全 文 ：doi:10． 3969 / j． issn． 1000-484X． 2016． 09． 010
·中医中药与免疫·
欧洲女贞花粉主要过敏原 Lig v 1 理化性质与结构的生物信息学分析①
曹淑芬 李 文② 何 颖② 邹泽红② 李林梅 艾云灿
(中山大学生命科学学院 /有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广州 510275)
中图分类号 Ｒ392. 8 文献标志码 A 文章编号 1000-484X(2016)09-1291-05
①本文为国家重大科技专项(2014ZX0801105B)。
②呼吸疾病国家重点实验室变态反应研究室 /变态反应国家临床重点专科 /广东省过敏反应与免疫重点实验室 /广州医科大学附属第二医院，
广州 510260。
作者简介:曹淑芬(1990 年 －) ，女，在读硕士，主要从事重组过敏原蛋白的过敏原性评价方面的研究，E-mail:caosf@ hotmail． com。
通讯作者及指导教师:艾云灿(1963 年 －) ，男，博士，教授，主要从事微生物学方面的研究，E-mail:lssayc@ mail． sysu． edu． cn。
［摘 要］ 目的:运用生物信息学相关软件，预测欧洲女贞花粉主要过敏原 Lig v 1 的理化性质和结构，为 Lig v 1 重组表
达系统的选择和过敏原性改造提供参考。方法:查询文献获得 Lig v 1 的氨基酸序列，运用生物信息学软件分析其理化性质
(ProtParam)、信号肽(SignalP 4. 1 Server)、跨膜区(TMHMM Server v. 2. 0)、二级结构(GOＲ4)、MHCⅡ类抗原表位(NetMHCⅡ
2. 2 Server)、B细胞抗原表位(ProteanTM 5. 01)以及系统发生树(MEGA 6)。结果:Lig v 1 在大肠杆菌中稳定性较好，不存在信
号肽与跨膜区;二级结构中无规则卷曲占大多数;Lig v 1 潜在 MHCⅡ类抗原表位为 30 ～ 44 区域;B细胞抗原表位既具有连续
的氨基酸序列，也具有不连续的氨基酸序列;Lig v 1 与欧洲白蜡以及木犀榄的同源蛋白进化距离最近。结论:大肠杆菌是适
合重组 Lig v 1 的表达系统，Lig v 1 抗原表位分析为低过敏原性改造提供参考。
［关键词］ 欧洲女贞;过敏原;生物信息学软件;Lig v 1;抗原表位
In silico prediction for physicochemical properties and structure of major pollen
allergen Lig v 1 in Ligustrum vulgare
CAO Shu-Fen，LI Wen，HE Ying，ZOU Ze-Hong，LI Lin-Mei，AI Yun-Can. School of Life Sciences /State Key Laborato-
ry of Biocontrol，Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510275，China
［Abstract］ Objective:To analyse the physicochemical properties and structure of major privet pollen allergen Lig v 1 using
bioinformatics software and provide a reference for choosing suitable recombinant expression system for Lig v 1 and modifying the aller-
gen Lig v 1 experimentally. Methods:The physicochemical properties were analysed by ProtParam，the signal peptide by SignalP 4. 1
Server，the transmembrane helix by TMHMM Server v. 2. 0，the secondary structure by GOＲ4，MHCⅡ epitopes by NetMHCⅡ 2. 2 Serv-
er，B-cell epitopes by ProteanTM 5. 01 and the phylogenetic tree by MEGA 6. Ｒesults:Privet major pollen allergen Lig v 1 was stable in
Escherichia coli and it doesnt possess any signal peptide and transmembrane helix. Most secondary structures of Lig v 1 were random
coils. Potential region of MHCⅡ epitope of Lig v 1 was 30 － 44. Potential B-cell epitopes possess discontinuous and continuous a mino
acid sequences. Lig v 1 and its counterparts from Fraxinus excelsior and Olea europaea were clustered into one group. Conclusion:
Escherichia coli is the suitable expression system for recombinant Lig v 1. In silico prediction of the epitopes of Lig v 1 provides a refer-
ence for modifying the allergen Lig v 1 experimentally.
［Key words］ Ligustrum vulgare;Allergen;Bioinformatics software;Lig v 1;Epitope
过敏性疾病是当今世界性的重大卫生学问题。
世界变态反应组织对 30 个国家过敏性疾病流行病
调查结果表明，在这些国家的 12 亿人口中，22%的
人口患有依赖于 IgE 介导的各类过敏性疾病，如过
敏性哮喘、过敏性鼻炎、食物过敏、药物过敏，过敏性
疾病严重影响了人们的生活质量，甚至威胁人类生
命［1］。过敏原特异性免疫治疗是唯一可以改变过
敏性疾病自然进程的治疗方法，成功的过敏原特异
性免疫治疗取决于标准化、可持续生产、高质量的过
敏原疫苗;过敏原提取物的质量对临床特异性诊断
的准确性及治疗的有效性都是至关重要的［2］。国
际上使用的过敏原疫苗有过敏原提取物和重组过敏
原，过敏原提取物成分复杂，过敏原标准化程序繁
琐，而重组过敏原成分明确，有利于标准化生产，可
·1921·曹淑芬等 欧洲女贞花粉主要过敏原 Lig v 1 理化性质与结构的生物信息学分析 第 9 期
以保证治疗的疗效和安全性，同时重组过敏原可以
有针对性地改造过敏原的抗原表位，降低过敏原性，
从而获得低过敏原性的过敏原疫苗，提高疫苗的安
全性［3，4］。
前期研究中，我们对 510 个过敏原进行聚类分
析，并将蛋白质数据库中不同物种来源的 60 条主要
过敏原序列聚类成有着明显差异的 7 个簇以后，逐
步聚类缩减到 21 个氨基酸序列无任何相关性的代
表性过敏原，大大减少了重组过敏原的工作量［5，6］。
欧洲女贞(Ligustrum vulgare)花粉主要过敏原 Lig v
1 是 21 个代表性过敏原之一，有关 Lig v 1 的结构与
功能报道较少。本研究利用生物信息学技术分析
Lig v 1 的理化性质和结构，为 Lig v 1 重组表达系统
的选择和低过敏原性改造提供参考。
1 材料与方法
1. 1 Lig v 1 的氨基酸序列获取 查询文献，搜索
欧洲女贞花粉主要过敏原 Lig v 1 的氨基酸序列。
1. 2 Lig v 1 的理化性质预测 使用 ProtParam(ht-
tp:/ /web. expasy. org /protparam /) ，预测 Lig v 1 的理
化性质，包括分子量、等电点、氨基酸组成、原子组
成、消光系数、半衰期、不稳定指数、脂肪指数以及总
平均亲水值。预测 Lig v 1 水溶液(1 g /L)在 280 nm
处光吸收。不稳定指数小于 40，则预测该蛋白为稳
定;不稳定指数大于 40，则预测该蛋白为不稳定。
1. 3 Lig v 1的信号肽预测 通过 SignalP 4. 1 Server
(http:/ /www. cbs. dtu. dk /services /SignalP)［7］，预测
Lig v 1 的信号肽。C-score表示原始切割位点评分，
用于判断信号肽切割位点，紧随信号肽切割位点后
的位置(即成熟蛋白的第一个氨基酸残基)具有 C-
score高峰。S-score表示信号肽评分，用于区分信号
肽与成熟蛋白以及无信号肽的蛋白。Y-score 表示
综合切割位点评分，通过几何平均综合 S-score 的斜
率与 C-score而获得。一段氨基酸序列中可能存在
多个 C-score 高峰，选择同时具有 C-score 高峰与 S-
score高斜率的位点作为切割位点。S 平均值表示
信号肽(第一个氨基酸残基至 Y-score 的前一个氨
基酸残基)的 S-score 平均值。D-score 表示区别评
分，为 S平均值与 Y-score 最高峰的加权平均数，用
于区别信号肽与非信号肽序列。对于非分泌蛋白，
以上评分均极低，接近阴性值 0. 1。
1. 4 Lig v 1 的跨膜区预测 运行 TMHMM Server
v. 2. 0 ( http:/ /www. cbs. dtu. dk /services /TMH-
MM)［8］，预测 Lig v 1 的跨膜区。若预测获得的跨膜
区多于 18 个氨基酸，则该蛋白极可能具有跨膜区或
信号肽。蛋白前 60 个氨基酸中，若存在数个跨膜氨
基酸，则需考虑 N端的跨膜区是否为信号肽。若整
个序列被标注为 inside 或 outside(不能用于预测蛋
白定位) ，则表示该蛋白不存在跨膜区。
1. 5 Lig v 1 的二级结构预测 采用 GOＲ4(http:/ /
npsa-prabi. ibcp. fr /cgi-bin /npsa_automat. pl?page =
npsa_gor4. html)［9］，预测 Lig v 1 的二级结构。
1. 6 Lig v 1 的 MHCⅡ类抗原表位预测 运用 Net-
MHC Ⅱ 2. 2 Server (http:/ /www. cbs. dtu. dk /serv-
ices /NetMHCⅡ /) ，预测 Lig v 1 的 MHCⅡ类抗原表
位［10，11］。以每 13 个相邻氨基酸为一段待测多肽，
预测其与 MHCⅡ类亲和力(Affinity) ，强亲和力阈值
50 nmol /L，弱亲和力阈值 500 nmol /L，转化为数值 1
－ log(Affinity)/ log(50 000) ，分别为0. 638 4与0. 425
6［12］。
1. 7 Lig v 1 的 B 细胞抗原表位预测 采取 Prote-
anTM 5. 01(DNASTAＲ，Madison，WI)中的 Jameson-
Wolf方案预测 Lig v 1 的抗原指数，选取抗原指数不
低于 1 的位点作为 B细胞抗原表位［13］。
1. 8 Lig v 1 的交叉过敏反应预测 选择 BLAST工
具(http:/ /www. uniprot. org /blast /) ，搜索 Lig v 1 潜
在的同源蛋白，入选标准:连续 80 个氨基酸同一性
大于 35%［14］。经由 Clustal Omega 工具(http:/ /
www. ebi. ac. uk /Tools /msa /clustalo /)进行氨基酸序
列比对。选取 MEGA 6 软件中的邻位相连(N-J)方
法得到系统发生树［15］。
2 结果
2. 1 Lig v 1 的氨基酸序列获取 Batanero 等［16］报
道了欧洲女贞花粉主要过敏原 Lig v 1 的氨基酸序
列，该过敏原被 UniProt数据库收录为 O82015。
2. 2 Lig v 1 的理化性质预测 Lig v 1 等电点为
5. 91，由 145 个氨基酸组成，含有 18 个带负电氨基
酸(天冬氨酸与谷氨酸)、17 个带正电氨基酸(精氨
酸与赖氨酸) ，谷氨酸含量(12 个，占 8. 3%)最高，
其次为甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苏氨酸以及
缬氨酸(均为 11 个，分别占 7. 6%)。分子式为 C732
H1147N191O218S9，分子量为 16 399. 8 Da。若半胱氨酸
均形成胱氨酸，则其消光系数为 13 325 M －1 cm －1，
吸光度为 0. 813;若半胱氨酸均不形成胱氨酸，则其
消光系数为 12 950 M －1cm －1，吸光度为 0. 79。Lig v
1 在大肠杆菌、哺乳动物网状细胞(体外)以及酵母
中半衰期分别为 10 h以上、1 h以及 30 min。Lig v 1
不稳定指数为 40. 3，提示其为不稳定蛋白。Lig v 1
脂肪系数为 75. 17，提示其不耐热。Lig v 1 总平均
·2921· 中国免疫学杂志 2016 年第 32 卷
亲水值为 － 0. 376，提示其易溶于水。
2. 3 Lig v 1 的信号肽预测 Lig v 1 信号肽预测结
果(图 1)显示，第 25 个位点精氨酸的 C-score 为最
大值 0. 137;第 25 个位点精氨酸的 Y-score 为最大
值 0. 114;第 38 个位点甘氨酸的 S-score 为最大值
0. 137;第 1 至 24 个位点的 S 平均值为 0. 095;第 1
至 24 个位点的 D-score 为 0. 104，远低于 D-score 阈
值 0. 45，预测 Lig v 1 不存在信号肽。
2. 4 Lig v 1 的跨膜区预测 Lig v 1 跨膜区预测结
果(图 2)显示，跨膜区氨基酸数目、蛋白前 60 个位
点存在的跨膜氨基酸数目，以及 N 端存在于细胞质
一侧的可能性均约为 0，整个序列被标注为 outside，
因此不存在跨膜区。
2. 5 Lig v 1 的二级结构预测 Lig v 1 二级结构预
测结果 (图 3)显示，无规则卷曲占大多 数
(64. 83%) ;其次为延伸链(27. 59%) ;α-螺旋所占
比例最少(7. 59%) ，集中于第 60 至第 69 位氨基酸。
2. 6 Lig v 1 的 MHCⅡ类抗原表位预测 MHCⅡ类
抗原表位预测结果(图 4)显示，Lig v 1 有 43 个肽段
与MHCⅡ具有强亲和力，包括以下区域:22 ～ 45，
图 1 Lig v 1 的信号肽预测
Fig． 1 Prediction of signal peptide:Lig v 1
图 2 Lig v 1 的跨膜区预测
Fig． 2 Prediction of transmembrane helix:Lig v 1
52 ～ 92、99 ～ 145，亲和力最强为 32 ～ 44 区域;具有
弱亲和力的肽段为 102 个。潜在 MHCⅡ类抗原表
位为 30 ～ 44 区域。与强亲和力相关的基因型为
HLA-DQA10501-DQB10301、HLA-DＲB10101、HLA-
DＲB10301、HLA-DＲB10401、HLA-DＲB10404、HLA-
DＲB10405、HLA-DＲB10701、HLA-DＲB10901、HLA-
DＲB11101、HLA-DＲB11302 与 HLA-DＲB50101，提
示具有以上基因型的人对 Lig v 1 产生过敏反应的
可能性较高。
2. 7 Lig v 1 的 B 细胞抗原表位预测 预测结果
(图 5)显示，Lig v 1 的 B 细胞抗原表位存在连续的
氨基酸序列与单个氨基酸，推测 B 细胞抗原表位由
线性表位与构象表位组成。潜在 B 细胞抗原表位
存在于以下氨基酸位点:1 ～ 7、21 ～ 23、26、42 ～ 50、
52、84 ～ 95、97 ～ 99、102、103、111 ～ 113、126 ～ 131。
2. 8 Lig v 1 的交叉过敏反应预测 在 UniProt数据
库中搜索获得 Lig v 1 潜在的同源蛋白，所属物种及
登录号如下:梣属欧洲白蜡(Q7XAV4)、木犀榄属木
犀榄(P19963)、拟南芥属拟南芥(Q9LP44)、芸苔
属欧洲油菜(A0A078EG50)、鼠耳芥属琴叶拟南芥
图 3 Lig v 1 的二级结构预测
Fig． 3 Prediction of secondary structure:Lig v 1
图 4 Lig v 1 的MHCⅡ类抗原表位预测
Fig． 4 Prediction of MHCⅡ epitopes:Lig v 1
·3921·曹淑芬等 欧洲女贞花粉主要过敏原 Lig v 1 理化性质与结构的生物信息学分析 第 9 期
图 5 Lig v 1 的 B 细胞抗原表位预测
Fig． 5 Prediction of B-cell epitopes:Lig v 1
图 6 Lig v 1 的系统发生树
Fig． 6 Phylogenetic tree for Lig v 1
(D7MCQ3)、可可属可可树(A0A061GFS0)、桦木属
垂枝桦(O49813)以及苜蓿属蒺藜苜蓿(B7FGN2)。
Lig v 1 与欧洲白蜡及木犀榄中同源蛋白的序列相
似度较高，分别为 91. 0%及 86. 9%，并且系统发生
树(图 6)显示，Lig v 1 与这两种蛋白进化距离最近，
更可能发生交叉过敏反应。
3 讨论
常见的重组蛋白表达系统包括大肠杆菌、枯草
芽孢杆菌、链霉菌、酵母、昆虫、杜氏盐藻、植物和哺
乳动物细胞，其中大肠杆菌、酵母表达重组蛋白具有
流程简单、成本低和产量高的特点，广泛应用于过敏
原的重组表达［16，17］。Lig v 1 在大肠杆菌中半衰期
大于 10 h，而在酵母中半衰期仅为 30 min，这提示用
大肠杆菌表达 Lig v 1 更稳定，表达重组过敏原 Lig v
1 优先选择大肠杆菌。不稳定指数与脂肪系数预测
结果提示，Lig v 1 可能不稳定且不耐热，在蛋白表
达、纯化与保存等操作中应在低温下进行。Lig v 1
的总平均亲水值预测其为亲水蛋白，可能较易溶于
水溶液，如生理盐水和磷酸盐缓冲液，利于动物模型
建立与细胞实验等方面的应用。此外，Lig v 1 不存
在信号肽与跨膜区(图 1、2) ，这提示该蛋白不是分
泌蛋白和跨膜蛋白。
自从 Freeman首次使用过敏原特异性免疫治疗
成功治疗枯草热，过敏原特异性免疫治疗已经有
100 多年历史［18］。传统的过敏原特异性免疫治疗
都采用过敏原提取液，最近人们开始探索表位疫苗
和低过敏原性的过敏原疫苗的应用。Chen 等［19］构
建屋尘螨过敏原 Der p 1 /Der p 2 的多表位疫苗，该
疫苗缺乏 IgE反应性，但保留 T细胞反应性，能够诱
导产生 IgG，从而阻断 IgE反应，具有潜在治疗效果。
Marazuela等［17］在桦树花粉中发现一种与 Ole e 1 同
源的非过敏性蛋白，在此基础上对 Ole e 1 过敏原 4
个氨基酸位点进行突变，获得的 Ole e 1 突变体 T细
胞反应性不变而 IgE反应性降低。设计表位疫苗或
低过敏原性的过敏原疫苗首先要求对过敏原的抗原
表位进行分析和鉴定。Karplus 等［20］认为，蛋白质
结构中柔韧性大的区域易形成抗原表位。由于 α-
螺旋与延伸链这两种二级结构由氢键维系，结构稳
定，柔韧性低于无规则卷曲，所以抗原表位常见于无
规则卷曲。本研究利用生物信息学软件预测 Lig v 1
的 MHCⅡ类抗原表位和 B细胞抗原表位，发现大部
分均由无规则卷曲组成(图 4、5)。后续研究将对
Lig v 1 的 MHCⅡ类抗原表位进行定点突变，降低其
过敏原性，为欧洲女贞花粉过敏性疾病提供安全有
效的候选疫苗。系统发生树分析表明，Lig v 1 与欧
洲白蜡以及木犀榄的同源蛋白进化距离最近(图
6) ，且这三者同属于木犀科植物，提示这三种过敏
原可能存在交叉过敏反应，未来通过定点突变获得
低过敏原性 Lig v 1 突变体，将对三种过敏原引起的
过敏性疾病都有潜在的治疗效果。
本研究利用生物信息学软件分析欧洲女贞花粉
主要过敏原 Lig v 1 的理化性质和结构，为蛋白克隆
表达及纯化提供理论支持，而 MHCⅡ类抗原表位及
系统发生树分析为后续 Lig v 1 的单克隆抗体设计、
抗原表位疫苗设计、过敏原性改造乃至脱敏治疗等
深入研究提供了参考。
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(编辑 许四平)
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［收稿 2015-11-06 修回 2015-11-30］
(编辑 倪 鹏)
·8921· 中国免疫学杂志 2016 年第 32 卷