全 文 ：文章编号:0439-8114(2004)01-0065-04
台湾青枣组织培养的消毒方法
任敬民 , 陈跃进 , 郭丽明
(佛山科学技术学院生命科学学院园艺系 ,广东 佛山　528231)
摘要:为了确立台湾青枣组织培养的消毒方法 , 研究了多菌灵 、酒精 、升汞和吐温 20 这 4 种消毒剂对台
湾青枣组织培养的消毒效果和对其愈伤组织生长的影响。结果表明:提前 5 d 喷 600 倍液多菌灵 , 能明
显减少污染率;经 30 s75%酒精消毒后 ,再用 0.1%升汞加 3～ 5 滴吐温 20消毒 5 min ,既能减少污染 , 又
能促进外植体愈伤组织生长。
关键词:台湾青枣;组织培养;消毒方法
中图分类号:S677.9;Q813.1+2　　文献标识码:B
　　台湾青枣是台湾省选育的单果重 50 g 以上的
毛叶枣(Zizyphus mauritiana)优良品种 。大陆
1998年引种成功 ,其具有投产快 、丰产稳产 、易于栽
培管理 、营养丰富 、品质好等优点 ,是一种开发前景
极广的热带珍稀水果[ 1 , 2] 。台湾青枣种苗可用播
种 、嫁接 、扦插等方式繁殖[ 3] ;但扦插生根非常困
难 ,种子播种成苗率低 ,嫁接育苗繁殖系数不高 ,苗
木远远不能满足生产上的需要 。组织培养可能是台
湾青枣苗木快速繁殖的有效途径[ 4 , 5] ,但台湾青枣
外植体由于表面毛很多 ,采用一般的消毒方法消毒
效果很不理想 ,有的消毒方法外植体污染率高 ,有的
虽然污染少 ,但对外植体的生长有严重的抑制作用 ,
甚至杀死外植体而不能产生愈伤组织 。目前 ,有关
枣树组织培养外植体消毒研究很少 ,而有关毛叶枣
的组织培养消毒的报道则更少 。外植体的表面消毒
是组织培养的重要环节 ,为了选择合适的表面消毒
方法 ,我们进行了台湾青枣组织培养的消毒方法试
验 ,现将结果报告如下。
1　材料和方法
1.1　材料
供试品种为台湾青枣早熟品种 。培养基为
MS ,添加物有玉米素(ZT)、水解乳蛋白(LH)、蔗糖
和卡拉胶;消毒剂有 600 倍液的多菌灵 、75%酒精 、
0.1%升汞和吐温 20。
1.2　试验设计
1.2.1　多菌灵处理　选择生长旺盛的枝条 ,在晴天
进行全方位均匀的喷洒多菌灵溶液 ,用药量为枝叶
上有水珠而不落下 ,待喷药的枝条无水滴后 ,用预先
经 75%酒精消毒的塑料薄膜袋套袋 ,以不套袋的作
对照 ,分别在喷药后 3 d 、5 d 、8 d剪取幼嫩的茎段和
叶片进行试验 。所用的茎段和叶片都分别用 75%
酒精消毒 30 s , 0.1%升汞加 3 ～ 5滴的吐温 20 消毒
5 min。共 12个处理 ,重复 4次 ,计 48瓶 ,各处理情
况详见表 1。
1.2.2　酒精和升汞处理　75%酒精处理分0 s 、30 s
表 1　多菌灵处理设计
处理 取样时间/ d(喷药后天数) 套袋情况 外植体类型 处理
取样时间/ d
(喷药后天数) 套袋情况 外植体类型
A 1 8 套 叶 G 1 8 不套 叶
B1 5 套 叶 H1 5 不套 叶
C1 3 套 叶 I1 3 不套 叶
D 1 8 套 茎 J1 8 不套 茎
E1 5 套 茎 K1 5 不套 茎
F1 3 套 茎 L1 3 不套 茎
收稿日期:2003-08-28
作者简介:任敬民(1966～ ),男 ,湖南汨罗人 ,在读硕士生,讲师.
65湖北农业科学　HUBEI　AGRICULTURAL　SCIENCES　No.1 ,2004
DOI :10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2004.01.023
和60 s3种 ,0.1%升汞处理分 3 min 、5 min 、7 min3
种 ,还有升汞两段消毒的 3种(1.5 min+2 min 、2.5
min+3 min 和 4.5 min+3 min),升汞 1.5 min+2
min处理表示先用升汞处理 1.5 min ,然后用无菌水
冲洗 1 ～ 2次 ,再用升汞处理2 min;同理做余下 2个
处理试验。在试验的消毒过程中 ,用 0.1%升汞进
行处理幼嫩的茎段和叶片时 ,都分别加上 3 ～ 5滴的
吐温 20 进行消毒处理。24个处理 ,重复 5 次 ,共
120瓶 。各处理情况详见表 2。
1.2.3　加吐温 20处理　加吐温 20分 4个处理 ,重
复 5次 ,共 20瓶。各处理情况详见表 3 。
表 2　酒精和升汞处理设计
处理 酒精消毒时间/ s
升汞消毒时间
/min 外植体类型 处理
酒精消毒时间
/ s
升汞消毒时间
/min 外植体类型
A 2 0 3 叶 M 2 0 3 茎
B2 0 5 叶 N 2 0 5 茎
C2 0 7 叶 O2 0 7 茎
D 2 30 3 叶 P2 30 3 茎
E2 30 5 叶 Q 2 30 5 茎
F2 30 7 叶 R2 30 7 茎
G 2 60 3 叶 S 2 60 3 茎
H2 60 5 叶 T2 60 5 茎
I2 60 7 叶 U 2 60 7 茎
J2 30 1.5+2 叶 V 2 30 1.5+2 茎
K 2 30 2.5+3 叶 W2 30 2.5+3 茎
L2 30 4.5+3 叶 X2 30 4.5+3 茎
表 3　加吐温 20处理设计
处理 吐温 20 酒精消毒
30 s
升汞消毒
5 min
外植体类型
A 3 加 有 有 叶
B3 加 有 有 茎
C3 不加 有 有 叶
D 3 不加 有 有 茎
1.2.4　不同外植体处理设计　台湾青枣幼嫩的茎
段 、茎尖 、叶片 、叶柄和幼果等材料用 75%酒精处理
30 s , 0.1%升汞+3 ～ 5滴吐温 20消毒 5 min 。各处
理重复 5次 ,共 25瓶 。
1.3　试验过程 、指标和统计分析方法
试验选用长势旺盛而且健康的植株 ,先用洗洁
精稀释溶液浸泡外植体 1 min 左右后 ,用自来水清
洗多次 ,在无菌的环境下消毒 ,用无菌水反复冲洗 3
～ 4次后进行切片(段),最后接种 。接种后均置于
培养室培养 。培养期间 ,每天观察其生长和污染情
况 ,计算其污染率 , 60 d 后统计愈伤组织增重量 。
接种时各类型外植体剪成不同规格 ,叶片为 0.5 cm
×0.5 cm 、茎段 1.0 cm 、叶柄 0.8 cm 、茎尖 1.0 cm 、
幼果 0.5cm×1.0 cm 。每瓶处理共放 4个小段 ,培
养温度26℃±1℃,光照度2 400 1x ,光照时间 12 h·
d-1 。基本培养基 配方是 MS +1 mg·L-1ZT +
100mg·L-1LH+蔗糖+卡拉胶 。
试验指标:污染率为第一指标 ,愈伤组织增重量
为第二指标 。
统计分析方法:本试验数据采用 8.1 版本 SAS
统计分析软件进行统计分析[ 6] 。
2　结果分析
2.1　多菌灵的影响
2.1.1　套袋与污染率　试验中 ,套袋和不套袋的分
别调查 30 瓶 , 结果是套袋的污染 4 瓶 , 污染率
13.3%;不套袋污染 7瓶 ,污染率 23.3%。
2.1.2　喷药时间对叶片愈伤组织增重的影响　在
多菌灵试验中 ,喷药时间对叶片愈伤组织增重的影
响情况如表 4。可见 ,在叶片不同处理中 ,套袋的和
不套袋的都是提前 5 d喷药的叶片愈伤组织增重量
大 。且同一时间喷药 ,不套袋的比套袋的叶片愈伤
组织增重量大 。方差分析(以下的方差分析均用原
始数据进行单因素试验分析)表明 ,各处理间愈伤组
织增重量差异显著(F=3.35 , F0.05=2.62);进一步
用 LSD 法在显著差异水平下(以下的多重比较均
用 LSD 法和 5%的显著差异水平比较)进行各处理
间愈伤组织增重量差异显著性多重比较(表 4)。结
果表明 ,处理 H1(提前 5 d喷药 、不套袋)的叶片愈
伤组织增重量最大 ,达 2.80 g ,与处理 I1 无显著差
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异 ,而与其他 4种处理差异显著。
表 4　不同处理的叶片愈伤组织重量比较
处理 愈伤组织重量/ g
8 d 5 d 3 d
套袋 A 11.28 d B12.09 bc C 11.86 cd
不套袋 G12.13 bc H12.80 a I12.71 ab
2.1.3　喷药时间对茎段愈伤组织增重的影响　喷
药时间对茎段愈伤组织增重的影响情况如表 5 ,方
差分析表明 , 不同茎段处理间差异不显著(F =
1.34 ,F 0.05=2.62);进一步的各处理间的多重比较
也说明各处理间差异不显著。表明喷药时间和套袋
与否对愈伤组织增重量没有明显的差异 。
综合分析可知 ,提前 5 d或 3 d喷多菌灵而不套
袋 ,是叶片作外植体进行组培的最好前处理办法。
表 5　不同处理的茎段愈伤组织重量比较
处理 愈伤组织重量/ g
8 d 5 d 3 d
套袋 D10.65 a E10.95 a F11.47 a
不套袋 J10.90 a K 11.24 a L10.90 a
2.2　酒精和升汞对组织培养的影响
2.2.1　酒精和升汞对叶片愈伤组织增重量的影响
　表 6可见 ,经升汞处理 5 min 的愈伤组织平均增
重量(处理 B2 、E2 和 H2),明显比处理 3 min 和 7
min的多。说明升汞处理 5 min的效果好 ,其中 ,叶
片愈伤组织增重量最多的是处理 E2(升汞 5 min+
酒精 30 s)。方差分析表明 ,叶片的不同处理间的愈
伤组织增重量差异显著(F =10.60 , F0.05=3.04);
进一步的差异显著性多重比较表明 ,处理 E2 的效果
最好 ,与处理H2 和 I2 的愈伤组织平均增重量无显
著差异 ,而与处理 B2 、C2 、D2 、G2 、A2 和 F2 的差异显
著 ,处理 F2(酒精 30 s+升汞 7 min)的效果最差 。
可见升汞消毒时间过长会对组织细胞造成伤害。
表 6　酒精和升汞对叶片愈伤组织重量的影响
酒精处
理时间
愈伤组织重量/ g
升汞 3 min 升汞 5 min 升汞 7 min
0 s A21.79 cd B22.46 bc C 22.45 bc
30 s D22.37 bc E23.37 a F21.39 d
60 s G22.09 bc H22.75 ab I22.71 ab
2.2.2　酒精和升汞对茎段愈伤组织增重的影响　
表7表明 ,升汞消毒 5 min的愈伤组织平均增重量
比处理 3 min 和 7 min 的多。但就单个处理而言 ,
方差分析上 ,不同处理间茎段愈伤组织增重量的差
异显著(F =3.30 , F 0.05=3.04);进一步的各处理差
异显著性多重比较表明 ,愈伤组织增重量最多的是
处理 O2(升汞 7 min+酒精 0 s ,这一结果有待验
证),但与升汞消毒 5 min 的处理 N2 、Q2 、T 2 和 R2
都没有显著差异 ,说明这 4种处理间的效果基本上
是一致的;效果差的是处理 U2 、M 2 、P2 和S2 ,尤其是
以处理 U2(酒精 60 s+升汞 7 min)最差 ,说明酒精
和升汞消毒时间不能过长。
表 7　酒精和升汞对茎段愈伤组织重量的影响
酒精处
理时间
愈伤组织重量/ g
升汞 3 min 升汞 5 min 升汞 7 min
0 s M 20.86 cd N 21.51 abc O21.80 a
30 s P20.74 cd Q 21.33 abcd R21.16 abcd
60 s S20.95 bcd T 21.74 ab U20.63 d
2.2.3　升汞两次消毒对愈伤组织增重的影响　升
汞两次消毒对愈伤组织增重的影响情况见表 8 ,经
过方差分析 ,表明不同处理间愈伤组织增重量的差
异显著(F =10.88 , F0.05=3.90);进一步的差异显
著性多重比较表明 ,处理 K2(酒精 30 s+升汞 2.5
min+3 min 的叶片)的愈伤组织增重量最大 , 达
2.36 g ,与处理 L2(酒精 30 s+升汞 4.5 min+3 min
的叶片)无显著差异 ,而与其他处理间的差异显著。
表 8　升汞两次消毒对愈伤组织重量的影响
材料 愈伤组织重量/ g
1.5 min+2 min 2.5 min+3 min 4.5 min+3 min
叶片 J21.58 bc K 22.36 a L22.04 ab
茎段 V 20.73 c W 21.20 bc X20.78 c
　　综合评价表明 ,在用酒精和升汞对外植体进行
消毒时 ,叶片的愈伤组织(处理 J2 、K2 和 L2)生长比
茎段愈伤组织(处理 V2 、W2 和 X2)生长好 ,酒精和
升汞消毒时间不能过长 ,过长会抑制愈伤组织的生
长 ,甚至杀死外植体。
2.3　吐温 20对组织培养的影响
2.3.1　对污染率的影响　试验中 ,加吐温 20的污
染率为 15%,不加的污染率为 20%,表明加吐温 20
的效果要稍微好一些。
2.3.2　对愈伤组织增重的影响　吐温 20对愈伤组
织增重的影响见表 9。方差分析表明 ,各处理间差
异显著(F =6.58 , F 0.05=5.29);进一步的差异显著
性多重比较表明 ,处理 A3(吐温 20+酒精 30 s+升
汞 5 min的叶片)的愈伤组织平均增重量最多 ,达
3.14 g ,与处理 B3 、C3和 D3 的差异显著 ,而处理 B3 、
67湖北农业科学　HUBEI　AGRICULTURAL　SCIENCES　No.1 ,2004
C3 和 D3之间没有显著差异。
表 9　吐温 20 对愈伤组织重量的影响
处理 愈伤组织重量/ g 差异显著性
A 3 3.14 a
C3 2.05 b
B3 1.46 b
D3 1.12 b
　　综合分析可见 ,加吐温 20 处理的叶片污染率
低 ,愈伤组织生长快 。
2.4　不同外植体取材对组织培养的影响
2.4.1　对污染率的影响　不同材料对组织培养中
污染率的影响结果见表 10 。可见幼果的污染率最
低 ,为 0;叶片的污染率最高 ,为 38%。可能的原因
是幼果表面光滑 ,表面积较小 ,消毒容易;而叶片毛
多 ,叶脉多 ,表面积大 ,消毒难 。
表 10　不同外植体对组织培养的影响
取材 污染率/ %
愈伤组织增重
/ g 差异显著性
幼果 0 6.10 a
叶片 38 2.56 b
茎尖 30 1.59 bc
茎段 30 0.81 c
叶柄 25 0.65 c
2.4.2　对愈伤组织增重的影响　不同材料对组织
培养中愈伤组织增重的影响结果见表 10 。方差分
析表明 ,不同材料处理间差异显著(F =41.41 , F 0.05
=4.22);进一步的差异显著性多重比较表明 ,幼果
作外植体的愈伤组织增重量最多 ,达6.10 g ,与用叶
片 、茎尖 、茎段和叶柄这 4种材料的差异显著 。
综合分析表明 ,叶片 、茎尖 、茎段 、叶柄和幼果作
外植体进行组织培养时 ,以幼果作外植体的效果最
好 ,污染少 ,愈伤组织生长快 。
3　小结
本试验研究了不同消毒方法对台湾青枣组织培
养愈伤组织形成的影响。结果表明:经 600 倍多菌
灵溶液处理的叶片和茎段 ,其污染率显著减少;其
中 ,叶片最佳的消毒方法是提前 5 d喷多菌灵 ,药液
干后用消毒的塑料袋套袋 ,用 75%酒精消毒叶片 30
s ,用 0.1%升汞加 3 ～ 5滴吐温 20消毒 5 min;茎段
最佳的消毒方法是提前 3 d喷多菌灵 ,套袋 , 75%酒
精消毒 30 s ,0.1%升汞消毒 5 min。另外 ,将茎段 、
茎尖 、叶片 、叶柄和幼果 5种材料作为外植体进行试
验 ,发现生长最好 、愈伤组织增重量最大的是幼果。
吐温 20 的作用原理是能使消毒药剂更好地与
材料表面接触 ,促进消毒药剂与材料的粘合 ,加快消
毒进程 ,使消毒效果更好 ,所以在消毒液中加入少量
展着剂是有作用的 。
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Sterilized method on tissue culture of Taiwan green jujube
REN Jing-min , CHEN Yue-jin , GUO Li-ming
(Department of Ho rticulture, Life Science Co llege , Foshan University , Foshan　528231 , China)
Abstract:Effects of sterilization on explants and of grow th on callus were studied in the tissue culture of Taiwan g reen jujube of Z izy-
phus mauritiana by means of 1/ 600 carbendazim , 75%alcohol , 0.1% mercuric chloride and Tween-20 in order to establish the
sterilization method of the tissue culture.The results were as fo llows:The explant po llution rate was decreased by spraying 1/600
carbendazim 5 days befo re the explants were used.75% alcohol sterilized the explants for 30 seconds , 0.1% mercuric chloride with
3 ～ 5 drops of Tween-20 sterilized the explants for 5 minutes , w hich not only decreased the explant pollution rate , but also promot-
ed the callus g row th.
Key words:Taiwan g reen jujube;tissue culture;sterilized method
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