全 文 ：＊基金项目:贵州省科技基金(E2001-4)
　作者单位:1.贵阳医学院生物化学与分子生物学教研室 , 贵阳
550004;2.贵州省贵阳中医学院临床部
　作者简介:吴宁(1974-),女, 贵州贵阳人 ,讲师,硕士,研究方向:分
子生物学。
　通讯作者:雷霆雯
文章编号:1001-0580(2007)07-0827-03　　中图分类号:R 285.5　　文献标志码:A 【论　　著】
漏芦对细胞色素 P450酶活性及mRNA表达影响＊
吴宁1 ,李红梅1 ,吴青青1 ,许庆忠1 ,唐良华2 ,雷霆雯1
　　摘　要:目的　研究漏芦对 CYP2E1酶活性及其 mRNA表达水平的影响。方法　以大鼠原代肝细胞为研究对象 ,
实验组分别加入不同浓度漏芦(15.6 , 31.2 , 62.4 mg/ ml)处理 48 h , 用苯胺羟化酶(aniline hydroxylase , ANH)活性反映
CYP2E1 酶活性, 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CYP2E1mRNA表达水平。结果　漏芦作用后 , CYP2E1 酶活
性及相应 mRNA 的表达呈浓度依赖性抑制。漏芦在 15.6 , 31.2 , 62.4 mg/ml浓度下对 CYP2E1 酶活性的抑制率分别为
22.5%, 55.8%, 64.7%;对 CYP2E1mRNA 表达水平的抑制率分别为 36.6%, 51.7%, 61.4%。结论　漏芦浓度依赖性抑
制 CYP2E1 酶活性 ,在转录水平下调大鼠肝细胞 CY2E1的表达。
关键词:CYP2E1;酶活性;RT-PCR;漏芦
Effects of rhaponticum uniflorum(L.)DC on activity and mRNA expression of cytochrome P450　WU Ning , LI Hong-mei , WU
Qing-qing , et al.Biochemistry and Molecular Biology Teaching and Research Section , Guiyang Medical College(Guizhou 550004 ,
China)
Abstract:Objective　To study effects of rhaponticum uniflorum (L.)DC on the activity and mRNA expression of CYP2E1.
Methods　Rat hepatocy tes sandwich cultures were treated rhaponticum uniflorum(L.)DC in different concentrations (15.6 , 31.2 ,
62.4 mg/ ml)for 48 hour.The enzymic activity of CYP2E1 was reflected the activity of liver microsomal aniline hydroxylase(ANH).
The mRNA expression level of CYP2E1 was determined by semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT
-PCR).Results　After treatment with the medicine , there was concentration-dependent inhibition in both enzymic activity and
mRNA level of CYP2E1 compared with the control.The rates of the inhibitory effect to CYP2E1 activity were 22.5%, 55.8% and
64.7% respectively , while those of the inhibitory effect to mRNA level were 36.6%, 51.7% and 61.4% respectively.Conclusion　
Rhaponticum uniflorun(L.)DC inhibits the enzymic activity of CYP2E1 and down-regulates CYP2E1 expression at the transcrip-
tive levels.
Keywords:CYP2E1;enzymic activity;reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR);rhaponticum uniflourm
(L.)DC
　　细胞色素氧化酶 P450(cytochrome P450 , CYP450)是一类结
构和功能相关的超家族基因编码的同工酶 ,其主要位于肝微粒
体中 , 参与许多内外源性化合物在体内的 I 相生物转化 ,在毒
理学和药理学研究中有重要意义〔1〕。研究表明 , 多种 CYP450
酶活性可因某些药物 、环境因子 、食物成分的影响发生改变〔2〕 ,
祁州漏芦为菊科植物[ Rhaponticum uniflorum(L.)DC.] 的根 ,主
要成分为挥发油 , 具有清热解毒 、消肿排脓等功效。本文旨在
研究漏芦对细胞色素 P450 酶系中的 CYP2E1 酶活性的影响 ,
并通过 RT-PCR了解酶活性改变的机制 , 为探讨其作用机制
及可能产生的药物作用提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料　
1.1.1　实验动物　Wistar 大鼠(贵阳医学院实验动物管理中
心),雌雄不限 , 180～ 200 g。
1.1.2　药品与试剂　祁州漏芦(贵阳中医学院);标准胎牛血
清 Dulbecco改良的 Eagle s培养基(DMEM)培养基(美 Gibco公
司);percoll , Trypsin 1∶250(华美生物工程公司);鼠尾胶 、Ⅰ、Ⅱ型
胶原酶 ,苯胺, Trizol 试剂, oligo(dT)16 , 焦炭酸二乙脂(DEPC),
RNA酶抑制剂 ,M-MLV逆转录酶 , PCR扩增试剂(上海生工
生物工程技术服务有限公司);烟胺腺嘌呤磷酸二核酸(NADP)
(美国 AMRESCO公司);6-磷酸葡萄糖二钠(美国 Sigma公
司);6-磷酸葡萄糖脱氢酶(美国Worthington公司);RT-PCR
引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成);CYP2E1 引
物:上游:5′-CTCCTCGTCATATCCATCTG -3′下游 5′-
GCAGCCAATCAGAAATGTGG -3′, PCR 产物片段长度 473
bp;内 对照(β - actin)引 物:上 游:5′-GCCCAGAGCAA-
GACAGGTAT -3′下游 5′-GGCCATCTCCTGCTCGAAGT -
3′, PCR产物片段长度 513 bp;其它化学试剂均为分析纯。
1.1.3　药物制备　取 100 g粉状的漏芦加入 800 ml双蒸水煎
煮 40 min ,过滤 ,滤渣再加入 500 ml双蒸水继续前煮 40 min ,过
滤 ,合并 2 次滤液, 浓缩至 100 ml , 3 000 r/ min离心 15 min ,取上
清液(相当于 1 g 生药/ ml),用微孔滤器过滤除菌 , 分装后 4 ℃
冰箱保存备用。
1.2　方法　
1.2.1　肝细胞分离和培养　参考两步循环灌注法〔3〕 , 采用胶
原蛋白凝胶三明治〔4〕培养。
1.2.2　分组　分为低 、中 、高药物浓度组(按生药总量计算),
药物分别按 1∶64 , 1∶32 , 1∶16 倍稀释(用含 3%胎牛血清的
DMEM 稀释),使其终浓度分别为 15.6 , 31.2 , 62.4 mg/ ml , 每组
设 6 个复孔;另设对照组 1 个, 加入含 3%胎牛血清的 DMEM
培养液。
1.2.3　药物作用　将新鲜分离出的肝细胞以 2×105 个细胞/
cm2接种于 6 孔培养板上, 细胞培养 24 h 后 , 实验组分别加入
不同浓度的漏芦 ,对照组加入等容积含 3%胎牛血清的 DMEM
培养液于细胞孵育体系中继续培养 48 h ,收集肝细胞进行酶学
分析和 RT-PCR。
1.2.4　CYP2E1 活性测定　超声细胞粉碎仪破碎细胞制备匀
浆 ,钙沉淀法制备微粒体〔5〕。通过测定苯胺-羟化酶(ANH)活
827中国公共卫生 2007年 7月第 23卷第 7期　　Chin J Publ ic Health Ju l 2007 Vol.23 No.7
性反映 CYP2E1 酶活性的大小〔6〕。
1.2.5　大鼠肝脏总 RNA提取及鉴定　按 Trizol试剂(上海生
工公司)说明书提取肝脏总 RNA , 紫外分光光度法测定 RNA
纯度 , 电泳鉴定总 RNA的完整性。
1.2.6　逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)按 M-MLV Reverse
Transcriptase说明书(上海生工生物工程技术服务有限公司)逆
转录合成第一链互补脱氧核糖核酸(cDNA), 然后通过特异性
引物 PCR扩增大鼠肝细胞中的 CYP2E1 和内对照 β -actin基
因。 PCR扩增反应参照文献〔1〕 ,稍加改动。总体系25μl , 预变
性94 ℃ 5 min , 变性 94 ℃ 30 s ,退火 56 ℃ 1 min ,延伸 72 ℃ 1
min , 终末延伸 72 ℃ 7 min , 30 个循环。PCR产物经 2%琼脂糖
凝胶分离并与 DNA Marker(标准分子量)比较鉴定 ,在凝胶成
像分析系统照相观察结果并记录。计算 CYP2E1 基因与 β-
actin基因扩增条带表达量像素灰度的比值 ,并以此比值作为
P450 酶基因 mRNA表达的相对水平指标。
1.3　统计分析　采用 SPSS 10.0 统计软件进行分析。用方
差分析进行多组数据间的比较 , 用最小显著差法(LSD)进行
不同药物浓度组与对照组间比较。
2　结　果
2.1　漏芦对大鼠肝细胞 CYP2E1 酶活性的影响　与对照组
(5.2303 ±0.7313)nmol/(mg·min)比较 , 漏芦(4.0537 ±
0.7662),(2.3133 ±0.7479), (1.8450 ±0.4364)nmol/(mg·
min)CYP2E1 酶活性差异有统计学意义(P<0.05),均明显受
到抑制 , 且呈浓度依赖性抑制 , 抑制率分别为 22.5%,
55.8%, 64.7%。
2.2　总 RNA 电泳鉴定完整性(图 1)　检查 RNA 的完整性
一般采用电泳的方法 ,真核生物完整的总 RNA 其 28sRNA的
量是18sRNA 的 1.5～ 2 倍 , 5sRNA 很少或没有。本实验提取
的 RNA 样品经电泳鉴定其完整性好。
1:对照组;2:低浓度组 RNA;3.中浓度组 RNA;4:高浓度组总 RNA
图 1　大鼠肝细胞总 RNA 琼脂糖凝胶电泳图
2.3　CYP2E1 基因的 RT-PCR结果　
2.3.1　不同浓度药物组 RT-PCR电泳图(图 2 ～ 5)
2.3.2　漏芦对 CYP2E1mRNA 表达的影响 　各实验组
CYP2E1m RNA表达水平与对照组比较 , 差异有统计学意义
(P <0.05),均明显受到抑制 , 且呈浓度依赖性抑制 , 漏芦在
低 、中 、高浓度组对 CYP2E1m RNA 表达水平抑制率分别为
36.6%, 51.7%, 61.4%。
M:100bpDNAMarker;1:β-act in;2:CYP2E1
图 2　对照组 CYP2E1RT-PCR 电泳图
M:100bpDNAMarker;1:β-act in;2:CYP2E1
图 3　低浓度组 CYP2E1RT-PCR 电泳图
M:100bpDNAMarker;1:β-act in;2:CYP2E1
图 4　中浓度组 CYP2E1RT-PCR 电泳图
M:100bpDNAMarker;1:β-act in;2:CYP2E1
图 5　高浓度组 CYP2E1RT-PCR 电泳图
828 中国公共卫生 2007年 7月第 23卷第 7期　　Chin J Publ ic Health Ju l 2007 Vol.23 No.7
3　讨　论
CYP2E1 是细胞色素 P450 亚型中的重要成分 , 主要分布
于人和鼠等动物的肝脏组织。 CYP2E1 参与 70 多种低分子
物质代谢 ,其中大部分为前致癌物或前毒物 , 小部分是临床药
物〔8〕。本实验结果显示 , 漏芦对 CYP2E1 酶活性有浓度依赖
性抑制作用 , 抑制率最高可达 50%以上 , 并下调其 CYP2E1
m RNA表达 , 提示漏芦是通过降低 CYP2E1 的转录水平而产
生抑制作用。漏芦对 CYP2E1 酶活性的抑制可能在 3 方面产
生影响:(1)CYP2E1主要通过催化相对分子质量低的前致癌
物如亚硝胺类和偶氮化合物 N-亚硝基二甲胺等去烷基 、去
硝基反应使之转变为致癌物 , 增加机体患肿瘤的机率。漏芦
抑制 CYP2E1 活性能减少前致癌物活化 , 降低对致癌物的暴
露危险 ,具有化学性预防肿瘤的作用。(2)CYP2E1 是肝的特
异性功能酶〔9〕 , 肝脏是外源物质代谢的器官 ,一些小分子量的
CYP2E1 底物如氟烷 、四氯化碳等在 CYP2E1 催化下生成具
有肝脏毒性的活性中间产物 , 漏芦通过抑制 CYP2E1 活性可
减少这些毒性物质生成 , 在预防与治疗肝损伤方面可能有一
定作用。(3)CYP2E1 参与部分药物代谢如异烟肼 、乙酰氨基
酚等。本实验结果提示 , 漏芦合并使用以 CYP2E1 为底物的
药物要注意漏芦可能降低代谢速度 ,长期大剂量使用易引起
药物蓄积而引起中毒。
参考文献
〔1〕　Ingelman SM.Pharmacogenetics of cytochrome P450 and i ts appli-
cat ions in drug therpy:the past , present and fut re[ J] .T rends Phar-
macol S ci , 2004 , 25(4):193-200.
〔2〕　雷霆雯 ,李红梅 ,许庆忠 ,等.大青叶对 CYP1A1 酶活性及转录
水平影响[ J] .中国公共卫生 , 2006 , 22(10):1241-1242.
〔3〕　李峰, 倪润洲 ,肖明兵.大鼠肝细胞原代培养技术因素的探讨
[ J] .南通大学学报:医学版 , 2006, 26(1):43-44
〔4〕　杨静 ,彭仁绣 ,于皆平.18α-甘草酸下调“胶原蛋白凝胶三明治”
培养的大鼠肝细胞P450酶活性及 mRNA的表达[ J] .中国药理
学与毒理学杂志 , 2001 , 15(2):155-158.
〔5〕　李伟荣 ,董静 ,宓穗卿.大鼠肝微粒体细胞色素 P450 含量的影
响[ J] .广东医学 , 2005 , 27(9):1093.
〔6〕　Peng RX , Lei SB , Gao P.The capactiy of drug metabolism in Chi-
nese fetal livers Ⅱ.Metabolism of ethylmorphine aminopy rine and
aniline[ J] .Asian Pac J Pharmacol , 1990 , 5(1):13-18.
〔7〕　Zhang QY , Dunbar D , Kaminsky LS.et al.Characteri zation of
mouse small intest inal cytochrome P450 expression [ J] .Drug
Metaboli sm and Disposi tion , 2003, 31(11):1351-1360.
〔8〕　周宏灏.遗传药理学[ J] .2 版.北京:科技出版社 , 2001:53-
122.
〔9〕　Xiaobo Man , Liang Tang , Xiuhua Qiu , et al.Expression of cy-
tochrome P4502E1 gene in heaptocelluar carcinoma [ J] .World
Journal of Gast roenterology , 2004 , 10(11):1565-1568.
收稿日期:2006-12-01 (文涛编辑　赵淑艳校对)
＊基金项目:国家自然科学基金(30471429);山东省科技攻关项目
(2004GG2202153)
　作者单位:山东省职业卫生与职业病防治研究院 ,济南 250062
　作者简介:王翠娟(1979-), 女 ,山东人 , 硕士在读 , 主要从事职业
卫生与环境卫生工作。
　通讯作者:邵华
文章编号:1001-0580(2007)07-0829-03　　中图分类号:R 446　　文献标志码:A 【综　　述】
微流控芯片技术在基因分析研究中应用＊
王翠娟 ,邵华 ,张放
　　20 世纪 90 年代初 ,以微机电加工技术(micro-electrome-
chanical systems , MEMS)为基础的微型全分析系统(miniatur-
ized to tal analy sis systems , 或 micro to tal analy sis systems , μ-
TAS),在近 10 余年中已经发展为当前世界上最前沿的科技
领域之一。μ-TAS 系统也被称为芯片实验室(lab-on-a-chip),
是生物芯片的最终目标〔1〕。该技术是将化学 、生物学等领域
所涉及的样品制备 、生物与化学反应 、分离和检测等过程缩微
或基本缩微到一块几平方厘米的芯片上 , 用以完成不同的生
物或化学反应过程 ,并对其产物进行分析的技术 , 是一个微而
全的系统。与相对应的宏观分析方法比较 , 该系统有很多优
点。微米级通道中的高导热和传质速率及缩小的结构尺寸使
其具有极高的效率 ,由于微流控分析的试样及试剂已降低到
微升水平 ,减少了分析费用和贵重生物试剂的消耗 , 同时减少
了环境污染。μ-TAS 可分为芯片式和非芯片式两大类 , 从文
献和商业开发看 , 芯片式是发展的重点。 其中在芯片式
μ-TAS中 ,依据芯片的结构和工作原理又可分为微流控芯片
和微阵列芯片。目前微流控芯片(microfludic chip)是μ-TAS
中最活跃的领域和发展前沿 ,用微加工技术制作的微流控芯
片部件的微小尺寸使多个部件与功能集成在数平方厘米的芯
片上成为可能 , 在此基础上容易制成功能齐全的便携式仪器 ,
可用于各类现场分析。原则上 , 微流控芯片可应用于各个分
析领域 , 如生物医学 、新药物的合成与筛选 、食品和商品检验 、
环境监测 、刑事科学 、军事科学和航天科学等其他重要应用领
域 , 其中生物分析是热点。 目前其应用主要集中在核酸分离
和定量 、DNA 测序 、基因突变和基因差异表达分析等。另外 ,
蛋白质的筛分在微流控芯片中也已有报道。本文拟对微流控
芯片的概念和特点作简要介绍 ,并对近年国内外学者利用微
流控芯片进行基因分析的研究进展作一综述。
1　微流控芯片技术在基因分析中的应用
1.1　聚合酶链反应　聚合酶链反应(Polymerase Chain Reac-
tion , PCR)是一种对核酸分子进行体外扩增的方法 , 已经广
泛应用于生物医学各个领域 , 反应的主要操作过程在 3 个温
度区间重复循环 , 经过酶促反应扩增特定的 DNA 片段 , 扩增
后的产物可用于诊断疾病 、检验组织或血样中的特殊细菌或
病毒。常规的 PCR过程需要制样 、扩增及检测等步骤 ,既费
时又费力 , 而微流控芯片技术用于 PCR 扩增及相关检测时 ,
既能简化操作步骤 , 又能显著提高检测效率。目前 , 反应池内
固定扩增式 PCR和连续流动式 PCR已经成为芯片上 PCR扩
增的 2 种主要形式〔2〕。前者基于静态反应 , 通过反应池内温
度的周期性变化实现扩增 , 后者是依靠生物样品顺序流过 3
个不同的温度区实现扩增。 1996年 Kopp 等〔3〕首次提出连续
流动式微流控 PCR 芯片 , 其核酸的扩增过程均在流动中进
行 , 流动式芯片下面分别有 95℃、72℃、 60℃3 个不同的恒温
829中国公共卫生 2007年 7月第 23卷第 7期　　Chin J Publ ic Health Ju l 2007 Vol.23 No.7