全 文 ：云南榧内生菌的分离及抗植物病原菌活性筛选
*
马长乐，黄晓霞，艾星梅，杨 蕊，周其茸，胥 辉
(西南林业大学 园林学院，云南 昆明 650224)
摘要:采用内生菌常规分离法从云南榧的新鲜茎与叶中分离得到 10 株内生真菌和 5 株内生放线菌，通过滤纸片
扩散法研究了内生菌对小麦雪腐病菌、辣椒炭疽病菌、三七丝核病菌等 10 种植物病害病原真菌的抑菌活性。结
果显示，云南榧内生真菌粗提物对 10 种植物病原真菌具有较广泛的抑制作用，其中，菌株 TY3 对棉花枯萎病菌
具有较强的抑菌活性;菌株 TY7 对辣椒炭疽病菌、三七丝核病菌及番茄灰霉病菌具有较强的抑菌活性。5 株内
生放线菌中，菌株 FTY1、FTY5、FTY7 无抑菌活性，而菌株 FTY2 对 10 株植物病原真菌均表现出了较强的抑菌
活性，FTY6 对辣椒炭疽病菌、棉花枯萎病菌、梨黑星病菌表现出了很强抑菌活性。该实验结果为云南榧内生菌
的进一步开发利用奠定了基础。
关键词:云南榧;内生菌;抗菌活性;滤纸片扩散法
中图分类号:S 763 文献标识码:A 文章编号:1672 － 8246 (2014)04 － 0010 － 05
Endophytes Isolation of Torreya yunnanensis and
Antimicrobial Activity Screening
MA Chang-le，HUANG Xiao-xia，AI Xing-mei，YANG Ｒui，ZHOU Qi-rong，XU Hui
(Faculty of Landscape Architecture，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，P. Ｒ. China)
Abstract:10 strains of endophytic fungi and 5 strains of endophytic actinomycetes were isolated from fresh stems
and leaves of Torreya yunnanensis in this research． Antimicrobial activities of these endophytes on ten important
plant pathogenic fungi were studied through filter diffusion method． Ｒesults showed that crude extracts of endophyt-
ic fungi had broader inhibitory effects on ten important plant pathogenic fungi． Among them，TY3 exhibited strong
antimicrobial activity on Fusarium oxysporium sp. vasinfectum，and TY7 exhibited strong antimicrobial activity on
Colletotrichum capsici，Verticillium cinnabarium and Botrytis cinerea． Endophytic actinomycetes FTY1，FTY5，
FTY7 exhibited no antimicrobial activity，wherever FTY2 showed strong antimicrobial activity on ten plant patho-
genic fungi and FTY6 showed very strong antimicrobial activity on Colletotrichum capsici，Fusarium oxysporium
sp. vasinfectum and Venturia pyrina． Ｒesults of this study laid a foundation for the further utilization of Torreya yun-
nanensis and its endophytes．
Key words:Torreya yunnanensis;endophyte;antimicrobial activity;filter diffusion method
云南榧 (Torreya yunnanensis)属于红豆杉科
(Taxaceae)榧树属 (Torreya)的珍稀濒危物种，
主要分布于云南西北部的丽江、维西、贡山、中甸
等地。在我国，榧树属植物均已被列为国家二级保
护植物［1 ～ 2］。近年来受利益驱使，云南等地野生榧
树为不法分子盗伐的报道屡见不鲜，加之毁林开荒
第 43 卷 第 4 期
2014 年 8 月
西 部 林 业 科 学
Journal of West China Forestry Science
Vol. 43 No. 4
Aug. 2014
* 收稿日期:2014 － 05 － 11
基金项目:国家自然科学基金项目 (31360037)，国家林业局公益性科研专题项目 (200904045) ，西南林业大学校重点基金项目资助。
第一作者简介:马长乐 (1976 －)，男，新疆昌吉人，副教授，博士，主要从事生物多样性保护研究。
通讯作者简介:胥 辉 (1960 －)，男，四川盐亭人，教授，博士，主要从事森林经理学相关研究。
种地，以及掠夺性的人工采摘果实，使原本自然分
布范围有限的野生榧树分布区面积缩小，种群数量
锐减，濒危形势进一步加剧［3 ～ 4］。
植物内生菌是一种新的微生物资源，由于宿主
植物不同，其所处的生态环境具有多样性，因而其
次生代谢产物也具有丰富的多样性，能够为天然药
物研究提供丰富的潜在资源［5］。内生菌宿主植物
的选择主要集中在以下两方面:一是特殊生境植
物，二是各种药用植物。1993 年 Stierle［6］首次从短
叶红豆杉 (Taxus breviflia)中分离得到 1 株能合成
抗癌物质紫杉醇的内生真菌，这一发现掀起了从药
用植物中分离内生菌的热潮，为人类解决某些药用
植物生长缓慢、资源紧缺等因素带来的药源紧张和
生态破坏问题提供了新的思路。
由于榧树具有产生紫杉醇的能力，具有多种药
用价值，并且国内外对榧树内生菌的研究较
少［7 ～ 9］，因此，本研究从云南榧中分离内生菌，并
对分离得到的内生菌进行初步抗菌活性筛选，以期
获得具有生产研究价值的菌株，为活性成分的分离
鉴定及榧树自然资源的保护奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
1. 1. 1 植物材料
于 2012 年 9 月在云南省迪庆州维西县 (海拔
2 190 m)的云南榧天然林，采集新鲜枝条置于冰
盒内保存，带回实验室后立即开展云南榧内生菌分
离工作。
1. 1. 2 供试菌种
小麦雪腐病菌 (Typhla incarnata)、辣椒炭疽
病菌 (Colletotrichum capsici)、三七丝核病菌 (Ver-
ticillium cinnabarium)、黄瓜枯萎病菌 (Fusarium
oxysporium sp. cucumebrium)、棉 花 枯 萎 病 菌
(F. oxysporium sp. vasinfectum)、辣 椒 镰 刀 病 菌
(F. solani)、番茄灰霉病菌 (Botrytis cinerea)、梨
黑星病菌 (Venturia pyrina)、白菜黑斑病菌 (Alter-
naria brassicae)、水 稻 稻 瘟 病 菌 (Magnaporthe
grisea)10 种常见植物病害病原真菌由西南林业大
学生命科学学院生物化学实验室提供。
1. 1. 3 供试培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)［10］，高氏一
号培养基［10］。
1. 2 内生真菌和内生放线菌的分离纯化
1. 2. 1 植物材料表面消毒［11］
选用无可见病斑、健康的新鲜茎和叶两部分，
用自来水洗净其表面的灰尘，用刀横切成 0. 5 cm
长的小块，于 75 %酒精中浸泡 5 min 后，用无菌
水冲洗 3 ～ 4 次，再用 0. 1 %的升汞漂洗 30 s 后用
无菌水冲洗 5 次。同时将最后一次冲洗的无菌水分
别取 0. 5 mL 涂布于上述两种培养基上，每种培养
基设 3 个重复。于 28℃下培养 5 ～ 8 天，作为对照
判断表面消毒是否彻底。
1. 2. 2 内生真菌的分离及纯化［12］
取表面消毒后的茎和叶片，用灭菌的解剖刀将
茎剖开，用灭菌的镊子将叶片和靠内侧的茎面贴在
PDA培养基上，每皿均匀摆放 6 块，接种 10 皿，
于 28℃培养 5 ～ 8 天后，采用平板划线法纯化长出
的真菌菌落。
1. 2. 3 内生放线菌的分离及纯化［13］
取 1 g表面消毒后的样品，加 10 mL无菌水碾
碎静置 15 min后，用灭菌枪头分别吸取 200 μL 研
磨液涂在加有 50 mg /mL重铬酸钾的高氏一号培养
基平板上，接种 10 皿，于 28℃培养 5 ～ 8 天后，
采用平板划线法纯化长出的放线菌菌落。
1. 3 内生菌抗植物病原菌活性筛选
活性菌株初筛采用滤纸片扩散法［14］。菌株培
养 2 ～ 3 天后，测量并记录出现的抑菌圈大小及亮
度，根据抑菌圈大小和亮度筛选出活性菌株。
2 结果与分析
2. 1 云南榧内生菌的分离纯化
本次实验从云南榧的茎和叶中共分离得到 10
株内生真菌 (编号为 TY2、TY3、TY4、 TY5、
TY6、TY7、TY8、TY9、TY11、TY12)和 5 株内
生放线菌 (编号为 FTY1、FTY2、FTY5、FTY6、
FTY7)。
2. 2 内生真菌的抑菌活性
通过滤纸片法测定了 10 株内生真菌对 10 种植
物病原真菌的抑菌活性，实验结果见表 1。
11第 4 期 马长乐等:云南榧内生菌的分离及抗植物病原菌活性筛选
表 1 10 株内生真菌对 10 种植物病原真菌的抑制作用
Tab. 1 Inhibitory effects of endophytic fungi on 10 plant pathogenic fungi
菌株
编号
小麦雪腐病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
辣椒炭疽病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
三七丝核病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
黄瓜枯萎病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
棉花枯萎病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
TY2 0. 88 + 0. 7 + － － － － － －
TY3 0. 7 + 1. 13 + + + 1. 83 + + + 0. 93 + + + 2. 23 + + +
TY4 0. 93 + 0. 73 + 0. 7 + 0. 7 + 1. 17 +
TY5 1. 0 + 0. 93 － 0. 6 － 1. 08 + + 0. 95 +
TY6 0. 98 + 0. 9 + + 0. 98 + + 1. 03 + + + 0. 98 + +
TY7 1. 05 + + 2. 73 + + + 2. 4 + + + 1. 1 + + + 1. 27 + +
TY8 1. 0 + + 0. 83 + + 1. 1 + + + 0. 8 + 0. 75 + +
TY9 1. 08 + 0. 93 － － － － － 0. 88 +
TY11 1. 15 + + 0. 85 + 1. 0 + + 0. 7 + 0. 7 + +
TY12 － － 0. 63 + 0. 83 + － － 0. 83 +
CK － － － － － － － － － －
菌株
编号
辣椒镰刀病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
番茄灰霉病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
梨黑星病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
白菜黑斑病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
水稻稻瘟病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
TY2 － － － － － － － － － －
TY3 0. 75 + + + 1. 25 + + + 1. 18 + + + － － 1. 03 + + +
TY4 0. 9 + － + － － － － － －
TY5 0. 95 － 1. 38 － 1. 05 + + － － 1. 1 + +
TY6 0. 93 + + 0. 95 + + 0. 98 + + 1. 23 + + + 1. 08 + + +
TY7 1. 05 + + + 2. 85 + + + 1. 18 + + + 1. 55 + + + 1. 1 + + +
TY8 1. 08 + + 0. 95 + + + 0. 78 + 0. 9 + + + 0. 83 +
TY9 1. 05 － 0. 95 － － － － － － －
TY11 1. 75 + + + 0. 78 + 0. 98 + 0. 9 + 0. 7 +
TY12 0. 75 + 0. 93 + － － 0. 9 + 0. 83 +
CK － － － － － － － － － －
注:①以上抑菌圈直径长度不包含直径为 0. 6 cm的滤纸片的长度。 －表示没有明显的抑菌圈，表 2 同。②抑菌圈亮度: + 表示抑菌圈不透
明， + + 表示抑菌圈部分透明， + + + 表示抑菌圈完全透明，表 2 同。③抑菌圈直径单位为 cm，表 2 同。④小麦雪腐病菌 (Typhla incar-
nata)、辣椒炭疽病菌 (Colletotrichum capsici)、三七丝核病菌 (Verticillium cinnabarium)、黄瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporium
sp. cucumebrium)、棉花枯萎病菌 (Fusarium oxysporium sp. vasinfectum)、辣椒镰刀病菌 (Fusarium solani)、番茄灰霉病菌 (Botrytis cinerea)、
梨黑星病菌 (Venturia pyrina)、白菜黑斑病菌 (Alternaria brassicae)、水稻稻瘟病菌 (Magnaporthe grisea)。
从表 1 中可以看出 10 株内生真菌粗提物对 10
种植物病原真菌具有较广泛的抑制作用 (抑菌圈
直径 ＞ 2 cm为强抑菌能力，1 ～ 2 cm 为中等抑菌
能力， ＜ 1 cm 为弱抑菌能力)。其中，菌株 TY6、
TY7、TY8 对 10 种植物病原真菌均具有抗菌活性。
菌株 TY3 对棉花枯萎病菌具有较强的抑菌活性;
菌株 TY7 分别对辣椒炭疽病菌、三七丝核病菌及
番茄灰霉病菌具有较强的抑菌活性，抑菌圈的直径
均大于 2 cm，且抑菌圈透明。
2. 3 内生放线菌的抑菌活性
通过滤纸片法测定了 5 株内生放线菌对 10 株
植物病原真菌的抑菌活性，实验结果见表 2。
从表 2 中可以看出菌株 FTY2 对 10 株植物病
原真菌均表现出了一定的抑菌活性，抑菌圈的直径
均大于 1 cm，且大多数抑菌圈透明;FTY6 对辣椒
炭疽病菌、棉花枯萎病菌、梨黑星病菌表现出了很
强的抑菌活性，抑菌圈的直径均接近或大于 4 cm，
但是抑菌圈透明度没有 FTY2 高;而放线菌 FTY1、
FTY5、FTY7 均未对 10 株植物病原真菌表现出抑
菌活性。图 1 显示了 5 株放线菌对部分植物病原真
菌抑菌活性。
21 西 部 林 业 科 学 2014 年
表 2 5 株内生放线菌对 10 种植物病原真菌的抑制作用
Tab. 2 Inhibitory effects of endophytic actinomycetes on 10 plant pathogenic fungi
菌株
编号
小麦雪腐病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
辣椒炭疽病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
三七丝核病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
黄瓜枯萎病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
棉花枯萎病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
FTY1 － － － － － － － － － －
FTY2 4. 10 + + + 2. 65 + + 1. 53 + + 1. 30 － 3. 45 + +
FTY5 － － － － － － － － － －
FTY6 － － 4. 90 + － － － － 4. 55 +
FTY7 － － － － － － － － － －
CK － － － － － － － － － －
菌株
编号
辣椒镰刀病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
番茄灰霉病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
梨黑星病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
白菜黑斑病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
水稻稻瘟病菌
抑菌圈
/cm
抑菌圈
亮度
FTY1 － － － － － － － － － －
FTY2 1. 35 + + + 1. 15 + + + 3. 25 + + 1. 35 + + + 2. 90 + +
FTY5 － － － － － － － － － －
FTY6 － － － － 3. 95 + － － － －
FTY7 － － － － － － － － － －
CK － － － － － － － － － －
A B C
图 1 放线菌提取物对 3 种植物病原真菌抑菌效果
注:A为小麦雪腐病菌，B为辣椒炭疽病菌，C为梨黑星病菌
Fig. 1 Inhibitory effects of endophytic actinomycetes crude extracts on Typhla incarnata，Colletotrichum capsici and Venturia pyrina
3 结语
本次研究从云南榧中分离得到 10 株内生真菌
和 5 株内生放线菌，通过滤纸片扩散法从中筛选出
了具有较强抗植物病原真菌活性的内生真菌 (TY3
和 TY7)以及内生放线菌 (FTY2 和 FTY6)。
近年来已经有研究从数十种药用植物中分离到
了内生菌，并从这些药用植物内生菌中分离得到了
和宿主植物相同或相似的活性成分。如从长春花
(Catharanthus roseus)内生真菌中分离得到长春新
碱类似物［12］、从德国鸢尾 (Iris germanica)内生
真菌中分离得到鸢尾酮［15］。本研究从药用植物云
南榧中分离内生菌，不仅可能得到产紫杉醇的内生
菌，还能从中得到具有药用价值的内生菌，通过药
用植物内生菌的研究可解决其自然资源不足的问
题，开发紧缺及新型药物，为榧树资源的开发利用
及保护提供新的思路。
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41 西 部 林 业 科 学 2014 年