全 文 ：CHINESE HORTICULTURE ABSTRACTS
石龙芮毛茛愈伤组织诱导及再生体系建立研究
李 洁，姜 朋，吴丽巍，张冬艳，姜长阳
(辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081)
摘 要：为保护野生资源、实现人工栽培，以石龙芮毛茛的下胚轴为材料，进行愈伤组织的诱导和分化、不定芽
分化、试管苗生根和生根继代、试管苗移栽和定植的研究，建立起石龙芮毛茛的下胚轴再生体系。结果表明：
MS+KT 0. 4 mg/ L+2, 4- D 1. 8 mg/ L是愈伤组织诱导培养和增殖继代培养的理想培养基；MS 0是愈伤组织分化培养
的理想培养基；采用向培养瓶中加入约5 ml浓度为2 mg/ L的NAA溶液处理24 h，再把不定芽切下接种到1/ 3 MS+ IAA
0. 3 mg/ L培养基的方法，是不定芽生根培养和生根继代培增殖培养的理想方法。试管苗移栽、定植成活率较高；
定植的试管苗保持石龙芮毛茛的所有植物学性状。
关键词：石龙芮毛茛；愈伤组织；再生体系
石龙芮毛茛 (Ranunculus sceleratus)又称石龙芮、水
堇、姜苔、水姜苔、野芹菜等，属于毛茛科、毛茛属1年生
草本植物，生长于山沟、河边湿地或平原湿地等环境中，
在我国各省、区均有分布[1]，辽宁主要分布于沈阳、大连等
地 [2, 3]。石龙芮毛茛全草含原白头翁素、5- 羟色胺、白头翁
素、胆碱和黄酮类化合物等成分[4, 5]；石龙芮毛茛的全草作
为中药用，具有解毒、散结、止痛、截疟等功效，能治外
痛痈肿毒、毒蛇咬伤、痰核、风湿痹疼、牙疼、疟疾等疾
病[5]。由于石龙芮毛茛防风是一种具多种功效的草药，多年
来人们一直在大量的采挖草药出售，使野生资源遭到严重
破坏。而近年来，家畜、家禽养殖者又发现，在饲料中添
加少量石龙芮毛茛的干粉，能较明显地减少畜禽疾病，因
此，有关养殖者进行大量的采集作为饲料的添加剂，使本
来分布与数量就很有限的野生资源又遭到严重破坏。在大
连郊区，现在已经很难见到野生的石龙芮毛茛。为保护野
生资源、实现人工栽培，研究者对石龙芮毛茛进行愈伤组
织诱导及无性系建立的研究，虽然目前已多有植物组织培
养研究[6- 8]和毛茛科植物相关研究的报道[9- 11]，但迄今未见石
龙芮毛茛无性系建立研究的报道。
1 材料与方法
1. 1 材料及灭菌
于8、9月份，将大连郊区水库旁生长旺盛的石龙芮毛
茛种子采回实验室，在冰箱冷冻箱中处理3个月后，放到
200 ml的磨口广口瓶中，用清水冲洗1 h左右，再用无菌水
洗涤30 min，然后移到超净工作台上进行灭菌。具体方法
是：用75%的乙醇灭菌约20 s后，用0. 05%的HgCl2溶液振
荡灭菌16 min，最后用无菌水振荡洗涤6次，即获得无菌
种子[6]。
1. 2 培养条件
以MS、1/ 2 MS、1/ 4 MS、LS、White为基本培养基，
附加不同种类、不同浓度的生长调节剂。固体培养基的动
力强度为220 g/ cm2，培养基pH值5. 8；培养温度24±1℃；
所有培养基加蔗糖浓度20 g/ L；培养在光照条件下进行，
光照强度为2 700 lx左右；光照时间为12 h/ d[7]。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 无菌苗的获得及愈伤组织的诱导培养 把无菌种子
接种到1/ 4 MS 0的培养基上，放到光照培养箱中萌发。当
幼苗生长到高1 cm左右、子叶已经完全展开时，将子叶剪
成边长0. 2 cm的块状，将下胚轴剪成长约0. 4 cm的胚轴
段，接种到以MS+KT 0. 4 mg/ L为基本培养基，附加浓
度分别为0 mg/ L、0. 6 mg/ L、1. 2 mg/ L、1. 8 mg/ L、
2. 4 mg/ L、3. 0 mg/ L的IBA、2, 4- D两种生长素培养基
上，进行不同浓度生长素对子叶与下胚轴愈伤组织的诱导
培养影响试验。子叶、下胚轴愈伤组织诱导试验重复3次，
每种培养基接种培养100个材料。
1. 3. 2 愈伤组织的分化培养 把增殖继代培养的愈伤组织
切成长为0. 3～0. 4 cm块状后，接种到不加生长素的MS 0、
1/ 2 MS 0、1/ 4 MS 0、LS 0、White 0或附加生长素
NAA 0. 3 mg/ L的MS、1/ 2 MS、1/ 4 MS、LS、White培
养基上进行愈伤组织的分化试验。愈伤组织分化试验每种
培养基接种培养100块愈伤组织，重复2次。
1. 3. 3 不定芽生根培养的影响 把由愈伤组织分化的不定
芽采用以下3种方法进行处理：(1)把不定芽从基部剪下后，
直接接种到生根培养基中进行生根试验(以下简称为方法1)；
(2)向生长着分化不定芽的培养瓶中加入约5 ml 2 mg/ L的
NAA溶液处理24 h后，从基部剪下，接种到生根培养基中
进行生根试验(以下简称为方法2)；(3)把不定芽直接从基部
剪下，把下部切口在浓度为2 mg/ L的NAA溶液中浸蘸一
下，接种到生根培养基中进行生根试验(以下简称方法3)。
进行生根的培养基为1/ 2 MS 0、1/ 3 MS 0、White 0、
1/ 2 MS+ IAA 0. 3 mg/ L、1/ 3MS+ IAA 0. 3 mg/ L、White+
IAA 0. 3 mg/ L 6种基本培养基。生根培养试验每种培养
基接种培养100个不定芽，重复2次。
第一作者简介：李 洁（1990－），女，本科；就读于辽宁师范大
学生命科学学院。
通讯作者：姜长阳，教授。E-mail:changyangjiang@126.co
项目来源：辽宁省高等教育教学改革资助项目(20090304)；辽宁
师范大学教学改革资助项目(LSJG:20090108)。
24
中国园艺文摘 2012年第6期
1. 3. 4 试管苗的移栽、定植 把生根试管苗的培养瓶移到
温室中后，从瓶中取出，移栽到上面覆盖1层7～9 cm厚的
干净河沙的温室苗床上，进行试管苗的移栽试验。移栽后
前12 d要保持没有直射光、湿度80%～90%的环境条件。移
栽试验重复2次，移栽株数分别为450株和620株。
2 结果与分析
2. 1 不同生长素对子叶、下胚轴愈伤组织诱导的
影响
接种培养50 d统计，结果见表1。由表1可知，在附加
不同浓度IBA的培养基上，难以诱导培养出愈伤组织。在
附加不同浓度2, 4- D的培养基上，2种材料均可诱导培养出
愈伤组织，而且以下胚轴的诱导效果好。其中在2, 4- D的
浓度为1. 8 mg/ L时诱导培养的效果最好，不仅诱导率为
89%、愈伤组织长得大，而且愈伤组织外观上长势旺盛。
观察还表明，在2, 4- D的浓度为1. 8 mg/ L的培养基上，培
养7 d可见开始生长出愈伤组织，之后，随着愈伤组织生长
率的增加、先形成愈伤组织的不断生长，所形成的愈伤组
织也由浅绿色逐渐变成嫩绿色。把在这一培养基上诱导培
养的愈伤组织接种到同一培养基上，进行愈伤组织的增殖继
代培养。3次重复试验，每次增殖继代培养4代的结果证明，
增殖继代培养45 d，就可以增殖培养出一代与用下胚轴诱导
培养50 d一致的愈伤组织。3次重复试验结果基本一致。以
上结果说明：MS+KT 0. 4 mg/ L+2, 4- D 1. 8 mg/ L培养
基是石龙芮毛茛下胚轴愈伤组织诱导培养和增殖继代培养
的理想培养基。
2. 2 不同培养基对愈伤组织分化培养的影响
接种培养55 d时观察统计，结果见表2。由表2可知，
在培养基中附加生长素NAA 0. 3 mg/ L时，培养的愈伤组
织不分化，而在不加生长素的LS 0和White 0培养基上愈
伤组织也不能分化。在不附加生长素的MS 0、1/ 2 MS 0、
1/ 4 MS 0 3种培养基上，所培养的愈伤组织均能分化出不
定芽。其中以MS 0为培养基时分化效果最好，不仅分化率
为92%、平均每块愈伤组织能分化出4. 4个不定芽，而且所
分化的不定芽长势旺盛。观察还表明，接种到MS 0培养
基上的愈伤组织，接种后19 d可见开始分化出不定芽，随
后，随着分化率的增加，先分化不定芽的生长，在先分化
的不定芽基部又会分化出多个不定芽，使分化的不定芽呈
丛生状。培养55 d时，分化的丛生不定芽就会生长为高
0. 6～1. 6 cm、具有4～9个叶片、茎粗0. 2 cm左右、由
3～7个不定芽组成的丛生不定芽，并且丛生不定芽外观上
生长旺盛。2次重复试验结果基本一致。以上结果说明：
MS 0这种培养基是石龙芮毛茛愈伤组织分化培养的理想
培养基。
2. 3 不同培养基、不同处理方法对不定芽生根培养
的影响
接种培养30 d观察统计，结果见表3。由表3可知，不
论采用哪种方法对不定芽进行处理，培养基中不附加浓度
为0. 3 mg/ L的IAA，不定芽都不能生根生长为试管苗；而
采用方法1，对不定芽不进行处理，即使培养基中附加浓度
为0. 3 mg/ L的IAA，也不能生根生长为试管苗；采用方
法2和方法3对不定芽进行处理，在培养基中附加浓度为
0. 3 mg/ L的IAA，均能使不定芽生根生长为试管苗。其中
采用方法3对不定芽进行处理，在1/ 3 MS+ IAA 0. 3 mg/ L
这种培养基上生根效果最好，不仅生根率为95%、平均每
株试管苗生根5. 9条，而且外观上试管苗生长旺盛。观察还
表明，采用方法 3对不定芽进行处理后，接种到 1/ 3
MS+ IAA 0. 3 mg/ L培养基上，培养4 d可见下部切口边缘
长出新根。随后，根长快速增长，根数不断增加，并且根
色洁白。培养到30 d时，不定芽就会生根生长为旺盛的试
管苗。把在1/ 3 MS+ IAA 0. 3 mg/ 培养基上生根培养的试
管苗剪成长1. 0～2. 0 cm、至少具有2个叶片的茎段后，接
种到相同的培养基上进行生根继代增殖培养。2次重复试
验，每次继代增殖培养7代。结果证明：28 d为1个继代培
养周期，就会培养出1代生长非常旺盛的试管苗，平均每1代
的繁殖系数为2. 7。按照这个速度，1株试管苗每年能繁殖
出2. 713(约为40万)株试管苗。除掉各种不利因素的影响，每
生长素(mg/ L)
0
IBA 0. 6
IBA 1. 2
IBA 1. 8
IBA 2. 4
IBA 3. 0
2, 4- D 0. 6
2, 4- D 1. 2
2, 4- D 1. 8
2, 4- D 2. 4
2, 4- D 3. 0
下胚轴
愈伤组织
诱导率(%)
0
0
0
8
5
0
26
64
89
71
73
表1 不同生长素对子叶、下胚轴愈伤组织诱导的影响
愈伤组织
长势
-
-
-
+
+
0
+
++
++
+
+
子叶
愈伤组织
诱导率(%)
0
0
6
0
0
0
17
24
66
61
31
愈伤组织
长势
-
-
+
-
-
0
+
+
+
+
+
注：++为长势好；+为长势一般；- 为不生长，下同。
培养基
(mg/ L)
0
MS 0
MS+NAA 0. 3
1/ 2 MS 0
1/ 2 MS+NAA 0. 3 mg/ L
1/ 4 MS 0
1/ 4 MS+NAA 0. 3
LS 0
LS+NAA 0. 3
White 0
White+NAA 0. 3
分化率
(%)
0
92
0
71
0
39
0
0
0
0
0
分化芽
长势
-
++
-
++
-
+
-
-
-
-
-
表2 不同培养基对愈伤组织分化培养的影响
平均分化不定芽数
(个/ 块)
0
4. 4
0
3. 8
0
2. 6
0
0
0
0
0
25
CHINESE HORTICULTURE ABSTRACTS
株试管苗每年完全能保证繁殖出20万株试管苗。这种繁殖
速度可满足保护野生资源、实现人工栽培的需要。以上结
果证明：采用向培养瓶中加入约5 ml 2 mg/ L的NAA溶
液处理24 h，再把不定芽切下接种到1/ 3 MS+ IAA 0. 3 mg/ L
培养基的方法，是石龙芮毛茛不定芽生根培养和生根继代
培增殖培养的理想方法。由这种方法所培养的试管苗是由
下胚轴愈伤组织分化的不定芽，经过生根培养形成的。至
此，该研究已经建立起石龙芮毛茛的再生体系。
2. 4 试管苗的移栽、定植及长势观察
移栽30 d统计，2次移栽共成活897株，平均成活率为
83. 8%。定植40 d后统计，3次定植共成活721株，平均成
活率为92. 4%。试管苗易移栽、定植成活。定植成活的试
管苗50 d进入旺盛生长期，后期群体长势旺盛整齐。8月上
旬开花，当年果实成熟，并保持了石龙芮毛茛的所有植物
学性状。
3 结论与讨论
通过该研究培养的定植试管苗，不仅繁殖速度快、生
长旺盛，而且保持了野生石龙芮毛茛所有的植物学性状。
这说明该研究所建立的再生体系技术为野生资源的保护、
实现人工栽培和基因库的建立奠定了技术基础。
愈伤组织的分化培养，是植物组织培养研究的重要过
程。前人的研究一般都认为，在愈伤组织的分化培养中，
所使用的培养基都要附加植物生长调节剂[12, 13]，但在该研究
的愈伤组织分化培养中，却出现了在不加任何植物生长调
节剂的MS 0培养基为理想培养基的结果。由此，似乎说明
石龙芮毛茛愈伤组织分化不需要植物生长调节剂，实际并
非如此。产生这种现象不是因为石龙芮毛茛的愈伤组织分
化不需要这类物质，而是由于以下途径已经为愈伤组织提
供了足以达到促进分化程度的植物生长调节剂：(1)在愈伤
组织培养的培养基中，已经加入较高浓度的人工合成植物
生长调节剂(人工合成植物生长调节剂化学性质稳定，不易
很快分解丧失功能)，在对愈伤组织进行分化培养中，其自
身残留的植物生长调节剂仍发挥着后效作用；(2)由于该研
究所培养的愈伤组织生长非常旺盛，在其生长过程中自身
也能合成一定植物生长调节剂，这种由自身形成的植物生
长调节剂也会促进愈伤组织的分化。
参考文献：
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京:科学出版社,1972.
[2] 韩全忠,王正兴.大连地区植物志(上册)[M].大连:大连理工大
学出版社,1993.
[3] 李书心.辽宁植物志(上册)[M].沈阳:辽宁科学技术出版社,
1988.
[4] 陈冀胜,郑硕.中国有毒植物[M].北京:科学出版社,1987.
[5] 南京中医药大学.中药大辞典(上册)[M].上海:上海科学技术
出版社,2006.
[6] 张蕾蕾,李玮,赵娜等.穿龙薯蓣嫩茎高效无性系建立的研究
[J].江西科学,2009,27(3):396-400.
[7] 杨贺,梁鑫鑫,翟冠雄等.穿龙薯蓣嫩茎高效无性系建立的研究
[J].江西科学,2011,29(3):324-327.
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2010,29(2):324-327.
[9] 吴侠,张鑫,王亚芬等.浮毛茛组织培养与植株再生[J].植物生
理学通讯,2007,43(5):889-890.
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2010,(8):161-163.
[11] 文国琴,何道文,何震.毛茛组织培养与植株再生[J].亚热带
植物科学,2006,35(4):63.
[12] 安利佳,姜长阳.植物组织培养导论[M].大连:辽宁师范大学
出版社,1996.
[13] 巩振辉,申书兴.植物组织培养[M].北京:化学工业出版社,
2007.
培养基(mg/ L)
1/ 2 MS 0
1/ 2 MS 0
1/ 2 MS 0
1/ 3 MS 0
1/ 3 MS 0
1/ 3 MS 0
White 0
White 0
White 0
1/ 2 MS+ IAA 0. 3
1/ 2 MS+ IAA 0. 3
1/ 2 MS+ IAA 0. 3
1/ 3 MS+ IAA 0. 3
1/ 3 MS+ IAA 0. 3
1/ 3 MS+ IAA 0. 3
White+ IAA 0. 3
White+ IAA 0. 3
White+ IAA 0. 3
处理方法
方法1
方法2
方法3
方法1
方法2
方法3
方法1
方法2
方法3
方法1
方法2
方法3
方法1
方法2
方法3
方法1
方法2
方法3
平均生根数(条/ 株)
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
5. 1
2. 8
0
5. 9
3. 4
0
3. 1
2. 3
表3 不同培养基、不同处理方法对不定芽生根培养的影响
生根率(%)
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
79
54
0
95
58
0
68
45
试管苗长势
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
++
+
-
++
+
-
+
+
（下转31页）
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中国园艺文摘 2012年第6期
The study on callus inducement and establishment of
regeneration clone of Ranunculus sceleratus
LI Jie, JIANG Peng, WU Li-wei, ZHANG Dong-yan, JIANG Chang-yang
Abstract: In order to preserve the wild resources and achieve planting, hypocotyls of Ranunculus sceleratus were used as material to
do the research on callus inducement and differentiation, differentiation of adventitious buds, rooting and rooting multiplication of tube
seedlings, transplantation and stable planting of tube seedlings, then the regeneration clone of Ranunculus sceleratus with hypocotyls
was established. The results showed that the ideal medium for callus inducing and callus multiplication was MS+KT 0.4 mg/L+2,4-D
1.8 mg/L; MS 0 was the best medium for callus differentiation; cultivated in the mediums 1/3MS+ IAA0.3 mg/L after the adventitious
buds disposed 24 hours with 5 ml NAA2 mg/L was the best method for rooting of adventitious buds and rooting multiplication. The
rate of transplantation and stable planting of tube seedlings were high, and the tube seedlings stable planted maintained all botany
characteristics of the Ranunculus sceleratus.
Key words: Ranunculus sceleratus; Callus; Regeneration clone
著的影响，达到显著的差异。
根系长度，A2B3组合达最高，为2. 425 cm(见表4)，根
系条数亦达最高，为8. 68条(见表5)；生根率也达最高，为
97. 225%(见表6)。A、B两因素对根系长度、条数、生根率
的影响均达极显著差异。
另外，在较低的NAA浓度下，随BA浓度的增加试管
苗由浓绿变成黄绿；在高的BA浓度下腋芽丛生化；随
NAA浓度的增大，愈伤组织的生长量增加，从而影响试管
苗的生长。
3 结论与讨论
(1)试验对单个的NAA和BA激素因子对试管苗的生长
影响进行考察，同时也对互作进行调查，进行数据收集整
理，方差分析SSR检测。(2)洋桔梗组织培养快速繁殖，可
在高BA浓度、低NAA浓度下进行芽的增殖，以提高繁殖
率。在低的BA、NAA浓度下，可使试管苗生根，如1/ 2
MS+BA 1. 5 mg/ L+NAA 0. 01 mg/ L培养基上达到扩
繁，在1/ 2 MS+BA 0. 01 mg/ L+NAA 0. 01 mg/ L培养
基上生根。(3)试验没有进行第60天的生长状况调查，也没
有进行第15天，第45天生长状况的数据分析，可能还存在
着对快速繁殖有利的结果，有待进一步完善。(4)试验是在
BA和NAA浓度大范围下，生长动态的摸索。只是该品种
的试验结果，对不同的品种应有所变化，以待进一步提高
繁殖率。
处理
A2B3
A1B1
A1B3
A1B2
A2B1
A2B2
A3B1
A3B2
A3B3
转换平均数
2. 42
1. 9
1. 77
1. 67
0. 4
0. 2
0
0
0
差异显著性
表4 根系长度SSR检验
5%
a
ab
b
b
c
c
c
c
c
1%
A
A
A
A
B
B
B
B
B
处理
A2B3
A1B1
A1B3
A1B2
A2B1
A2B2
A3B1
A3B2
A3B3
平均数
8. 67
6. 4
4. 22
3. 72
2. 9
0. 37
0
0
0
差异显著性
表5 根系条数SSR检验
5%
a
b
c
c
c
d
d
d
d
1%
A
AB
BC
C
C
D
D
D
D
处理
A2B3
A1B1
A1B3
A1B2
A2B1
A2B2
A3B1
A3B2
A3B3
转换
平均数
97. 22
69. 45
66. 7
55. 57
30. 52
13. 87
0
0
0
差异显著性
反转换平均数
98. 41
87. 67
84. 35
68. 04
25. 79
5. 75
0
0
0
表6 生根率SSR检验
5%
a
b
b
b
c
d
d
d
d
1%
A
B
B
B
C
CD
D
D
D
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