论
琐琐葡萄为葡萄科葡萄属植物葡萄 (Vit is
v ini feral L .)的成熟果实 ,主产于新疆吐鲁番 、和
田 、鄯善等地 ,维吾尔医药用其果实 ,用于治疗脾胃
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不和 、神志不安等 ,民间用于小儿麻疹 、肝炎等症 ,效
果显著。以往的实验研究表明葡萄可通过抗氧化和
清除自由基等作用发挥保肝降酶功效 ,并在体内外
皆有抗 HBV 病毒和对免疫性肝损伤的保护作用 ,
但其是否对肝癌细胞增殖有抑制作用未见报道。
多糖 (Po ly saccharides)广泛分布于多种生物
体中 ,尤其是动物细胞膜 、植物和微生物细胞壁中 ,
是一类有醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高
分子多聚物 ,是构成生命的分子基础之一。近年来
植物多糖的研究备受各国科学家关注 ,也其具有免
疫调节 、抗肿瘤 、抗炎症 、抗病毒 、抗辐射及降血糖等
多种功能 ,被誉为“生物反应调节剂(biolog ical re-
sponse modifier , BRM)”之称[ 9] 。因其独特的药理
活性和低毒效应 ,在临床应用中具有极大潜力 。
黄酮(flavones)广泛存在自然界的某些植物
和浆果中 ,在植物体内大部分与糖结合成苷 ,少部分
以游离形式存在 ,是一种很强的抗氧剂。可有效清
除体内的氧自由基 ,这种阻止氧化的能力是维生素
E的 10倍以上 ,具有降血脂 、降胆固醇 、改善血液循
环 、保肝抗炎 、阻止细胞的退化衰老以及雌激素样作
用[ 10] 。
HepG2细胞来源于一个 15 岁白人的肝癌组
织。能大容量培养 ,乙肝表面抗原阴性 ,对 G418 有
抗性 ,对人生长激素有刺激反应。该细胞表达 3-羟
基-3-甲基戊二酸辅酶 A 还原酶和肝甘油三酸脂脂
肪酶 ,在有百草枯 (英文名:gramoxone)的环境下
过氧化氢酶 mRNA 表达增加 ,ApoA-I mRNA 表达
减少[ 11] 。
本实验应用 HepG2细胞株对琐琐葡萄提取物
VTP 和 V TF 进行了细胞增殖的抑制实验 ,统计学
分析采用重复测量设计资料的方差分析 ,可以综合
考虑到分组因素在不同时点上的关联性和随时间变
化的趋势 ,同时避免了该类资料误用 t 检验和随机
区组方差分析而导致的假阳性错误增大的情况。经
重复测量方差分析 ,证明琐琐葡萄提取物 VTF 、
VTP 在 48 h 和 72 h对 HepG2细胞的增殖有一定
的抑制作用 ,测定时点与药物剂量分组存在交互作
用;V TF 、VTP 在 48 h 对肝癌细胞 HepG2 的抑制
能力相对其他两个时点较强。
在浓度-抑制率曲线中 , 随着受试物浓度的增
加 ,除在 24 h VTP 、VTF 对 HepG2 细胞增殖未表
现出抑制作用外 ,48和 72 h V TP 、V TF 绝大部分
剂量组与阴性对照组相比均表现出对 HepG2 的抑
制作用 ,但未观察到剂量反应关系。由于 3个时点
镜下观察均未发现细菌等其他微生物 ,排除了外界
感染导致实验结果偏差的可能性。推测可能与以下
几个原因有关:(1)细胞在 24 h 仍处于快速生长
期 ,药物作用未发挥充分使得药物的抑制作用被忽
略;(2)对 V TP 、V TF 药物组剂量的选取是在参照
相关文献和进行预试验后得出 ,但是琐琐葡萄中的
V TP 、V TF 为首次提取 ,可能会和其它药材中提取
的同剂量 V TP 、V TF 作用效果有一定偏差而导致
剂量反应关系不明显。(3)MT T 比色法检测的细
胞抑制率包括细胞死亡和细胞增殖抑制两个方而 ,
而细胞的死亡又包括许多凋亡细胞和极少数坏死细
胞 。凋亡是受基因调控 、细胞主动参与且自身有一
定程序的生理性死亡过程 ,又称程序性细胞死亡或
细胞自杀。因此 ,选用一个最佳浓度 ,既能抑制细胞
增殖 ,同时又对细胞毒性较小的浓度甚为重要。可
能在一定实验药物浓度下 ,细胞凋亡机制被抑制导
致药物对 HepG2细胞抑制率下降甚至出现相反作
用 。在时间–抑制率曲线中 ,除 V TP 50 000 mg/L
在 72 h达到峰值 ,其余 VTP 和 V TF 剂量组的抑制
率与阴性对照组相比较均在 48 h达到峰值 。
综上所述 ,琐琐葡萄对肝癌细胞株 HepG2 的
增殖有一定抑制作用 ,其发挥作用的物质基础包含
V TP 和 VTF ,相对于 24 h 和 72 h , 48 h 为其发挥
抑癌效应的最佳时间。这些活性成分发挥作用的机
制还有待进一步深入的研究 。
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[ 收稿日期:2008-12-16]
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