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滇牡丹愈伤组织继代培养中的褐化防治



全 文 :第 31 卷 第 2 期   中 南 林 业 科 技 大 学 学 报    Vo l.31 No.2
 2011 年 2 月 Journal of Central South University of Forestry & Technology  Feb.2011
滇牡丹愈伤组织继代培养中的褐化防治
张艳丽1 ,刘秀贤1 ,王 雁2 ,李正红1
(1.中国林业科学研究院 资源昆虫研究所 ,云南 昆明 650224;2.中国林业科学研究院 林业研究所 , 北京 100091)
摘 要: 以滇牡丹 Paeonia de lavay i Franch 成熟种胚诱导出的愈伤组织为试验材料 ,研究了 PVP、VC 、结冷胶 、
AgNO3 、水解乳蛋白(LH)5 种抗褐化剂在牡丹愈伤组织继代培养过程中的褐化控制作用和对愈伤组织生长量的
影响。结果表明:愈伤组织褐化主要发生在第一次继代转接后的 10 d 内;在愈伤组织两次继代培养过程中 , 3.5
g/ L的结冷胶处理抗褐化效果最好 , LH 和 AgNO 3 在整个继代过程中也表现了一定的抗褐化性 , PVP 和 VC 抗褐
化性能相对较差。 AgNO3 对愈伤组织生长具有明显的促进作用。
关键词: 滇牡丹;组织培养;愈伤组织;抗褐化剂;褐化防治
中图分类号: S685.11 文献标志码: A 文章编号: 1673-923X(2011)02-0077-05
Study on browning prevention of callus subculture of Paeonia delavayi
ZH ANG Yan-li1 , LIU Xiu-x ian1 , WANG Yan2 , L I Zheng-hong1
(1.Research Institute o f Resource Insect , CAF , Kunming 650224 , Yunnan , China;
2.Research Institute of Forestr y , CAF , Beijing 100091 , China)
Abstract:By taking the callus induced f rom mature embryos o f Paeonia de lavay i F ranch as the testing materials ,
the effects of fiv e anti-brow ning agents such as PVP , vitamin C , gellan gum , silv er nitrate , lactoprotein hydroly-
sate on browning prevention and g row th of callus were studied in the process of successive transfe r culture of tree
peony callus.The re sults show that callus browning occurred during the first ten day s o f the first sub-culture;Dur-
ing the twice callus subculture , gellan gum of 3.5 g/ L w as most effective anti-browning agent to contro l brow ning ,
lactopro tein hydro ly sate and silve r nitra te show ed cer tain anti-brow ning in who le process of subculture , and PVPP
and vitamin C w ere w or se in anti brow ning perfo rmance than other three agents;silve r nitra te had an obvious pr o-
mo tion action to the gr ow th o f callus.
Key words:Paeonia de lavay i Franch;tissue culture;callus;anti-browning agents;brow ning prevention
  滇牡丹 Paeonia delavay i Franch[ 1] 是中国西
南地区的特有种 ,是芍药属分布最南的一个牡丹类
群 ,在芍药属植物的起源 、演化和地理分布研究上
有着重要的学术价值[ 2] 。滇牡丹拥有包括白色 、纯
黄色 、绿色 、红色 、紫色等珍贵花色基因资源 ,因此
有可能通过杂交育种技术 ,培育具自主知识产权的
黄色 、红色及其它色系的牡丹新品种 ,丰富中国牡
丹品种群的花色 。然而 ,滇牡丹传统的繁殖方法效
率低 、育种周期长 ,一直是生产和育种发展面临的
重大问题。组培快繁是促进滇牡丹植株再生的一
个重要方式[ 3] 。但滇牡丹为木本植物 ,次生代谢旺
盛 ,组织培养过程中褐化现象严重 , 80%以上的茎
尖都会产生褐色物质[ 4] 。近年来 , 何松林等[ 5] 、张
俊琦等[ 6] 、李萍等[ 7] 、吴丹[ 8] 、周秀梅[ 9]等对牡丹组
  收稿日期:2010-05-18
  作者简介:张艳丽(1984-),女,河北唐山人 ,硕士研究生 ,主要从事花卉的引种与驯化研究;E-mail:hb tszhangx@163.com
  通讯作者:李正红(1964-),云南景东人 ,研究员 ,主要从事花卉的引种与驯化研究
DOI :10.14067/j.cnki.1673-923x.2011.02.018
培研究均取得了不同程度的进展 ,但滇牡丹的愈伤
褐化问题仍是急需解决的问题之一 。
有人报道了在牡丹叶片和叶柄离体培养中的
褐化控制问题[ 5] 和组培苗在继代培养中的褐化控
制情况[ 7] 。在种胚间接诱导体胚继代培养过程中
愈伤组织也会发生严重褐化 ,从而使体胚诱导难以
进行 ,但针对这方面的褐化控制研究尚未见报道。
水解乳蛋白常用于配制植物组织培养基和某些细
菌培养基 ,经本实验小组前期研究表明水解乳蛋白
在滇牡丹组培中具较好的抗褐化作用 ,而这方面的
研究也尚未见报道 。本实验以继代培养中滇牡丹
愈伤组织的褐化控制为目的 ,同时研究探讨 5种抗
褐化剂(PVP 、VC 、结冷胶 、AgNO 3 、水解乳蛋白
(LH))对滇牡丹愈伤组织生长的影响 ,以期找到既
能控制褐化 ,又不影响生长的方法 ,从而较好解决
滇牡丹组培中的褐化问题 ,并对其它牡丹种组织培
养的褐化控制提供一定借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料
实验原始材料为滇牡丹成熟饱满种子种胚 ,于
2009年 9月在澄江梁王山采集。
1.2 方法
1.2.1 滇牡丹愈伤组织诱导
(1)外植体的预处理及接种方法 取采集的滇
牡丹种子先用洗衣粉水浸泡 20 min ,再用流水冲洗
1h后 ,在超净工作台上用 75%的乙醇进行表面消
毒 30 s ,用无菌水冲洗 3次 ,然后用 0.1%的 HgC l2
溶液处理 8 min ,最后用无菌水冲洗 5次 。切开胚
乳 ,取出种胚 ,接种于培养基 A 中培养待用。
(2)培养基 A:MS + 6-BA2.0 +2.4-D 1.0
+VC 0.1 g/L +AC 2.0 g/L ,琼脂 7.0 g/L ,pH
=7.0。培养条件:暗培养 ,温度:25℃。
1.2.2 抗褐化剂在滇牡丹愈伤组织培养过程中的
抗褐化作用及对其生长量的影响
  本实验选用前人研究中认为抗褐化效果好的
基本培养基[ 7] ,通过选用不同抗褐化剂探讨其对褐
化的抑制及对滇牡丹愈伤生长量的影响 ,以期找到
既能控制褐化又不影响愈伤生长量的方法 ,从而较
好的解决褐化现象。
(1)转接方法 选取质量好的愈伤组织进行转
接 ,每处理接种 10块愈伤组织 ,重复 3次 。
(2)抗褐化剂选用 将愈伤转接到含有不同抗
褐化剂的 B0培养基中 。(A1-A3):PVP 500 mg/
L 、1 000 mg/ L 、2 000 mg/ L;(B1-B3):VC 50 mg/
L 、100 mg/L 、200 mg/L ;(C1-C3):分别用结冷胶
2.0 g/L 、2.5 g/L 、3.5 g/ L 代替琼脂;(D1-D3):
AgNO 3 6 mg/ L 、8 mg/ L 、10 mg/L;(E1-E3):水
解乳蛋白(LH)300 mg/L 、500 mg/L 、700 mg/L。
B0:1/2改良 WPM [ 7] +NAA 0.5 mg/L +6-BA2.0
mg/L ,琼脂 7.0 g/ L ,pH =7.0 。培养条件:光照时
间 12 h / d ,25℃。
(3)褐化测定指标 根据褐化颜色程度将愈伤
组织进行分级:褐色无或浅 、中 、较深 、深 4级 ,分别
用 0 、1 、2 、3表示 ,以褐化指数[ 10] 量化褐化情况。褐
化指数计算公式:
褐化指数 =∑(褐化级数×该褐化级别块数)总株数×4
×100%。
(4)滇牡丹愈伤生长量测定方法 每 20 d统计
一次生长量 ,方法是先用电子天平称出培养基的质
量 ,然后将愈伤组织转接进去 ,再称出培养基和愈
伤组织的总质量 ,两者差值为愈伤组织的质量。培
养 20 d后再称培养基和愈伤组织的总质量 ,愈伤转
出后再称培养基质量 ,两次差值为愈伤组织质量 ,
最终两个愈伤组织质量差值为 20 d内愈伤增长量。
再次转接时重复上述操作 。
2 结果与分析
2.1 抗褐化剂对滇牡丹愈伤组织褐化发生的影响
在转接后第一天即可发现在愈伤的伤口部位
出现褐化现象。其中添加 PVP 处理的愈伤褐化现
象大部分扩散至培养基中 ,致使愈伤周围培养基变
褐;添加结冷胶处理仅有当愈伤褐化达 4级时才扩
散至周围培养基使之变褐 ,其他 3种激素处理愈伤
褐化现象基本不会扩散至其周围培养基 。
从图 1 、图 2可知 ,各处理均出现不同程度的褐
化现象 ,但均比对照褐化程度小 。且随着培养时间
的延长褐化程度在逐步加深 ,褐化主要发生在培养
的前 10 d ,之后培养褐化加深程度明显减缓 ,与前
人在牡丹组培苗褐化研究中的结果不同[ 7] 。
78 张艳丽 , 等:滇牡丹愈伤组织继代培养中的褐化防治   第 2 期
图 1 滇牡丹愈伤组织第一次继代的褐化指数
Fig.1 The browning index of callus f irst subculture of Paeonia de lavay i
图 2 滇牡丹愈伤组织第二次继代的褐化指数
Fig.2 The browning index of callus second subculture of Paeonia delavayi
  由图 1可知 ,第一次继代时在培养的前 10 d各
系列的褐化指数均小于 50%,之后均有不同程度的
增加但程度小于前 10 d。PVP 处理在不同的时期
各浓度的抗褐化性不同 ,并未呈某一规律;VC处理
中 100 mg/L 的抗褐化性较好;结冷胶的处理抗褐
化效果整体较好 ,其中添加 3.5 g/ L 结冷胶时抗褐
化效果最好;AgNO 3 和 LH 的抗褐化规律较为一
致 ,在培养的前 10 d AgNO 3 10 mg/L 及 LH 500
mg/L 在各处理组中抗褐化效果好 ,而在后 10 d的
培养中则是 AgNO 3 6 mg/ L 及 LH 700 mg/ L 在各
组处理中抗褐化效果好。
由图 2可知 ,在第二次继代培养中 ,各处理的
褐化加深速度减缓 ,各抗褐化剂处理的抗褐化效果
差异更为明显 ,其中结冷胶的抗褐化效果最好 ,且
所试验的三浓度的抗褐化效果变化不大;其次为
LH ,从整体看 300 、500 mg/ L 浓度抗褐化效果相差
不大 ,而当浓度增加到 700 mg/ L 时抗褐化效果相
对较差。
2.2 抗褐化剂对滇牡丹愈伤组织生长量的影响
由表 1可知 ,PVP 处理中第一次继代中三种浓
度处理之间不存在显著差异 ,第二次继代 500 mg/
L 处理生长量与其他两种浓度处理存在显著差异 ,
生长量低于其他两种浓度的;VC 处理生长量随浓
度的增加而升高 ,仅在第一次继代中 50 mg/L 与
200 mg/L 处理存在显著差异 ,其余均不存在显著
79第 31 卷      中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
差异;结冷胶 、A gNO 3 、LH 处理对愈伤生长量影响
作用基本一致 ,各浓度间均不存在显著差异 。第一
次继代生长量较大的 7个处理为:AgNO3 8 mg/L
>VC 200 mg/L >PVP 1 000 mg/L >AgNO 3 10
mg/L>LH 500 mg/L>结冷胶 3.5 g/L >LH 700
mg/L;第二次继代生长量较大的为 7 个处理为:
AgNO 38 mg/L >A gNO 310 mg/L >结冷胶 3.5 g/
L >LH 700 mg/L >LH 500 mg/ L >结冷胶 2.0
g/ L>结冷胶 2.5 g/L。
表 1 滇牡丹愈伤组织生长量变化
Table 1 The changes of callus growth of Paeonia delavayi
处理组 平均生长量/ g
0~ 20/ d 21~ 40/d
A1 0.53±0.21ab 0.40±0.18ab
A2 0.81±0.37bc 0.63±0.19cd
A3 0.66±0.3abc 0.63±0.2cd
B1 0.50±0.1a 0.33±0.13a
B2 0.69±0.2abc 0.41±0.14ab
B3 0.82±0.18c 0.43±0.18ab
C1 0.72±0.21abc 0.66±0.17cd
C2 0.68±0.16abc 0.66±0.13cd
C3 0.73±0.36abc 0.71±0.14cd
D1 0.48±0.16c 0.29±0.06d
D2 0.83±0.25bc 0.82±0.27d
D3 0.79±0.36abc 0.77±0.26cd
E1 0.68±0.32abc 0.56±0.2cd
E2 0.75±0.2abc 0.66±0.22cd
E3 0.73±0.2bc 0.70±0.21cd
3 分析与讨论
3.1 抗褐化剂对滇牡丹愈伤褐化的影响
本实验发现各抗褐化剂对愈伤褐化的控制处
于一种动态的变化 ,第一次继代完成时抗褐化效果
较好的七个处理为:结冷胶 3.5 g/ L 、结冷胶 2.0
g/ L 、结冷胶 2.5 g/ L 、LH 700 mg/L 、A gNO 36 mg/
L 、AgNO 3 8 mg/L 、LH 500 mg/ L;第二次继代完成
时抗褐化效果较好的七个处理为:结冷胶 2.5g/L 、
结冷胶 2.0 g/L 、结冷胶 3.5 g/ L 、 LH 700 mg/L 、
LH 500 mg/ L 、LH 300 mg/L 、AgNO 3 8 mg/L。
结冷胶在整个继代培养过程中均表现了较好
的抗褐化性 ,3.5 g/ L的结冷胶处理最为适宜;其次
为 LH 和 AgNO3 在整个继代过程中也表现了一定
的抗褐化性 ,PVP 和 VC抗褐化性相对较差 。张俊
琦等[ 6] 在牡丹组织培养中褐化的发生原因与防止
方法的研究中表明 PVP 和结冷胶能有效的缓解褐
化 ,VC 则加剧了组培培养物的褐化程度 ,与本实验
结果有一定的出入 ,可能是由于材料不同而导致这
一现象的发生。
3.2 抗褐化剂对滇牡丹愈伤生长量影响
抗褐化剂对愈伤组织生长量具明显促进作用
的处理是添加 AgNO 3 组 ,这与抗褐化剂对组培苗
的生长影响一致[ 7] 。结冷胶和 LH 在第一次继代
过程中并未表现明显的促进作用 ,但第二次继代时
则表现了较明显的促进作用;而PVP 和 VC愈伤生
长量的影响相反 ,说明结冷胶和 LH 的累积作用在
一定程度上促进了愈伤生长量的增加。
3.3 抗褐化剂与滇牡丹愈伤组织褐化及生长量
在组培过程中抗褐化剂的添加是组培褐化控
制中最常见的方法 ,而最理想的抗褐化剂是其在能
控制褐化的同时又不能影响愈伤的正常生长。本
实验研究结果表明结冷胶 3.5 g/L 处理在整个继
代培养过程中表现出较佳的抗褐化性且愈伤生长
量相对也较高;其次为 AgNO3 8 mg/L 、A gNO 3 10
mg/L 、LH 500 mg/ L 处理具较好的抗褐化性同时
其愈伤生长量也较高 。而抗褐化剂是通过某种机
制直接影响愈伤生长量还是通过影响愈伤的褐化
从而间接影响生长量则需做进一步的研究探索。
LH 是用乳蛋白经胰酶消化而成 ,含丰富的人
体必需氨基酸[ 11] ,有机氮对很多植物生长有着良好
的促进作用 ,故水解乳蛋白常用于配制植物组织培
养基和某些细菌培养基。目前 ,关于水解乳蛋白对
植物愈伤组织生长发育方面研究较多[ 11-13] ,而尚
未发现有关水解乳蛋白对牡丹组织培养作用的报
道。本实验研究表明 LH 对愈伤组织褐化有良好
的控制作用 ,但对愈伤组织生长量促进方面并未显
示出明显优势 ,究其原因是材料 、添加浓度亦或其
他因素影响可能需要从酶活性 、物质代谢等方面进
行深入的研究解决。
参考文献:
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[本文编校:文凤鸣]
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