全 文 :朝鲜蓟叶高效液相色谱指纹图谱的初步研究
宋曙辉 ,霍超 ,王文琪 ,何洪巨 ,张宝海 (北京市农林科学院蔬菜研究中心 ,北京 100097)
摘要 [目的 ]采用高效液相色谱法建立朝鲜蓟叶提取物的指纹图谱。 [方法 ]以 体积分数为 70 %的乙醇作为提取剂 ,采用 C18色谱柱(4.6mm×250.0mm, 5μm),乙腈 -0.5%乙酸-水为流动相梯度洗脱 ,检测波长为 330nm。 [结果 ] 14批样品经中药指纹图谱评价软
件分析 ,确定了 15个共有峰 ,建立了共有模式。 [结论]该方法建立的指纹图谱为朝鲜蓟叶深加工的质量控制奠定了基础。
关键词 朝鲜蓟叶;高效液相色谱;指纹图谱;相似度;共有模式
中图分类号 R284.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2010)20-10655-04
PreliminaryStudyonHPLCFingerprintofArtichoke(CynarascolymusL.)Leaves
SONGShu-huietal (BeijingVegetableResearchCenter, BAAFS, Beijing100097)
Abstract [ Objective] ToestablishtheHPLCfingerprintofartichoke(CynarascolymusL.)leavesextracts.[ Method] Theartichokeleaves
wasextractedwith70%ethanol(V/V)andanalyzedwithHPLC, andthechromatographicconditionwereasfolows:C18 column(4.6mm×
250.0mm, 5μm), mobilephasesofacetonitrile-0.5%aceticacidanddetectionwavelengthof330nm.[ Result] Fourteenbacthesoftheex-
tractswereanalyzedbyChineseMedicineChromatographicFingerprintSimilarityEvaluationsoftware, and15peakswereidentifiedasfinger-
print.Thecommonmodeofartichokeleavesextractswaspreliminaryestablished.[ Conclusion] Thefingerprintestablishedbythismethodwil
providebasicdataforthequalitycontrolofartichokeleaves.
Keywords CynarascolymusL.leaves;HPLC;Fingerprint;Similarity;Commonmode
基金项目 北京市科技新星计划项目(2006B41)。
作者简介 宋曙辉(1971-),女 ,北京人 ,硕士 , 副研究员 ,从事蔬菜营
养保健的研究。
收稿日期 2010-04-06
植物药成分复杂 ,对其总体品质的鉴定较为困难。世界
卫生组织(WHO)于 1991年提出 ,可将指纹图谱应用到植物
药物鉴定和评估上。指纹图谱的建立 能够更有效地帮助企
业对原材料的引进及成品的质量进行鉴定。在国外 ,尤其是
美国 FDA和 WHO对草药产品的指南中均提到对指纹图谱
的要求 ,国际上采用指纹图谱质控技术对植物药进行质量控
制的国家有韩国 、日本 、德国等;我国的药品监督管理部门也
明文规定对中药注射剂的质量控制使用指纹图谱。
朝鲜蓟叶(CynarascolymusL.)作为一种欧洲传统的草
药 ,具有治疗消化不良 、保肝 、抗氧化 、降压 、抗肿瘤 、抗菌 、抗
病毒等多种生理功效 [ 1-3] 。我国从 20世纪 80年代引种朝鲜
蓟 ,目前在云南 、浙江 、湖北 、北京等省市均有栽培 ,主要用于
花蕾的出口。
近年来 ,关于朝鲜蓟叶片生物活性物质的研究很多 ,主
要包括:酚类化合物 、黄酮类化合物 、萜类化合物 [ 4-5] ,其中
以多酚类化合物为主要成分 ,且不为单一成分。为了对这些
生物活性物质有一个整体的认识 ,笔者利用化学成分指纹图
谱技术 ,对 14份朝鲜蓟叶样品进行分析 ,建立指纹图谱 ,以
期为今后朝鲜蓟的开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象及其预处理。 5个不同品种的朝鲜蓟叶样
品 ,共 14批 ,采自不同年份和不同地点。采用冷冻干燥和鼓
风干燥方法对其进行干燥处理 ,干燥后将叶片粉碎 ,过 60目
筛 ,备用。
1.1.2 主要设备。岛津 LC-10A型高效液相色谱仪 , SPD-
M10A二极管阵列检测器 ,由 LCsolution色谱工作站提供;
SineSonic150超声波清洗器 ,由日本神明台工业株式会社生
产;YND-1远红外耐酸碱控温电炉 ,由上海翔股机电仪器厂
生产。
1.1.3 主要试剂。乙腈(色谱纯),由迪马公司生产;乙醇 、
四氢呋喃 、36%乙酸(市售分析纯),由北京化工厂生产;去离
子水(电导率为 18 mS/m),由实验室自制。
表 1 样品信息
Table1 Sampleinformation
编号
No.
采集地点
Samplingarea
采集时间
Samplingtime
1 北京延庆 YanqingBeijing 2008-09
2 北京延庆 YanqingBeijing 2007-10
3 北京延庆 YanqingBeijing 2007-10
4 德国German 2006-11
5 德国German 2006-11
6 北京西郊 WestsuburbofBeijing 2006-08
7 北京延庆 YanqingBeijing 2006-10
8 北京西郊 WestsuburbofBeijing 2004-08
9 北京西郊 WestsuburbofBeijing 2006-10
10 北京延庆 YanqingBeijing 2006-06
11 北京延庆 YanqingBeijing 2006-09
12 浙江嘉兴 JiaxingZhejiang 2006-08
13 云南Yunnan 2008-09
14 云南Yunnan 2008-11
1.2 方法
1.2.1 供试品溶液的制备。称取 14份朝鲜蓟叶片干燥粉
各 2.0 g,分别放入 50 ml具塞离心管中 ,依次编号为 1 ~ 14。
在离心管中加入 70%乙醇 40ml,振荡后超声提取 10 min;然
后调换离心管位置 ,再超声提取 10min,如此反复 ,共提取 30
min;最后放入离心机中 ,用转速 12 000 r/min,离心 10 min,
取上清液 ,备用。
1.2.2 色谱条件。色谱柱:YMC-PackODS-A, 250.0 mm×
4.6mm, 5μm;流动相 B(以下简称 B):乙腈 -水(含 0.5%乙
酸和 0.5%四氢呋喃),比例为 1∶1;流速为 1ml/min;进样量
为 10μl;色谱柱温度为 35 ℃;梯度洗脱程序为 0 ~ 5min, 6%
B~ 20% B;5 ~ 40 min, 20%B~ 50%B;40 ~ 48 min, 6% B;
检测波长为 330 nm。
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(20):10655-10658, 10701 责任编辑 刘群燕 责任校对 况玲玲
1.2.3 方法学考察 。
1.2.3.1 精密度试验。取同一份供试品溶液 ,连续进样 6
次 ,对各色谱峰相对保留时间及峰高进行精密度考察 。
1.2.3.2 稳定性试验。取同一份供试品 ,分别在 0, 24, 48,
72h不同时间点进行检测 ,对各色谱峰的相对保留时间及峰
高进行稳定性考察。
1.2.3.3 重现性考察。取一个样品 ,分别称取 6份 ,按
“1.2.1”处理。对各色谱峰的相对保留时间及峰高进行重现
性考察。
1.2.4 主成分分析法。主成分分析法是一种有效的特征压
缩方法 ,它把原有的各个特征利用线性变换得到一批新的特
征 ,这样的新特征既保留了原有特征的主要信息 ,又减少了
特征个数 ,通过对特征的选择 ,在一定程度上还能消除噪音 。
该试验中以选定的 15个特征峰的相对峰高作为特征 ,采用
主成分分析 ,求出指标的相关矩阵的特征根 。
1.2.5 指纹图谱的建立。该试验采用中药指纹图谱相似度
评价软件(Computer-Aided-Similarity-EvaluationSoftware),按
照供试品指纹图谱的测定方法对收集到的不同生长地 ,不同
品种的朝鲜蓟叶片进行高效液相色谱的指纹图谱分析 ,并进
行相似度评价 。数据处理采用了最小波平滑 ,平滑层数 2和
以确定的相同物质的保留时间为标准的三峰标准平移法进
行校正。
2 结果与分析
2.1 朝鲜蓟叶提取物主要特征峰的确定 通过对 14批不
同产地 、不同采收期样品的色谱图中峰位 、峰数进行比较 ,最
后选定 15个有代表性的指纹峰 ,见图 1。
图 1 朝鲜蓟叶片提取物 HPLC图谱
Fig.1 HPLCchromatogramofCynarascolymusL.leavesex-
tract
2.2 方法学考察结果
2.2.1 精密度试验结果。以最高的 3号峰为参照 ,其余峰
的保留时间和峰高与之比较 ,得出相对保留时间和相对峰
高 ,结果见表 2。从结果可以看出 ,相对保留时间的相对标准
偏差(RSD)很小 ,都小于 1%。相对峰高的变异系数除 4号
峰稍高一些 ,其余的都在 5%以下 ,均达到要求 ,表明色谱的
稳定性好 ,可以用于指纹图谱的分析。
2.2.2 稳定性试验结果。对用相同样品处理得到的朝鲜蓟
叶片乙醇提取液在 0 ~ 72 h内分 5次进样分析 ,得到 15个峰
的相对保留时间和相对峰高 ,见表 3。 4号和 12号峰峰高的
RSD值较大 ,表明在 72 h内 4号组分会有小幅的变化 ,样品
应尽量在 24h内完成分析。
表 2 色谱组分相对保留时间及峰高的精密度考察
Table2 Accuracyoftherelativeretentiontimeandpeakheightof
chromatogramcomponent(n=6)
峰号
No.of
peak
相对保留时间
min
Relativeretentiontime
相对标准偏差
%
RSD
相对峰高
Relative
peakheight
相对标准偏差
%
RSD
1 0.716 0±0.002 0 0.23 0.103 0±0.002 0 1.98
2 0.798 0±0.002 0 0.21 0.032 0±0.001 0 1.63
3 1.000 0 0.00 1.000 0 0.00
4 1.075 0±0.000 5 0.05 0.011 0±0.000 6 5.22
5 1.196 0±0.001 7 0.14 0.011 0 0.00
6 1.231 0±0.001 7 0.14 0.013 0±0.000 4 3.10
7 1.444 0±0.002 0 0.17 0.032 0±0.001 0 4.18
8 1.719 0±0.006 0 0.34 0.009 0 0.00
9 1.867 0±0.006 0 0.34 0.306 0±0.001 0 0.34
10 1.973 0±0.006 0 0.33 0.114 0±0.000 8 0.66
11 2.208 0±0.007 0 0.31 0.722 0±0.007 0 0.97
12 2.272 0±0.007 0 0.31 0.139 0±0.004 0 2.63
13 2.430 0±0.007 0 0.31 0.013 0±0.000 6 4.38
14 2.499 0±0.008 0 0.31 0.063 0±0.001 0 1.42
15 2.703 0±0.006 1 0.24 0.019 0±0.000 5 2.77
注:以 3号峰为标准 ,其他峰与之相比 ,得到相对保留时间及相对峰
高 , 5号、8号峰 6次重复无差异。表 3、4同。
Note:Thevaluesofrelativeretentiontimeandrelativepeakheightwerethe
resultscomparedwithpeak3(standard).Therelativepeakheightof
No.5andNo8peakwasnotdifferentduring6repeatingtestsandTa-
ble3, 4wasthesame.
表 3 0 ~ 72h的色谱流出组分相对保留时间及峰高比值的稳定性考察
Table3 Thestabilityoftherelativeretentiontimeandpeakheightof
chromatogramoutflowcomponentswithin72h(n=5)
峰号
No.of
peak
相对保留时间
min
Relativeretentiontime
相对标准偏差
%
RSD
相对保留峰高
Relative
peakheight
相对标准偏差
%
RSD
1 0.721 0±0.003 0 0.36 0.047 0±0.002 0 4.41
2 0.801 0±0.002 3 0.30 0.024 0±0.000 5 2.11
3 1.000 0 0.00 1.000 0 0.00
4 1.077 0±0.008 0 0.72 0.003 9±0.000 3 8.46
5 1.200 0±0.003 0 0.21 0.026 0±0.000 5 2.06
6 1.238 0±0.048 0 2.62 0.024 0±0.000 8 3.40
7 1.454 0±0.052 0 2.67 0.138 0±0.000 5 0.36
8 1.739 0±0.052 0 2.49 0.071 0±0.002 0 2.43
9 1.877 0±0.062 0 2.82 0.299 0±0.002 0 0.82
10 2.001 0±0.064 0 2.85 0.069 0±0.002 0 3.51
11 2.248 0±0.070 0 2.95 0.117 0±0.002 0 1.66
12 2.290 0±0.072 0 2.94 0.023 0±0.002 0 7.70
13 2.481 0±0.080 0 3.21 0.082 0±0.001 0 1.74
14 2.500 0±0.088 0 3.36 0.034 0±0.000 5 1.46
15 2.700 0±0.093 0 0.21 0.019 0±0.000 7 2.10
2.2.3 重复性试验结果 。对同一个样品进行重复性试验 ,
结果表明 ,相对保留时间基本一致 ,变异系数 RSD值很小
(表 4)。相对峰高变异系数较相对保留时间要大 ,但也都在
5%以内 ,均符合要求 ,表明采用目前的处理方法比较适宜。
2.3 样品总图谱 采用 Computer-Aided-Similarity-Evaluation
Software将 14个样品的高效液相色谱图制成对比图(图 2)。
2.4 相似度评价 由计算机相似度评价系统对 14个样品
进行相似度评价 ,分别以中位数和相合系数进行计算 ,结果
10656 安徽农业科学 2010年
见表 5。
表 4 样品重复性试验结果
Table4 Resultsofreproducibilitytestofsamples(n=6)
峰号
No.of
peak
相对保留时间
min
Relativeretentiontime
相对标准偏差
%
RSD
相对峰高
Relative
peakheight
相对标准偏差
%
RSD
1 0.715 0±0.000 5 0.072 0.103 0±0.002 0 1.80
2 0.792 0±0.009 0 1.190 0.032 0±0.000 6 1.74
3 1.000 0 0.000 1.000 0 0.00
4 1.074 0±0.000 8 0.076 0.010 0±0.000 4 4.02
5 1.196 0±0.000 8 0.068 0.012 0±0.001 0 10.40
6 1.232 0±0.000 4 0.033 0.013 0±0.001 0 9.08
7 1.445 0±0.000 4 0.028 0.033 0±0.002 0 5.42
8 1.720 0±0.000 8 0.047 0.009 0±0.000 5 5.96
9 1.869 0±0.001 0 0.055 0.305 0±0.002 0 0.76
10 1.975 00.001 0 0.076 0.114 0±0.000 1 1.29
11 2.208 0±0.006 0 0.288 0.722 0±0.007 0 1.03
12 2.273 0±0.002 0 0.076 0.139 0±0.004 0 2.55
13 2.433 0±0.001 0 0.050 0.012 0±0.000 5 4.19
14 2.500 0±0.000 5 0.021 0.062 0±0.002 0 2.79
15 2.704 0±0.002 0 0.056 0.018 0±0.002 0 10.80
相关系数和相和系数 2种表示方法都可以表明不同样
品之间的相符程度 ,从结果可以看出 , 2种方式所得结果基本
一致。 14批样品中 ,大多数样品的相关系数大于 0.9,表明
90%以上的样品是一致的。该试验中的材料都是朝鲜蓟叶
片 ,其差异的产生主要是不同栽培方式和处理方式引起的 。
表 5 14批朝鲜蓟叶乙醇提取指纹图谱相似度
Table5 Fingerprintsimilarityof14batchesofethanolextractsofCy-
narascolymusL.leaves
编号No.
相关系数(中位数)Correlationcoeficient(Median)
相关系数(均值)Corelationcoeficient(Average)
相合系数(中位数)Consistencycoefficient(Median)
相合系数(均值)Correlationcoeficient(Average)
1 0.964 2 0.986 8 0.964 7 0.986 5
2 0.904 2 0.896 4 0.905 8 0.899 1
3 0.980 5 0.979 2 0.980 8 0.979 1
4 0.830 8 0.831 2 0.834 0 0.835 7
5 0.960 8 0.947 5 0.960 9 0.948 7
6 0.859 7 0.923 1 0.862 2 0.924 5
7 0.942 7 0.974 5 0.943 2 0.973 8
8 0.835 7 0.854 7 0.838 0 0.858 2
9 0.967 8 0.963 6 0.967 1 0.964 1
10 0.992 6 0.975 5 0.992 7 0.975 6
11 0.896 5 0.894 1 0.890 4 0.891 3
12 0.965 7 0.972 4 0.966 2 0.973 1
13 0.987 8 0.970 9 0.987 9 0.971 6
14 0.873 8 0.903 0 0.876 2 0.905 4
图 2 14批朝鲜蓟叶样品 70%乙醇提取物总图谱
Fig.2 Chromatogramsof14batchesofCynarascolymusL.leavesextractswith70% ethanol
2.5 主成分分析结果 通过计算得 ,前 4个主成分的累积
贡献率大于 90%,故取前 4个主成分作为指标进行分析 ,考
察了 14批样品的离散程度。从结果可以看出(图 3), 14号
和 6号样品具有相对较大的离散度 ,但以不同方法计算的 14
号和 6号样品的相关系数和相合系数都达到或接近 0.9,仍
然表明它们的主要指纹成分与其他样品相一致 。
2.6 朝鲜蓟叶共有模式的建立 在以上分析的基础上 ,建
立了朝鲜蓟叶片乙醇提取物的共有模式图谱 ,如图 4。
3 结论与讨论
指纹的意义在于将所要研究的目标物与其他物质区分
开来。植物药鉴定中使用指纹图谱起始于 20世纪 70年代 ,
是美国 FDA和 WHO对于植物药中存在多种无法考量的功
效成分建立的权宜之法 ,目前在中草药方面应用广泛 ,且被
列入中国药典中 [ 6] 。色谱指纹图谱的作用主要是将常规的
以单一指标成分或活性成分为质量控制的指标提升到一个
新的阶段 ,用色谱的指纹特征 ,和通过指纹图谱得到的量化
参数 ,更有效地鉴别真伪 ,判断药材质量的稳定性 ,市场商品
质量的一致性及货架生命周期内的稳定性。即通过相似度
的评价 ,可以判断真伪 、评价优劣 、考察稳定性和一致性。
色谱指纹图谱的特征在于整体性和模糊性 [ 7] 。它所提
供的信息比任何单一化学对照品作为鉴别的依据提供的信
息都丰富。朝鲜蓟叶片中含量最高的是绿原酸(3号峰),但
绿原酸作为普遍存在的化合物不能构成朝鲜蓟的特征。朝
鲜蓟叶中多种酚类化合物及黄酮化合物都具有显著的生理
功能 [ 8] ,同时存在的多种咖啡奎尼酸类化合物及黄酮类化合
物构成了朝鲜蓟叶的特征特性 [ 9-14] 。
植物中的有效成分多是次生代谢产物 ,受环境 、栽培条
件等影响大 ,该试验中不同批次的样品中各成分含量也相差
较大。报道的已鉴定出的 20多种奎尼酸和黄酮类化合物在
不同的样品中可能因含量很低而检测不到。该试验中通过
对这 14批不同产地 、不同品种的朝鲜蓟进行比较 、辨认 ,找
出了可以构成朝鲜蓟叶指纹的 15个特征峰 ,建立了体积分
数为 70%乙醇为提取剂的高效液相色谱指纹图谱 ,得到相应
的共有模式图 ,为朝鲜蓟叶片的进一步开发和利用奠定了基
1065738卷 20期 宋曙辉等 朝鲜蓟叶高效液相色谱指纹图谱的初步研究
础 。该试验经方法学验证 ,指纹图谱的专属性强 、重现性好。
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10658 安徽农业科学 2010年
还有坏死灶;胆囊 ,脾脏肿大 ,表面有斑驳状花纹;肾脏肿大 ,
有树枝状充血 。用药组鸭较感染对照的病变轻 。
表 1 鸭病毒性肝炎治疗结果
Table1 Thetherapeuticeffectofduckvirushepatitis
组别
Group
发病数∥只
Diseased
number
死亡数∥只
Deadnumber
存活数∥只
Survival
number
存活率∥%
Survivalrate
中药治疗组Ⅰ 9 2 28 93.3
中药治疗组Ⅱ 30 4 26 86.6
西药治疗组Ⅰ 12 8 22 73.3
西药治疗组Ⅱ 30 11 19 63.3
感染对照组 30 30 0 0
空白对照组 0 0 30 100
3 结论与讨论
鸭病毒性肝炎病毒是肠道病毒属的成员 ,对外界抵抗力
较强 ,主要传播途径是接触传染 ,常经消化道 、呼吸道传播 ,
而且该病潜伏期短 ,传播速度快 ,发现第 1个病例后 24 h就
可传遍全群 ,尤其在饲养管理不当 ,舍内潮湿 、饲养密度大 、
维生素缺乏时可引发该病 。中兽医理论认为 ,雏鸭病毒性肝
炎是由于外感病毒导致的肝胆实热和湿热泄泻 。热极则生
风 ,肝风内动 ,在临床上就表现为昏迷 、痉挛 、抽搐和腹泻等
症状 ,在治疗上应清热解毒 、疏肝解郁 、熄风止痉 ,舒肝化滞 ,
增强雏鸭机体抵抗力。结果表明 ,中药蟾甘口服液对鸭病毒
性肝炎具有显著的防治效果(P<0.05)。蟾甘口服液的蟾蜍
有清热解毒 、利水消肿作用 ,可用于温热泻痢 、病毒感染 ,对
鸭肝炎病毒有很强的抑制作用 ,能明显提高机体免疫功
能 [ 3] 。罗锅底有清热解毒 、消肿止痛功效 ,对痢疾杆菌 、溶血
性链球菌 、金黄色葡萄球菌 、沙门氏菌 、大肠杆菌和伤寒杆菌
均有很强的抑制作用 [ 4] 。蟾蜍和罗锅底 2种药物配伍 ,不但
有抑制病毒增殖的功能 ,对细菌感染也有很强的疗效 [ 5] 。此
外 ,研究表明蟾甘口服液不但对鸭病毒性肝炎有很好的疗
效 ,对新城疫 、鸡传染病性支气管炎和法氏囊炎等病毒性传
染病也有很好的疗效 ,可以在临床上推广应用 。
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1070138卷 20期 吴桂银等 中药蟾甘口服液对鸭病毒性肝炎的防治试验