全 文 ：188
大孔树脂纯化新疆圆柏总黄酮工艺研究
李 倩1，奥斯曼江·麦提图尔荪2，李晨阳3，徐 芳3，赵 军3，*
(1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830046;
2.新疆医科大学公共卫生学院，新疆乌鲁木齐 830011;
3.新疆药物研究所维吾尔药重点实验室，新疆乌鲁木齐 830004)
收稿日期:2015－09－17
作者简介:李倩(1992－)，女，硕士研究生，研究方向:药食兼用植物的研究与开发，E－mail:yaaitingzheng@ 163.com。
* 通讯作者:赵军(1973－)，男，博士，研究员，研究方向:中药与天然药物化学研究，E－mail:zhaojun21cn@ 163.com。
基金项目:国家自然科学基金(81160515)。
摘 要:通过比较 D101、AB－8、HPD400、HPD500、HPD417、HPD826 六种大孔树脂的静态吸附效果，从中筛选出适合分
离新疆圆柏总黄酮的树脂，并在单因素实验基础上正交优化最佳大孔树脂对新疆圆柏总黄酮的纯化工艺。结果表明，
D101 大孔树脂对新疆圆柏总黄酮具有较好的分离效果;最佳纯化工艺条件为，上样浓度 1.2256 mg /mL，上样流速
1.0 mL /min，除杂用水量 5 BV，乙醇浓度 50%，洗脱剂用量 4 BV，洗脱流速 1.0 mL /min。在此条件下获得总黄酮回收
率为 88.36%，纯度为 69.96%。
关键词:新疆圆柏，总黄酮，大孔树脂，纯化
Purification of total flavonoids from juniperus sabina l.
by macroporous resin
LI Qian1，MAITITUEＲSUN Aosimanjiang2，LI Chen－yang3，XU Fang3，ZHAO Jun3，*
(1.College of Life Sciences＆Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China;
2.College of Public Health，Xinjiang Medical Unicersity，Urumqi 830011，China;
3.Xinjiang Key Laboratory for Uighur Medicines，Xinjiang Institute of Materia Medica，Urumqi 830004，China)
Abstract:By comparing the static adsorption effect of D101，AB － 8，HPD400，HPD500，HPD417 and HPD826
macroporous resin，resin was screened out for separating total flavonoids from Juniperus sabina L.And purification
process of total flavonoids from Juniperus sabina L.was optimized by orthogonal exceperiments based on single
factor exceperiments. the results showed that D101 macroporous resin for total flavonoids had good separation
effect.The optimal parameters for purification were as follows:the sample concentration of 1.2256 mg /mL，the
sample flow rate of 1.0 mL/min，water consumption on removing impurity of 5 BV，ethanol concentration of 50%，
eluting agent volume of 4 BV，desorption rate of 1.0 mL/min.Under these conditions total flavonoids had a recovery
rate of 88.36% and a purity of 69.96% .
Key words:Juniperus sabina L.;total flavonoids;macroporous resin;purification
中图分类号:TS284.2 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2016)07－0188－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2016． 07． 028
新疆圆柏(Juniperus sabina L.)为柏科圆柏属植
物，又称叉子圆柏、爬柏、臭柏、沙地柏等，广泛分布
于我国新疆、甘肃、内蒙古和陕北的干旱荒山和沙地
之中［1］。该植物的药用部位为嫩枝叶和果实，味微辛
辣而稍苦，气辛香，在维吾尔医临床中用于风寒头
痛、风湿性关节炎等疑难病症的治疗［2］。圆柏属植物
含有双黄酮、木脂素、二萜和倍半萜等多种类型的化
合物，黄酮类化合物是其主要的标示性成分［3－5］。近
年来已有关于新疆圆柏总黄酮的提取研究［6－7］，但对
大孔树脂纯化新建圆柏总黄酮的研究未见报道。大
孔树脂是一类不溶于酸、碱各种有机溶剂，具有较好
吸附性的有机高分子聚合物［8］，广泛用于黄酮、多酚
等活性物质的分离纯化［9－10］。本文在前期研究基础
上，系统地研究了新疆圆柏总黄酮在大孔树脂上的
吸附和解吸附规律，确定了新疆圆柏总黄酮的大孔
树脂最佳纯化工艺，为其富集纯化和工业化生产提
供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
新疆圆柏 2014 年 9 月采自新疆乌鲁木齐南
山，由新疆药物研究所何江副研究员鉴定为新疆圆
柏 Juniperus sabina L.的枝叶，储存于新疆药物研究所
标本室。将新疆圆柏枝叶脱脂干燥后粉碎，过 50 目
189
筛，装于样品袋中备用。
芦丁对照品 中国药品生物制品鉴定所(批号
10080 － 200707);大孔吸附树脂(D101、AB － 8、
HPD400、HPD500、HPD417、HPD826) 天津兴南允
能高分子技术有限公司;柱层层析硅胶 青岛海洋
化工厂分厂;其它试剂均为国产分析纯。
AL204 电子天平 梅特勒－托利多仪器(上海)
有限公司;752 型紫外分光光度计 上海科宇实验仪
器厂;N－1100 旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公
司;DZTW型调温电热套 北京市永光明医疗仪器有
限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品溶液的制备 取新疆圆柏枝叶样品
100 g，以料液比 1∶25(g /mL)加入 50%乙醇，回流提
取 3 次，每次提取 1.5 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至
膏状。然后以适量硅胶拌样后上硅胶柱，分别用石
油醚、石油醚－乙酸乙酯(1 ∶1)、石油醚－乙酸乙酯
(2∶8)、60%乙醇洗脱。收集 60%乙醇洗脱液，减压
浓缩至无乙醇味后，再用蒸馏水溶解制成样品溶液，
待用。
1.2.2 标准曲线的绘制 准确称取干燥恒重的芦丁
标准品 0.0100 g，甲醇溶解并定容于 50 mL 容量瓶
中，摇匀，制得芦丁对照品浓度为 0.200 mg /mL。精
确量取 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL芦丁对照品溶液分别
置于 25 mL容量瓶中，分别加入 5% NaNO21.0 mL，
摇匀，放置 6 min 后加入 10% Al(NO3)3 1.0 mL，摇
匀，放置 6 min后加入 4%NaOH 10.0 mL，用去离子水
定容 25 mL，放置 10 min 后，以相应试剂为空白，于
509 nm 波长处测定吸光度。以芦丁质量浓度(C，
mg /mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制芦丁标
准曲线。
1.2.3 大孔吸附树脂型号的筛选 称取经预处理的
不同型号大孔树脂 2.0 g，置于 100 mL 磨口三角瓶
中，加入样品溶液(总黄酮含量为 0.8614 mg /mL)
30 mL，每隔 10 min 振摇 1 min，持续 2 h，然后静置
22 h。充分吸附后，测定吸附前后溶液中黄酮的含量，
计算吸附量和吸附率。进一步用去离子水洗去残留
的黄酮，吸干水分后加入 30 mL 70% 乙醇，每隔
10 min振摇 1 min，持续 2 h，然后静置 22 h。充分解
吸后，测定解吸液中新疆圆柏总黄酮的含量，计算解
吸率。
吸附量(mg总黄酮 / g树脂)=
(C0－C1)V1
m
吸附率(%)=
C0－C1
C0
× 100
解吸率(%)=
C3V2
(C0－C1)V1
× 100
式中:C0:吸附前总黄酮浓度，mg /mL;C1:吸附后
总黄酮浓度，mg /mL;C2:解吸液中总黄酮浓度，
mg /mL;V1:样液体积，mL;V2:解吸液体积，mL;m:树
脂的质量，g。
1.2.4 大孔吸附树脂的静态吸附动力学特性测
定 称取经预处理的 D101 树脂 10 g，置于 500 mL
具塞磨口锥形瓶中，加入 0.8614 mg /mL 样品溶液
150 mL，在室温下振摇，按时间点(1、2、3、4、6、8、10、
12、24 h)吸取上清液测定总黄酮浓度。以时间为横
坐标，吸附率为纵坐标，绘制静态吸附动力学曲线。
1.2.5 大孔树脂动态吸附与解吸工艺研究
1.2.5.1 上样浓度对吸附量的影响 量取 D101 树脂
15 mL，湿法装柱，分别加入浓度为 0.6128 mg /mL
(160 mL)、1.2256 mg /mL(80 mL)、2.4512 mg /mL
(40 mL)、4.9023 mg /mL (20 mL)、9.8046 mg /mL
(10 mL)的样品溶液，上样流速 2.0 mL /min。上样完
成后，用水洗至流出液无色，合并流出液，测定总黄
酮浓度，计算吸附量。
1.2.5.2 上样流速对吸附量的影响 量取 D101 树脂
15 mL，湿法装柱，加入 2.4512 mg /mL样液 40 mL，调
节上样流速分别为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL /min。上
样完成后，用水洗至流出液无色，合并流出液，测定
总黄酮的浓度，计算吸附量。
1.2.5.3 最大上样量的确定 量取 D101 树脂15 mL，
湿法装柱，加入 2.4512 mg /mL 样液，上样流速
2.0 mL /min;每一个柱体积收集一个流份，测定每一
个柱体积中总黄酮的浓度，绘制泄露曲线。
1.2.5.4 除杂用水量的确定 量取 D101 树脂15 mL，
湿法装柱，以上样流速 2.0 mL /min 加入浓度为
2.4512 mg /mL样液 75 mL。上样完成后，用水洗脱，
每一个柱体积收集一个流份，将每一个流份浓缩干
燥至恒重。
1.2.5.5 洗脱剂的选择 量取D101树脂15 mL，湿法装
柱，以上样流速 2.0 mL/min 加入浓度为 2.4512 mg /mL
的样液 75 mL。上样完成后，用 75 mL水洗，再分别用
30%、50%、70%、95%乙醇溶液 75 mL以 2 mL /min的
流速洗脱，收集洗脱液，定容至 100 mL，测定总黄酮
的含量，计算回收率。然后旋蒸浓缩，干燥，计算
纯度。
回收率(%)= (洗脱液总黄酮量 /上柱总黄酮
量)× 100
1.2.5.6 洗脱剂用量的确定 量取 D101 树脂15 mL，
湿法装柱，以上样流速 2.0 mL /min 加入浓度为
2.4512 mg /mL 的样液 75 mL。上样完成后，先用
75 mL水洗，再用 50%乙醇溶液以 2 mL /min 的流速
洗脱，每一个柱体积收集一个流份，测定每一个柱体
积中总黄酮的浓度。以柱体积为横坐标，每一个柱
体积中黄酮浓度为纵坐标，绘制洗脱曲线，确定洗脱
剂的用量。
1.2.5.7 洗脱流速的考察 量取 D101 树脂 15 mL，
湿法装柱，以上样流速 2.0 mL /min 加入浓度为
2.4512 mg /mL的样液 75 mL。上样完成后，用 75 mL
水洗，再用 50%乙醇溶液 60 mL分别以 1.0、2.0、3.0、
4.0、5.0 mL /min 的流速洗脱，收集洗脱液，定容至
100 mL，测定总黄酮的含量，计算回收率。
1.2.6 新疆圆柏总黄酮纯化工艺正交实验 根据单因
素实验结果进行正交实验。量取 D101 树脂 15 mL，湿
法装柱(径高比为 1 ∶ 4)，上样量为 183.5997 mg，用
75 mL水除杂，50%乙醇溶洗脱，剩下的条件按正交
实验设计进行，收集洗脱液，定容至 100 mL，测定总
黄酮的含量，计算回收率。
190
表 1 正交实验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal
水平
上样浓度
(mg /mL)
上样流速
(mL/min)
洗脱剂用量
(BV)
洗脱流速
(mL/min)
1 1.2256 1.0 3 1.0
2 2.4512 2.0 4 2.0
3 4.9023 3.0 5 3.0
1.3 数据统计分析
实验数据均为 3 次平行实验的平均值，用正交
设计助手Ⅱ v3.1 软件进行正交结果分析，采用
OriginPro 8.5.0 软件作图。
2 结果与分析
2.1 标准曲线方程
按照 1.2.2 中所述方法绘制标准曲线，得到标准
曲线方程:A = 11.249C + 0.0044(Ｒ2 = 0.9998)，表明
对照品溶液质量浓度在 0.2～1.8 mg /mL 范围内与吸
光度线性关系良好。
2.2 大孔吸附树脂型号的筛选
一般而言，树脂的吸附效果与树脂极性、孔径、
比表面积有关［11］。由表 2 显示，比表面积大的
D101、AB－8、HPD400、HPD500、HPD826 的吸附率都
比较高，而在这几种树脂中，弱极性的 D101、AB－8
的解吸率较高，其中 D101 和 HPD826 吸附和解吸效
果较优。而 D101 树脂在医药食品研发领域应用非
常普遍，对该树脂本身质量(如溶剂残留等)的研究
较多。因此综合考虑，选择 D101 树脂作为新疆圆柏
总黄酮富集纯化的最佳树脂型号。
表 2 六种树脂静态吸附及解吸结果
Table 2 Ｒesults of static adsorption
and desorption of six types of resin
树脂型号
吸附量
(mg /g)
吸附率
(%)
解吸率
(%)
D101 11.0943 85.86 87.02
AB－8 10.9110 84.44 86.65
HPD400 11.5065 89.09 84.45
HPD500 11.5944 89.73 81.55
HPD417 10.3452 80.06 85.92
HPD826 11.6110 89.87 82.86
2.3 大孔吸附树脂的静态吸附动力学特性测定
由图 1 可知，D101 树脂的吸附率随时间的延长
逐渐增加。当吸附时间达到 8 h以后，树脂对黄酮的
吸附率增长十分缓慢，吸附基本达到平衡。因此，
D101 树脂对新疆圆柏总黄酮的吸附时间为 8 h。
2.4 动态吸附与解吸工艺研究
2.4.1 上样浓度对吸附量的影响 由图 2 可知，当上
样量一定时，上样浓度对树脂吸附量有较大的影响。
随着上样浓度的增加，溶质的溶解性越差，树脂吸附
量逐渐降低，当上样浓度大于 2.4512 mg /mL时，吸附
量明显下降。而上样浓度过低，要使树脂达到相同
的吸附量，则会耗时越长，影响效率。因此，选择最
适的上样浓度为 2.4512 mg /mL。
图 1 树脂静态吸附动力学曲线
Fig.1 Kinetic curves of the static adsorption of resin
图 2 上样浓度对吸附量的影响
Fig.2 Effect of sample concentration
on adsorption capacity
2.4.2 上样流速对吸附量的影响 由图 3 可知，吸附
量随上样流速的增大而下降。当上样流速在 1.0 ～
2.0 mL /min时 下 降 趋 势 小，当 上 样 流 速 达 到
3.0 mL /min以后下降趋势明显。一般而言，上柱液通
过树脂柱越慢，越能与树脂充分接触，从而黄酮能更
好地被树脂吸附;若上样流速太快，吸附量会随着流
速的增加而降低［12］。综合工作效率和吸附效果考
虑，选择上样流速为 2.0 mL /min。
图 3 上样流速对吸附量的影响
Fig.3 Effect of sample flow rate on adsorption capacity
2.4.3 最大上样量的确定 由图 4 可知，从上样开始
就有少量黄酮的泄露。在达到 5 BV 后出现明显泄
露。随着上样量的增加，泄露的黄酮越多，当达到
17 BV后泄露曲线变缓，说明树脂已基本达到饱和。
为了避免造成总黄酮的浪费，选取最大上样体积为
5 BV。
2.4.4 除杂用水量的确定 由图 5 可知，随着除杂用
水量的增加，杂质的质量逐渐减少。当除杂用水量
达到 5 BV 后，杂质的质量很小且几乎不再发生变
191
图 4 D101 树脂对总黄酮的吸附泄露曲线
Fig.4 Leak curve of total flavonoids about D101 resin
化，说明大部分的杂质已经被洗脱下来了。因此，选
取 5 BV的水除杂。
图 5 除杂用水量的确定
Fig.5 Effect of water consumption on removing impurity
2.4.5 洗脱剂浓度的选择 由图 6 可知，50%、70%、
95%乙醇洗脱的回收率较高，而得到的总黄酮纯度随
乙醇浓度的增加而降低。这可能是因为乙醇浓度越
高，洗脱下来的物质越多，总黄酮的纯度也就越低。综
合回收率和纯度考虑，选取 50%乙醇作为洗脱溶剂。
图 6 乙醇浓度对总黄酮回收率和纯度的影响
Fig.6 Effect of ethanol concentration
on recovery rate and purity
2.4.6 洗脱剂用量的确定 由图 7 可知，第 1、2 BV
已经洗脱下来大部分的黄酮，到第 4 BV 几乎全部被
洗脱下来，之后的洗脱液中黄酮含量甚微。因此，选
择 4 BV的 50%乙醇洗脱。
2.4.7 洗脱流速的考察 由图 8 可知，总黄酮回收率
随洗脱流速的增加而减少。当洗脱流速达到
3.0 mL /min以后，总黄酮回收率缓慢减少。综合总黄
酮回收率和工作效率的考虑，选取 2.0 mL /min 为洗
脱流速。
2.5 新疆圆柏总黄酮纯化工艺正交实验
图 7 黄酮动态洗脱曲线
Fig.7 The dynamic desorption curve of flavonoids
图 8 洗脱流速对总黄酮回收率的影响
Fig.8 Effect of desorption rate
on recovery rate of total flavonoids
由表 3 可知，4 个因素对新疆圆柏总黄酮纯化回
收率的影响大小依次为上样浓度 ＞上样流速 ＞洗脱
流速 ＞洗脱剂用量。新疆圆柏总酮纯化的最优组合
为 A1B1C2D1，即上样浓度 1.2256 mg /mL，上样流速
1.0 mL /min，洗脱剂用量 4 BV，洗脱流速 1.0 mL /min。
由表 4可知，上样流速对新疆圆柏总黄酮纯化回收率
的影响显著。根据最优组合条件进一步做验证实验，
得出新疆圆柏总黄酮纯化回收率为 88.36%，ＲSD 为
1.53%，纯度为 69.96%，ＲSD 为 1.18%，符合正交实验
中得到的结果，且结果重复性好，说明所选条件合理。
表 3 正交实验结果
Table 3 Ｒesults of the orthogonal experiment
实验号 上样浓度 上样流速
洗脱剂
用量
洗脱流速
回收率
(%)
1 1 1 1 1 84.20
2 1 2 2 2 83.11
3 1 3 3 3 77.66
4 2 1 2 3 80.57
5 2 2 3 1 83.35
6 2 3 1 2 76.82
7 3 1 3 2 79.36
8 3 2 1 3 77.18
9 3 3 2 1 77.42
K1 81.657 81.377 79.400 81.657
K2 80.247 81.213 80.367 79.763
K3 77.987 77.300 80.123 78.470
Ｒ 3.670 4.077 0.967 3.187
192
表 4 方差分析表
Table 4 Analysis of variance table
因素 偏差平方和 自由度 F比 显著性
上样浓度 20.565 2 13.556
上样流速 31.960 2 21.068 *
洗脱剂用量 1.517 2 1.000
洗脱流速 15.412 2 10.160
误差 1.52 2
注:F0. 05(2，2)= 19.000，* 表示在 p ＜ 0.05 水平上差异显著。
3 结论
本研究结果表明，大孔树脂 D101 对新疆圆柏总
黄酮的吸附和解吸效果较好，是纯化新疆圆柏总黄酮
的理想树脂。D101 纯化新疆圆柏总黄酮的最佳工艺
是上样浓度1.2256 mg /mL，上样流速1.0 mL /min，除杂
用水量 5 BV，乙醇浓度 50%，洗脱剂用量 4 BV，洗脱
流速 1.0 mL /min。在此条件下大孔树脂 D101 纯化
新疆圆柏总黄酮，总黄酮回收率为 88.36%，纯度为
69.96%，大孔树脂纯化前黄酮纯度提高了 2.79 倍。
与已有研究的聚酰胺纯化结果［7］相比，D101 大孔树
脂纯化的总黄酮纯度达到了聚酰胺纯化的总黄酮纯
度(69.54%)。因此，该纯化工艺简便、易行，重复性
好，可作为新疆圆柏总黄酮的有效富集方法。
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