全 文 ：·论著·
乌头 、白及配伍存在基于 CYP3A1/2的相互作用＊
金科涛1　王宇光2　石苏英1　沈建幸1　高月2
(1 浙江省诸暨市人民医院 ,诸暨 311800;2军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理研究室 ,北京 100850)
　　摘要:目的:阐明基于药物代谢酶的乌头 、白及配伍产生相互作用的机制。研究二者合用对主要药物代谢
酶 CYP1A2、CYP2E1 、CYP3A1/ 2在酶活性 、mRNA 水平和蛋白质水平的影响。方法:采用高效液相色谱法测
定 CYP1A2、CYP2E1 活性;采用紫外-可见分光光度法测定 CYP3A1/ 2 活性;分别采用 RT-PCR 和 Western
Blo t方法评价药物对 CYP1A2、CYP2E1 、CYP3A1、CYP3A2 mRNA 及蛋白水平的影响。结果:乌头 、白及合用
后 CYP3A1/2 的酶活性明显下降;Western Blo t检测显示 CYP1A2、CYP3A1、CYP3A2 的蛋白质表达水平下
降;RT-PCR 检测显示 CYP1A2 、CYP3A1、CYP3A2 的 mRNA 水平均上升。 结论:乌头 、白及合用后抑制
CYP3A1/ 2的酶活性 ,乌头 、白及配伍存在基于 CYP3A1/2 的药物相互作用。
关键词:细胞色素 P450;酶活性;蛋白质免疫印迹;反转录聚合酶链式反应
Interaction between radix aconiti and rhizoma bletillae based on cytochrome P450 in rat livers
JIN Ke-tao1　WANG Yu-guang2　SHI Su-ying 1　SHENG Jian-xin1　GAO Yue2
(1The People s Hospital of Zhuji City 311800 , Zhuji 311800 , China;
2I nstitute of Radiation Medicine , Academy of M ilitary Medical Science , Beijing 100850 , China)
　　Abstract:Objective:To study the effect of radix aconiti combines w ith rhizoma bletillae on the enzyme activ-
ity , protein expression and mRNA level o f cy tochrome P450 isoenzymes in rat liver.Methods:CYP1A2 and
CYP2E1 activities were quantitated by high perfo rmance liquid chromatographic(HPLC)method;CYP3A1/2 ac-
tivity w as quantita ted by UV-visible abso rption spectrome try.The protein expression of CYP1A2 , CYP2E1 ,
CYP3A1 , and CYP3A2 w ere detected by Western blot.The mRNA level of CYP1A2 , CYP2E1 , CYP3A1 , and
CYP3A2 were detected by semi-quantitative rev erse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PC R).Results:
radix aconiti combined with rhizoma bletillae obviously inhibited the activities of CYP3A1/2.The pro tein expression
of CYP1A2 , CYP3A1 , and CYP3A2 decreased remarkably.The m RNA level of CYP1A2 , CYP3A1 , and
CYP3A2 increased.Conclution:Radix aconiti coadministrates with rhizoma bletillae can restrain the enzyme activity
of CYP3A1/2.There is a herb-herb interaction between radix aconiti and rhizoma bletillae based on CYP3A1/ 2.
Key words:Cy tochrome P450;Enzymes activity;Western blo t;RT-PCR
＊国家自然科学基金资助项目(No.30070936)
通讯作者:高月 ,军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理研究室 ,邮编:100850 ,电话:010-66931312 ,
E-mail:gaoyue@nic.bmi.ac.cn
　　中医学认为 ,当两味中药合用后产生毒性或使
原有药物毒性增加的现象 ,称为“相反”作用 。乌
头 、白及合用一直视作中药配伍禁忌 ,但是乌头 、白
及合用产生相互作用的机制并不清楚。中医学并
没有从理论上 ,也没有从实验证据上阐明产生这一
相互作用的机制 ,长期以来一直停留在一些粗略的
评价上 ,并且所得的结果往往自相矛盾 ,至今尚未
形成统一的判断标准 。在体内参与药物代谢的酶
主要为肝细胞色素 P450 氧化酶(以下简称 P450
酶),又称药物代谢酶 ,是一组由许多同工酶组成的
超家族 ,对许多内源性 、外源性化合物在体内 Ⅰ相
生物转化有重要作用 ,在药理学 、毒理学研究中有
重要意义[ 1] 。细胞色素 P450作为药物代谢主要酶
类 ,在药物相互作用中扮演了重要角色 。中药不论
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其成分多么复杂 ,但在体内起作用的物质基础仍然
属于化合物范畴 。既然是化合物 ,则在体内同样会
面临着机体对它的处置 、P450酶对它的代谢 。基
于这种推论 ,笔者认为乌头 、白及配伍禁忌中同样
存在由 P450酶参与的药物相互作用 。研究需要阐
明以下几个问题:①乌头碱(乌头的主要毒性成分)
被P450酶代谢为何物 ,这种代谢过程使乌头碱毒
性降低了还是增加了 。②究竟哪个或哪几个 P450
亚酶参与乌头碱的代谢过程。 ③白及与乌头配伍
会对哪些 P450亚酶产生怎样的影响 。前两个问题
已在前期研究中阐明[ 2] ,本文是后续研究 ,目的是
要阐明第三个问题。
材料和方法
1.实验动物和分组　清洁级 Wistar 大鼠 , 5周
龄 ,雄性 ,体质量(200±20)g ,由军事医学科学院实
验动物中心提供 ,合格证号:SCXK-(军)2002-001。
动物随机分为空白组 、乌头组(0.25 g·kg-1·d-1)、
白及组(1.26 g·kg-1·d-1)、乌头加白及组(1.51 g·
kg-1·d-1),每组 8只 。
2.药物制备和给药　乌头 、白及购自北京同仁
堂药厂 ,经军事医学科学院放射与辐射医学研究所
马百平教授鉴定 ,乌头为毛莨科植物乌头 Aconi tum
carm ichaeli Debx 的干燥根;白及为兰科植物白及
Bletil la striata (Thunb.)Reichb.f.的块茎 。乌头
按《中国药典》I部规定的临床剂量换算成大鼠剂量
称质量后加入 10 倍量去离子水 ,浸泡 60 min 后于
烧瓶中加热回流三次 ,每次1 h ,合并提取液 ,滤纸过
滤去除杂质 ,离心取上清液并旋转蒸发浓缩至药液
浓度为 0.02g/ml;白及提取液制备同上 ,药液浓度
为 0.1 g/ml;乌头 、白及合用按《中国药典》I 部规定
的临床剂量比例称质量混合 ,制备方法同上 ,药液浓
度为 0.12 g/ml。空白组用生理盐水 ,各药物组给予
规定剂量 ,连续灌胃给药 7 d后处死动物 ,取肝脏制
备微粒体和提取总 RNA。
3.实验药品和试剂　Folin酚试剂 、对硝基酚(4-
nit rophenol ,4-NP ,批号:305H5201 , ≥99%)、非那西丁
(phenacetin ,批号:S32704 , ≥99%)、扑热息痛(parac-
etamol ,批号:103K2519 , ≥98%)为 Sigma公司产品;
红霉素(ery thromycin ,批号:A019466807 , ≥99%)购自
AMRESCO公司;1 , 2-二羟基-4-硝基苯(4-nitrocate-
chol ,4-NC , ,批号:C205110 , ≥99%)为ACROS公司产
品;RNA 提取试剂盒(RNAgents total RNA isolation
system)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)一步法试
剂盒为 Promega 公司产品;DL 2000 DNA Marker 为
TAKARA 公司产品。CYP1A2 、CYP2E1 、CYP3A1 、
CYP3A2和CYC(cyclophilin ,亲环素)的引物由北京赛
百盛基因技术有限公司合成。兔抗鼠多克隆抗体及
ECL化学发光试剂为Santa Cruz公司产品;辣根过氧
化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体为 CHEMICOM 公
司产品;预染蛋白标准(prestained protein marker)为
NEW ENGLAND公司产品。其他无机及有机试剂均
为国产色谱或分析纯。
4.肝微粒体的制备　大鼠脱臼处死 ,打开腹腔和
胸腔 ,用止血钳结扎胸腔主动脉和下腔静脉。用注射
器吸冰冷生理盐水从下腔静脉止血端上缘冲洗肝脏 ,
至肝脏颜色变为土黄色止。采用钙沉淀法制备微粒
体 ,肝脏组织按 1∶4(w/v)比例加入 TMS 缓冲液匀浆
后于 12 000 g ,4℃,离心20 min ,弃沉淀 ,取上清液 ,每
1 ml上清液加0.1 ml 88 mmol/L CaCl2 溶液 ,轻搅拌
数次 ,混匀 ,冰浴 5min。再 27 000g ,4℃,离心 20min ,
弃上清 ,取沉淀 ,按 1g 肝质量加 1ml 0.1mol/L Tris-
HCl缓冲液 ,含 150 mol/L KCl ,pH7.4。再 27 000g ,4
℃,离心20 min ,弃上清 ,取沉淀 ,按1 g 肝质量加 1 ml
0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液[含 1 mol/L EDTA 和
20%(w/v)甘油 ,pH7.4]用玻璃匀浆器重悬 ,重悬液
放入液氮管中 ,液氮中保存 ,备用。微粒体蛋白含量
采用 Lowery[ 3]法定量 ,使用牛血清白蛋白作为标准。
　　5.CYP1A2 、CYP2E1 、CYP3A1/2活性测定　CYP
1A2活性按文献[ 4]测定;CYP2E1活性按文献[ 5]测定;
CYP3A1/2活性按文献[ 6]测定。
6.CYP450及 b5 含量测定　CYP450与 b5 含
量测定采用 Omura和 Sato 方法测定[ 7] 。
7.蛋白质免疫印迹(Western blo t)　十二烷基
磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按
Laemmli[ 8]方法进行。20 -30μg 的微粒体蛋白用
10%SDS-PAGE 分离后 ,再按照 Towbin[ 9] 方法电
转印到 PVDF 膜上 。电转印完后 ,用含 5%(w/v)脱
脂奶粉的 TTBS封闭液 4 ℃封闭过夜 。再取封闭后
PVDF 膜置于含兔抗鼠多克隆抗体(一抗)的上述封
闭液中室温摇床孵育 1 h ,用 TTBS 缓冲液洗膜 3
次 ,15 min/次;再将 PVDF 膜置于含羊抗兔多克隆
抗体(辣根过氧化物酶标记的二抗)的上述封闭液中
室温摇床孵育 1 h ,用 TTBS 缓冲液洗膜 3 次 , 15
min/次;再用 TBS 缓冲液洗膜 1 次 , 10 min。将已
用二抗标记了的 PVDF 膜与 ECL 化学发光试剂反
应 ,在暗室与 X光胶片曝光后显影。用 Scion image
1.62c软件测条带灰度值 ,计算目的蛋白与看家蛋
白(β-actin)的光密度比值(OD 值)。检测时以 β-
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actin 为内参照 , 以 CYP1A2 、CYP2E1 、CYP3A1 、
CYP3A2与 β-actin 蛋白表达量灰度的比值作为
P450亚酶蛋白质表达的相对水平 。所有蛋白质免
疫印迹的结果都在同组不同样品上得到重复 。
8.总 RNA 的提取 　大鼠处死后迅速取出肝
脏 ,置于液氮中保存。按 Promaga 公司 RNA 提取
试剂盒说明书提取肝脏总 RNA 。电泳分析表明总
RNA片段未降解 , 18S 和 28S 条带清晰可见 ,A260/
A280比值在 1.6与 1.8之间 ,所提总 RNA 可用 。
9.反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)　采用
Promaga公司的 RT-PCR 一步法试剂盒说明书进
行。将 CYP1A2 、CYP2E1 、CYP3A1 、CYP3A2 及
CYC(看家基因)等体积的 RT-PCR 产物 10 μl 上
样 ,经 1.5%琼脂糖凝胶电泳辨认 ,拍照 。检测时以
CYC基因的 RT-PCR产物为内参照 ,以 CYP1A2 、
CYP2E1 、CYP3A1 、CYP3A2 与 CYC 基因扩增条带
表达量像素光密度比值(OD 值)作为 P450 亚酶
mRNA 表达的相对水平。特异性引物序列见表 1 。
表 1　用于 RT-PCR分析的大鼠 P450 亚酶引物序列
P450同工酶 5正义链引物 3反义链引物 片段长度(bp)
CYP1A2
GTCACCTACGG
GAATGCTGTG
GTTGACAATCT
TCTCCTGAGG
236
CYP2E1
CTCCTCGTCA
TATCCATCTG
GCAGCCAATCA
GAAATGTGG
473
CYP3A1
ATCCGATAT
GGAGATCAC
GAAGAAGTCC
T TGTCTGC
579
CYP3A2
AGTAGTGACGA
TTCCAACATAT
TCAGAGGAT TC
TGTGTTTCCT
252
CYC
CT TCGACATCAC
GGCTGATGG
CAGGACCTGT
ATGCTTCAGG
265
10.统计学处理　实验数据用 x ±s 表示 ,采用
SPSS10.0统计软件单因素方差分析进行组间比较。
P<0.05表示有统计学差异。
结果
　　1.乌头 、白及合用后对CYP1A2 、CYP2E1 、CYP
3A1/2酶活性的影响　与空白组比较 ,从图 1A可见 ,
白及单用及与乌头合用能降低 CYP1A2的活性但没
有统计学差异;从图 1B可见 ,白及单用及与乌头合
用对 CYP2E1活性基本没有影响;从图 1C可见 ,白
及单用及与乌头合用均能明显降低 CYP3A1/2 活
性 ,统计学有非常显著差异(P<0.01)。
2.乌头 、白及合用后对CYP450及 b5 含量的影
响　从表 2可见 ,与空白组比较 ,白及单用 、及与乌
头合用后对 CYP450及 b5 的含量有一定影响 ,但未
见统计学差异。
表 2　乌头 、白及单用 、合用对 CYP450、b5
含量的影响(x±s , n=8)
组别 CYP450(nmol/mg) b5(nmol/mg)
空白组 0.55±0.19 0.18±0.17
乌头组 0.49±0.16 0.16±0.06
白及组 0.58±0.04 0.11±0.08
白及加乌头组 0.44±0.11 0.14±0.04
3.乌头 、白及合用后对 CYP1A2 、CYP2E1 、
CYP3A1 、CYP3A2 蛋白质表达的影响　从图 2 可
以看出 , 与空白组比较 , 乌头与白及合用后使
CYP1A2 、CYP3A1 、CYP3A2 的蛋白表达水平明显
降低 ,而对 CYP2E1 蛋白质表达的影响则不明显;
白及单用抑制 CYP1A2 、CYP2E1 、CYP3A1的蛋白
表达水平 ,且作用比单用乌头要明显 。
4.乌头 、白及合用后对 CYP1A2 、CYP2E1 、
CYP3A1 、CYP3A2mRNA表达的影响　从图3可见 ,
图 1　乌头 、白及单用 、合用对 CYP1A2 、CYP2E1 、 CYP3A1/ 2 酶活性的影响
注:A 表示药物对CYP1A2的酶活性的影响;B表示药物对 CYP2E1的酶活
性的影响;C 表示药物对 CYP3A1/ 2的酶活性的影响。 a 为空白组;b为乌头组;
c 为白及组;d 为乌头加白及组。与空白组比较 , ＊P <0.05 , ＊＊P<0.01;
与乌头组比较 , #P<0.05。
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图 2　乌头 、白及单用 、合用对 CYP1A2 、CYP2E1 、 CYP3A1 、CYP3A2 蛋白表达的影响
注:A表示药物对 CYP1A2的影响;B表示药物对 CYP2E1的影响;C表示药物对 CYP3A1
的影响;D表示药物对 CYP3A2的影响;a 为空白组;b 为乌头组;c为白及组;
d 为乌头加白及组。
图 3　乌头 、白及单用 、合用对 CYP1A2 、CYP2E1、 CYP3A1 、CYP3A2m RNA水平的影响
注:A 表示药物对 CYP1A2 mRNA表达的影响;B表示药物对 CYP2E1 mRNA 表达的影响;
C表示药物对CYP3A1 mRNA 表达的影响;D 表示药物对 CYP3A2 mRNA表达的影响。
a 为空白组;b 为乌头组;c为白及组;d 为乌头加白及组。
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乌头与白及合用后 ,诱导CYP1A2 、CYP3A1 、CYP3
A2的 mRNA表达 ,但对 CYP2E1的 mRNA表达无
明显影响 。
讨论
研究结果表明乌头 、白及两药合用后对 I 相代
谢酶的抑制作用具有选择性。两药合用后能明显降
低CYP3A1/2的活性 ,但对 CYP1A2 、CYP2E1活性
的作用不明显。Western blot的结果显示 ,两药合用
后显著降低 CYP1A2 、CYP3A1 、CYP3A2的蛋白质
表达水平 , 而对 CYP2E1 的蛋白质表达几乎无影
响。从这两个水平来看 , 两药合用对 CYP3A1 、
CYP3A2的影响是一致的 。提示酶活性下降可能主
要由转录后调节降低其蛋白水平来实现 。
在一个细胞 、器官和组织中 ,单个蛋白质表达水
平并不完全反映这种蛋白质的生物活性 ,这种现象
是普遍存在的 。蛋白质活性是一个复杂的综合过
程 ,它涉及到蛋白质翻译后修饰 ,在组织 、细胞和亚
细胞中的定位以及它与别的蛋白质间的相互作用 。
分析蛋白质活性必须考虑每个方面并把所得各部分
的数据综合起来。有研究结果显示 ,毒性效应可以
通过蛋白质修饰的方式显示出来。在 mRNA 水平
研究基因表达似乎是一种比蛋白质更简单而且灵敏
的手段 ,但是 ,通过 mRNA 浓度的测定得到的基因
调控研究是间接的 ,仅能代表一种间接的测量 ,还有
很多现象未能检出;在翻译水平的基因表达调控在
多数情况下是起决定作用的 ,这类调控通过 mRNA
的定量分析检测不到 。以上这些观点或许可以成为
本次实验中酶活性测定结果与蛋白质水平和 mR-
NA水平不一致的一种解释 。
研究结果揭示了乌头 、白及合用后抑制了
CYP3A1/2的活性。结合研究前期工作中对乌头碱
代谢亚型研究的结果[ 2] ,笔者可以初步阐明乌头 、
白及配伍存在相反作用的机理:①乌头与白及合用
后抑制了 CYP3A1/2的活性;②乌头碱的代谢亚型
主要是CYP3A和 CYP1A2;③CYP3A和 CYP1A2
对乌头碱的代谢过程是一个逐渐降低乌头碱毒性的
解毒过程 。因而从理论上而言 ,白及与乌头配伍后 ,
会导致乌头碱毒性增加的结果 。原因是药物合用抑
制了代谢乌头碱的亚型酶 CYP3A1/2的活性 ,致使
乌头碱被肝细胞色素 P450 酶代谢的速度减慢 ,使
其在体内的停留时间延长或相对血药浓度增加 ,从
而产生乌头碱毒性增加的相互作用。当然这种推断
有待于进一步的整体动物实验验证。
参 考 文 献
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(收稿日期:2007 年 1 月 16 日)
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