全 文 ： 2011, Vol. 32, No. 05 食品科学 ※营养卫生270
琐琐葡萄总黄酮在体外对乙型肝炎病毒的影响
刘 涛 1，马 龙 1,*，赵 军 2，李海波 3
(1.新疆医科大学公共卫生学院毒理学教研室，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐
830004；3.江苏省南通市疾病预防控制中心，江苏 南通 226006)
摘 要：目的：考察琐琐葡萄总黄酮体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的效果。方法：用HBV DNA转染人肝癌细胞所
得的HepG 2.2.15细胞株为模型，ELISA法测定用药后 8d细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg含量，计算琐琐葡萄
总黄酮对HBsAg和HBeAg分泌的抑制率，荧光定量 PCR法测定HBV DNA的变化，MTT比色法检测细胞毒性。
结果：琐琐葡萄总黄酮在 12.5～100μg/mL范围内，均能不同程度地减少细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的含
量，且细胞毒性小，半数中毒剂量(TC50)为 284.91μg/mL，对HBsAg半数有效剂量(IC50)为 327.56μg/mL、对HBeAg
为 215.34μg/mL，对HBsAg治疗指数(TI)为 0.87、对HBeAg治疗指数为 1.32；总黄酮质量浓度 100μg/mL时对HBV
DNA的抑制率为 47.63%。结论：琐琐葡萄总黄酮具有一定的体外抗 HBV作用。
关键词：琐琐葡萄；总黄酮；乙型肝炎病毒；细胞培养
Inhibitory Effects of Total Flavones from Vitis vinifer L. on Hepatitis B Virus in vitro
LIU Tao1，MA Long1,*，ZHAO Jun2，LI Hai-bo3
(1. Department of Toxicology, College of Public Health, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China；
2. Institute of Materia Medica of Xinjiang, Urumqi 830004, China；
3. Nantong Center for Disease Control and Prevention, Nantong 226006, China)
Abstract：Objective: To investigate the inhibitory effects of total flavones from Vitis vinifer L. on hepatitis B virus (HBV)
replication and their toxicity in cultured human hepatocellular liver carcinoma cell line HepG 2.2.15 transfected with HBV DNA.
Methods: After 8 days of treatment with total flavones from Vitis vinifer L., the contents of HBsAg and HBeAg in the cell culture
supernatant of HepG 2.2.15 were measured by ELISA to calculate the inhibitory rates against the secretion of HBsAg and
HBeAg, the change in HBV DNA was monitored by real-time PCR, and cytotoxicity test was performed using MTT assay.
Results: Addition of total flavones from Vitis vinifer L. in a dosage range of 12.5 to 100μg/mL could reduce the contents of HBsAg
and HBeAg in the cell culture supernatant of HepG 2.2.15 to different extents. Little cytotoxic effect was observed with a
median toxic concentration (TC50) of 284.91 μg/mL. The median effective doses (IC 50) on HBsAg and HBeAg were
327.56 μg/mL and 215.34 μg/mL, and the therapeutic index for HBsAg and HbeAg were 0.87 and 1.32, respectively. Total flavones
from Vitis vinifer L. at 100 μg/mL could inhibit HBV DNA by 47.63%. Conclusion: Total flavones from Vitis vinifer L. have
inhibitory effects on HBV in vitro.
Key words：Vitis vinifer L；flavones；hepatitis B virus；cell culture
中图分类号：R965 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)05-0270-03
收稿日期：2010-06-17
基金项目：国家自然科学基金项目(30660157)
作者简介：刘涛(1974—)，女，副教授，博士，主要从事新疆特色药食兼用植物开发应用基础研究。E-mail：xjmult@sina.com
*通信作者：马龙(1957—)，男，教授，硕士，主要从事新疆特色药食兼用植物开发应用基础研究。E-mail：xjmult@163.com
乙型肝炎病毒(HBV)感染不仅会导致急慢性乙型肝炎
的发生，而且与肝硬化、原发性肝癌关系密切。近年
来，国内外对传统天然药物的抗病毒研究日益重视，抗
乙肝病毒药物研究虽然取得了一些进展，但目前仍缺乏
比较理想的治疗药物[1]。因此，从丰富的中草药植物资
源中寻找新的有效抗HBV药物，已成为我国抗病毒中药
发展的必然趋势。1987年，美国 Sells等[2]将带有HBV
DNA全基因组及抗G418的重组质粒转染人肝癌细胞株
Hep G建立了 2.2.15细胞株，它能长期稳定地向细胞培
养上清液中分泌 HBsAg、HBeAg和完整的Dane’s颗
粒，是目前体外筛选和评价抗乙肝病毒药物较理想的细
胞模型[3]。黄酮是维吾尔药琐琐葡萄(Vitis vinifer L.)的
主要组成成分之一[4 ]，具有调节免疫[5 ]、抗氧化[6 ]、抗
肿瘤[7 ]、抗病毒[8 ]、抗辐射[9 ]等多种生物活性。课题组
. . ..
. . ..
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前期研究显示琐琐葡萄总黄酮对免疫性肝损伤具有较
好的保护作用[10]，且对肝癌细胞 HepG2的增殖具有显
著的抑制作用[11]。为探讨琐琐葡萄总黄酮的抗 HBV效
应，本实验以 Hep G 2.2.15细胞株为模型，研究琐琐
葡萄总黄酮在体外抗 HBV的生物活性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
HepG 2.2.15细胞株购自武汉大学物种保藏中心，传
代于高糖DMEM培养基(每1000mL含100万单位青霉素、
1.0g链霉素、100mg G418和 10%灭活胎牛血清)中培养。
DMEM培养基、G418(Geneticin)、青霉素 -链霉素
美国 Gibco公司；胎牛血清 杭州四季青生物制品公
司；HBsAg和HBeAg ELISA检测试剂盒 上海华美生
物工程公司；HBV DNA荧光定量 PCR检测试剂盒 上
海申友生物技术有限公司；噻唑蓝(MTT) 美国Amresco
公司；二甲基亚砜(DMSO)、0.025%胰蛋白酶 -EDTA
美国 Sigma公司；拉米夫定(3-TC，批号 06120028) 葛
兰素史克制药苏州有限公司。
1.2 仪器与设备
CO2培养箱 美国Napco公司；XD-2倒置显微镜
重庆光电仪器有限公司；生物安全柜 美国 Labconco
公司；XD 711型酶标仪 上海迅达医疗器械有限公司；
Thermo IEC冷冻高速离心机 美国热电公司；Opticon
实时荧光定量 PCR仪 美国MJ Research公司；AB104-
N型分析天平 Mettler-Toledo上海有限公司。
1.3 琐琐葡萄总黄酮的制备
琐琐葡萄药材粉碎后以去离子水回流提取 2次，每
次 1h，合并提取液，减压浓缩至一定量，加入 5 倍体
积 9 5 % 乙醇，充分混匀，静置 1 2 h，过滤得滤液 A。
药渣以 8倍量 95%乙醇回流提取 2次，每次 1h，合并
提取液，减压浓缩至浸膏，浸膏以水混悬后，石油醚
萃取脱脂，再经乙酸乙酯萃取，其中乙酸乙酯部分减
压浓缩后，以 9 5 % 乙醇溶解，放置 1 2 h，析出沉淀，
过滤得滤液B；滤液 A、滤液B及乙酸乙酯萃取后液体
合并，减压浓缩，上 A B-8 型大孔吸附树脂，依次以
水、50%和 95%乙醇进行梯度洗脱，收集 50%乙醇洗
脱馏分，减压浓缩，真空干燥，即得琐琐葡萄总黄酮。
按参考文献[12]方法测定其总黄酮含量为 35.28%。
1.4 细胞毒性实验
细胞接种 48 h 后，倾去培养基，分别加入含不同
质量浓度样品培养基培养，第 4天换含同样样品的培养
基，8d后加入 5mg/mL的MTT溶液，每孔 10μL，37℃
孵育 4h 后，加入 DM SO，每孔 150μL，混匀，使甲
臢完全溶解，用酶标仪在490nm波长处测定吸光度(A给药组)。
以相同条件、相同体积不含样品的培养基培养的细胞作
为对照，测定其吸光度(A 细胞对照组)，按公式(1)计算细胞
抑制率，求出半数中毒剂量(TC 50)。空白组为测定时平
行操作的空白对照组，测定吸光度( A 空白组)。

A细胞对照组－A给药组
细胞抑制率 /%=————————×100 (1)

A细胞对照组－A空白组
1.5 药物活性实验
实验设无药物细胞对照组、不同质量浓度药物组及
阳性对照组和空白对照组。HepG 2.2.15细胞接种 48h
后，倾去培养基，各质量浓度药物组分别加入含琐琐
葡萄总黄酮(100、50、25、12.5μg/mL)的培养基、各
质量浓度阳性对照组分别加入含 3-TC(100、10、1μg/mL)
的培养基，每孔 200μL，每个质量浓度 3 个复孔，同
时每板各设6个细胞对照孔加入同体积无药物培养基作为
细胞对照组，置 37℃，5% CO 2 培养箱中培养，每 4d
换含同样样品的培养基，第 8天分别收集细胞培养上清
液，置－20℃保存备用，待测HBsAg、HBeAg和HBV DNA。
1.6 HBsAg和HBeAg的检测
采用ELISA试剂盒测定细胞培养上清液中HBsAg和
HBeAg的浓度，以 P/N(即样品的吸光度与空白对照吸光
度的比值)表示。根据公式(2)计算各浓度药物对HBsAg
和 HBeAg的抑制率，计算半数有效浓度 IC 50。

A细胞对照组－A给药组
HBsAg(或HBeAg)抑制率/%=————————×100 (2)

A细胞对照组－A空白组
式中：A 给药组为不同质量浓度的药物实验组的吸光
度；A空白组为试剂盒测定时不加酶结合底物而平行操作的
空白对照组；A 细胞对照组为不加药物处理的细胞对照组。
结合细胞毒性实验所得 TC50计算各样品的治疗指数
(TI)，综合判断药物效果。TI= TC50/IC50，TI＞ 2为有
效低毒；1＜ TI≤ 2为低效有毒；TI≤ 1为受试物毒性
大，不宜于用于抗 H B V 治疗。
1.7 HBV DNA的测定
按照HBV DNA荧光定量 PCR试剂盒说明书操作，
测定细胞培养上清液中HBV DNA的拷贝数。根据公式
(3)计算各受试物对HBV DNA的抑制率。

C细胞对照组－C给药组
HBV DNA抑制率/%=————————×100 (3)

C细胞对照组
式中：C 给药组为不同质量浓度的药物实验组的 HBV
DNA拷贝数；C 细胞对照组为不加药物处理的细胞对照组的
HBV DNA拷贝数。
2 结果与分析
2.1 琐琐葡萄总黄酮对HepG 2.2.15细胞的毒性作用
MTT法测定细胞抑制率，结果显示琐琐葡萄总黄
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2.2 琐琐葡萄总黄酮对HBsAg和HBeAg分泌的影响
在琐琐葡萄总黄酮和 3-TC对HepG 2.2.15细胞分泌
HBsAg的 IC50分别为 327.56μg/mL和 315.37μg/mL，其
TI为 0.87和 0.78；对HBeAg的 IC50分别为 215.34μg/mL
和 9051.01μg/mL，其 TI分别为 1.32和 0.03，提示在此
实验条件下，琐琐葡萄总黄酮抑制 HepG 2.2.15分泌
HBsAg和 HBeAg的效果均优于 3-TC(表 1、2)。
2.3 琐琐葡萄总黄酮对HBV DNA的影响
琐琐葡萄总黄酮对HepG 2.2.15细胞分泌HBV DNA
的抑制作用随质量浓度的增大而逐渐增强，而 3-TC可
显著抑制 HBV DNA的分泌，各质量浓度组 DNA拷贝
数＜ 10 3，超出试剂盒检测下限(表 1)。
3 讨 论
琐琐葡萄为葡萄科小无核红葡萄品系药食兼用植
物，药用果实，主产于我国新疆吐鲁番、和田、鄯
善等地[13]；在维吾尔医临床主要应用于脾胃不和、头晕
腰酸、神志不安以及小儿麻疹和肝炎等病症的治疗[14-15]，
为探讨琐琐葡萄的抗病毒药效，本研究应用Hep G 2.2.15
细胞株对琐琐葡萄总黄酮进行了抗HBV活性筛选，结果
显示：琐琐葡萄总黄酮用药 8d后，对HepG 2.2.15细胞
分泌 HBsAg、HBeAg具有显著抑制作用，半数有效剂
量(IC50)HBsAg为327.56μg/mL、HBeAg为215.34μg/mL，
治疗指数(TI)分别为 HBsAg 0.87、HBeAg 1.32，抑制
效果均优于阳性对照药物拉米呋啶，且药物细胞毒性较
小，半数中毒剂量(TC50)为 284.91μg/mL；而琐琐葡萄
总黄酮对 H B V D N A 也表现出一定的抑制作用，在
100μg/mL时抑制率达到 47.63%。细胞培养具有易于控
制实验条件和均衡性好的特点，但体外实验研究结果不
能反映体内所特有的免疫调节及代谢对药物效果的影
响。因此，本研究结果虽然显示琐琐葡萄总黄酮在体
外具有一定的抗HBV生物学活性，与维吾尔医临床应用
效果相一致，但进一步证实其抗病毒作用还须结合体内
实验来确定，其作用机制也有待于深入研究。
参 考 文 献 ：
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药物 TC50/(μg/mL)
HBsAg HBeAg
IC50/(μg/mL) TI IC50/(μg/mL) TI
琐琐葡萄总黄酮 284.91 327.56 0.87 215.34 1.32
3-TC 244.77 315.37 0.78 9051.01 0.03
表 2 琐琐葡萄总黄酮的治疗指数
Table 2 Therapeutic indexes of total flavones from Vitis vinifer L. for
HBsAg and HbeAg
药物
质量浓度 / 细胞抑 HBsAg HBeAg HBV DNA
(μg/mL) 制率 /% 抑制 /% 抑制率 /% 抑制率 /%
100 8.36 37.44 34.22 47.63
琐琐葡萄总黄酮
50 4.22 25.12 25.91 18.21
25 2.70 17.39 11.62 24.79
12.5 3.07 16.91 9.66 2.02
100 10.97 35.99 25.30 ＞ 99.99
3-TC 10 8.52 16.67 12.80 ＞ 99.99
1 6.34 5.80 9.35 ＞ 99.99
表 1 琐琐葡萄总黄酮体外抗 HBV效果
Table 1 Inhibition effects of total flavones from Vitis vinifer L. on
HBV in vitro
酮及 3-TC对Hep G 2.2.15细胞的毒性较小，其 TC50分
别为 284.91μg/mL和 244.77μg/mL(表 1、2)。