全 文 ：2014 第十六卷 第二期 ★Vol.16 No.2
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
收稿日期：2014-02-07
修回日期：2014-02-19
＊ 乌鲁木齐科技局科技攻关项目（G121120004）：新疆民族药材鉴定 DNA条形码数据库建设与关键技术研究，负责人：李晓瑾，郭宝林；新疆维吾尔
自治区科技厅科技基础条件平台建设项目（PT1211）：新疆传统药物 DNA条形码鉴定技术平台建设，负责人：郭宝林，李晓瑾。
＊＊ 通讯作者：李晓瑾，研究员，主要研究方向：中药资源学研究。
维吾尔药材新疆圆柏DNA条形码鉴定研究＊
宋海龙，樊丛照，阿依别克，王果平，李晓瑾＊＊
（新疆中药民族药研究所 乌鲁木齐 830002）
摘 要：目的：本研究采用形态学与 DNA 条形码技术，建立维吾尔药材新疆圆柏 Juniperus sabina L.
及其混伪品的鉴别方法。方法：随机选择不同产地新疆圆柏及其混伪品的叶片和果实，比较外观差异；采
用 ITS2 序列对新疆圆柏及其混伪品 10 份样品进行 PCR 扩增并测序，结合 GenBank 获得 4 条侧柏 ITS2
序列，比较 14份样品 ITS2序列种内和种间变异，采用 K2P模型构建 NJ系统树。结果：4种植物叶片和果
实外观相态均有相似之处；DNA 条形码 ITS2 序列鉴定结果显示，14 份研究样品 ITS2 序列长度均为 219
bp，种间最大 K2P距离为 0.089。结论：ITS2序列及 NJ树可将新疆圆柏与 3种混伪品植物区分，为维吾尔
药材新疆圆柏的标准化奠定基础。
关键词：新疆圆柏 ITS2 混伪品 鉴定
doi: 10.11842/wst.2014.02.019 中图分类号：R284.1 文献标识码：A
维吾尔与哈萨克医习用药材新疆圆柏系柏科
Cupressaceae 刺柏属 Juniperus 植物的果实与枝叶，
收载于《中华人民共和国卫生部药品标准（维吾尔
药分册）》、《新疆维吾尔自治区中药维吾尔药饮片
炮制规范》及《哈萨克药志》等，用于治疗风湿性关
节炎、小便不利、迎风流泪、视物不清等症状 [1~3]。现
代药理学研究证明，新疆圆柏具有抗氧化 [4]、抗癌 [5，6]
等作用。新疆刺柏属植物种类虽不多，但新疆方枝
柏 J. pseudosabina、西伯利亚刺柏 J. sibirica 等的枝
叶或果实外观形态与新疆圆柏相似，肉眼不易辨别
（图 1），药材的使用存在混淆现象，故研究方便、易
于掌握的药材真伪鉴别方法，对提高维吾尔药材新
疆圆柏质量标准水平，保障新疆圆柏的正确用药具
有重要意义。
DNA 条形码是利用基因组中一段通用的标准短
序列来进行物种鉴定的分子诊断技术 [7]，有足够的能
力区分物种[8]，在中药鉴定领域有一定的优势[9]。基于
ITS2 序列短、易扩增等优点，可以作为标准 DNA 条
形码鉴别药用植物及其近缘物种 [10~12]，中国植物条
形码工作组建议将 ITS/ITS2 序列作为种子植物的
核心 DNA 条形码 [13]。本文采取 ITS2 序列条形码技
术，测试分析维吾尔药材新疆圆柏及其混伪品植
物，为新疆圆柏的分子鉴定提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
1.1.1 材料
实验样品采自新疆不同地区，凭证标本保存于
新疆中药民族药研究所标本馆，由新疆大学努尔巴
依教授鉴定。另从 GenBank 下载侧柏 4 条 ITS2 序列
（数据下载日期为 2013 年 1 月 15 日），详见表 1。
1.1.2 试剂
PCR 扩增所用引物 ITS2 序列 [14]由生工生物工
程合成，其正向序列：5’-ATGCGATACTTGGTGT－
GAAT-3’，反向：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-
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3’；DNA 提取试剂盒、DNA 聚合酶及 dNTPs 等均购
自天根生物。
1.1.3 实验仪器
DNA 提取研磨仪（GRINDER，GT-100），离心机
（上海安亭科学仪器，Anker TGL-16C），PCR 扩增仪
（An Analytik Jena company，070-851）。
1.2 方法
1.2.1 新疆圆柏及其混伪品外观形态比较
随机选择不同产地新疆圆柏及其混伪品的叶
片和果实，比较叶片和果实的形态、颜色及大小等
外观特征。
1.2.2 DNA 的提取及检测
称干燥叶片或果实 30 mg，用 DNA 提取研磨仪
1 000 rpm 研磨 2 min，使用植物 DNA 提取试剂盒
提取总 DNA，用 1%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小
及质量。
1.2.3 PCR 扩增及测序
反应体积 25 μL，dNTPs 0.4 μL（10 mmol·L-1），
PCR 缓冲液 2.5 μL （10 ×），引物各 1.0 μL（2.5
μmol·L-1），聚合酶 1.0 U，总 DNA 1 μL（约 30 ng）。
扩增程序：94℃，变性 5 min；94℃变性 30 s，56℃退
火 30 s，72℃延伸 45 s（40 个循环）；72℃延伸 10
min；扩增结果由美吉生物测序公司双向测序。
1.3 数据处理
测 序 峰 图 利 用 CodonCode Aligner V 4.0.4
（CodonCode Co., USA）校对拼接，去除引物区。ITS2
序列采用基于隐马尔可夫模型的 HMMer 注释方
法，去除两端 5.8 S 和 28 S 区段获得 ITS2 间隔区
序列 [15]；使用 MEGA5.0（Molecular Evolutionary Ge－
netics Analysis）分析比对序列 [16]，基于 K2P 模型进
图 1 新疆圆柏(果)与混伪品植物形态比较
注：A为新疆方枝柏，A1~A4为叶片，A5~A8为果实；B为新疆圆柏，B1~B4为叶片，B5~B8为果实；C为侧柏，C1~C4为叶片，C5~C8为果实；
D为西伯利亚刺柏，D1~D3为叶片，D4~D7为果实。
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8
D1 D2 D3 D5 D6 D7 D8
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表 1 研究样品信息
学名 标本号 GenBank No.(ITS2) 取样部位 采集地点/来源
新疆圆柏
J. sabina
65230702 KF454562 叶片 奇台县碧流河
65230715 KF454563 叶片 木垒县博斯塘乡
654026120611005 KF454570 叶片 昭苏县 74团
F0188 KF454566 果实 富蕴县
65230044 KF454561 果实 阜康白杨河沟
新疆方枝柏
J. pseudosabina
652827-120515-040 KF454564 叶片 和静县巩乃斯沟
652827-120618-300 KF454565 叶片 和静县巩乃斯大阪
654025120903003 KF454567 果实 新源县确鹿特
西伯利亚刺柏
J. sibirica
F0136 KF454568 叶片 富蕴县神钟山温泉
H0082 KF454569 果实 哈巴河县哈拉毛拉
侧柏
Platycladus orientalis
AY380875 GenBank
GQ463478~GQ463480
行遗传距离分析 [17]，用邻接（Neighbor Joining，NJ）法
构建系统聚类树，使用 Bootstrap（1 000 次重复）检
验各分支的支持率 [18]。
2 结果
2.1 新疆圆柏及其混伪品外观比较结果
新疆圆柏、新疆方枝柏及侧柏叶型相似，如 A1、
B1 及 C3，西伯利亚刺柏与前三者略有不同；但在不
同生长期，叶型亦相近，如 A4与 D2。新疆圆柏、新疆
方枝柏、侧柏及西伯利亚刺柏（D4~D7）等的果实均
为球果，形态相似，如 A7、B6 与 D4，A8、B8、C7 与 D7
等，四者的果实特征均没有显著差异。如图 1。
2.2 ITS2 序列信息及种内变异分析
在研究所使用的 14条序列中，ITS2序列长度均
为 219 bp，平均 GC含量为 64.4%。4 种植物种内共
有 3 个变异位点，见表 2。新疆圆柏有 2 个单倍型，
种内平均 K2P 距离为 0.018，KF454561 ~KF454563
与 KF454570序列一致；新疆方枝柏与西伯利亚刺柏
种内无变异。侧柏有 3 个单倍型，GQ463479 与
GQ463480序列一致，种内平均 K2P距离为 0.005 4。
2.3 种间变异分析
新疆圆柏、新疆方枝柏、西伯利亚刺柏、侧柏种
间总变异位点数为 33，信息变异位点数为 28，种间
平均 K2P 距离分别为 0.077、0.041、0.060、0.089。圆
柏属 3 种植物种间变异位点数为 5，分别为 11 bp
位点的 T-C 变异、59 bp 位点的 A-G 变异、153 bp
位点的 G-T 变异、170 bp 位点的 G-A 变异及 196
bp 位点的 T-C 变异；与侧柏比较，属间变异差异显
著，见表 2，图 2。
2.4 NJ 树鉴别
基于新疆圆柏及同属混伪品 10 份样品与 Gen－
Bank 下载的 4 条外源种 ITS2 序列，构建 NJ 树，新
疆圆柏单独聚为 1 支，呈现明显的单系性，可以与
其同属混伪品区分开；新疆方枝柏、西伯利亚刺柏
单独聚为 1 支，可相互区分；外源种侧柏单独为一
支。见图 3。
3 结论
通过对不同产地新疆圆柏及其混伪品的植物
外观形态学比较发现，新疆圆柏及混伪品植物新疆
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表 2 研究样品 ITS2 序列特征
种类 样品数 GC含量/% 单倍型 种内变异位点 种内平均 K2P距离/种间平均 K2P距离
新疆圆柏 4 63.5~63.9 2 22 bp（C-A） 0.001 8/0.077
新疆方枝柏 3 64.4 1 0 0/0.041
西伯利亚刺柏 2 63.9 1 0 0/0.060
侧柏 4 64.8~65.3 3 196 bp（T-C）、215 bp（C-A） 0.005 4/0.089
图 2 不同单倍型变异位点比较
图 3 基于 ITS2 序列构建新疆圆柏及其混伪品的 NJ 树
注：分支支持率≥50%，Bootstrap 1 000次重复。
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方枝柏及侧柏等叶片在不同生长发育阶段叶型会
发生变化 [19]，且外形较为相似，果实的外观亦相像，
药材状态下外观辨别困难。研究选择 DNA 条形码
对维吾尔药材新疆圆柏及其混伪品进行鉴别，ITS2
序列扩增和测序成功率均为 100%，ITS2 序列作为
维吾尔药材新疆圆柏 DNA 条形码具有很好的稳定
性。新疆圆柏、新疆方枝柏、西伯利亚刺柏及侧柏种
间平 均 K2P 距 离 分 别 为 0.077、0.041、0.060 及
0.089，存在显著差异；NJ 树可准确地将 4 种植物区
分。文献记载 Adams 等使用 nrDNA ITS 序列对成功
对刺柏属植物进行了鉴定，并确定了新种 [20，21]。另有
研究表明，多拷贝 ITS2 在区分近缘种过程中具有独
特的能力，ITS2 序列中的变异位点在揭示近缘种进
化历史中具有重要作用，有时仅 1 个变异位点便可
揭示遗传关系和用于 DNA 条形码鉴定 [22~24]。本研究
表明，59 bp 位点的 A-G 种间变异或 170 bp 位点的
G-A 种间变异位点即可鉴定维吾尔药材新疆圆柏
与其易混植物。因此，DNA 条形码 ITS2 序列可用于
维吾尔药材新疆圆柏的真伪鉴别，为药材的标准化
鉴定基础。
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The Identification of Uygur Medicine Juniperus sabina by DNA Barcode
Song Hailong, Fan Congzhao, AYibieke·Rehemudula, Wang Guoping, Li Xiaojin
(Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and Ethnical Materia, Urumqi 830002, China)
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世界科学技术—中医药现代化★专题讨论：中药材研究与开发
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
（责任编辑：李沙沙 张志华，责任译审：王 瑀）
Abstract: To establish the DNA barcode identification method of Uygur Medicine Juniperus sabina. Leaves and
fruits were selected randomly from different areas to contrast morphology; Ten samples were amplified by ITS2 se-
quence, combining with four ITS sequences of Platycladus orientalis obtained from GenBank, intraspecific and inter-
specific variation were compared, K2P and NJ methods were utilized for analysising the relationship. The results
show J. sabina cannot be distinguished with its adulterants by morphological characteristics of leaves and fruits; 14
Samples of ITS2 sequence length are 219 bp, the maximum K2P distance are 0.089. J. sabina and its 3 adulterants
plant can be distinguished by the DNA barcode ITS2 sequence and NJ tree successfully. Therefore, ITS2 barcode
sequence was able to identify J. sabina and its adulterants species, which provides an effective way for the molecular
identification of Uygur medicine J. sabina.
Keywords: Juniperus sabina, ITS2, adulterants, identification
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