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小叶黑柴胡超高效液相色谱指纹图谱研究



全 文 : 230 
表 3 BZYQP-HPLC指纹图谱 16个指数的低指数限 (LIL)和高指数限 (HIL)
Tab 3 Low index limit (LIL)and high index limit (HIL)of the 16 digital index for BZYQP-HPLC-FPs
No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Para. F F r F r(t) F r(q) I I r I r(t) I r(q) RF RF r RF r(t) RF r(q) RI R I r RI r(t) RI r(q)
LIL 77.4 66.6 61.7 83.7 18.5 15.7 14.7 19.7 394.7 338.3 314.3 424.8 62.5 53.2 49.8 66.8
HIL 94.6 81.4 75.4 102.3 22.6 19.1 17.9 24.1 482.4 413.5 384.1 519.2 76.4 65.0 60.9 81.6
Out lier S1、 S2、 S3 、 S4 S2 S2 S2
图 4 10批补中益气丸 HPLC统一化指纹图谱
Fig 4 Normaliz ed H PLC fingerprin ts of the 10 batches of BZYQPs
(S1~ S10)
3 结论
本试验以 F 为目标函数优化选择指纹图谱试验条件 ,
以 GHIA 峰为参照物峰 , 建立了 BZYQPs 浓缩丸的 H PLC
数字化指纹图谱。应用 “中药色谱指纹图谱超信息特征数字
化评价系统 3.0” 软件从 BZYQP-HPLC 指纹图谱超信息信
息特征 、 相对统一化特征评价 10 批 BZYQPs 浓缩丸 , 结合
系统指纹地量法有效地鉴别其质量。本文把 BZYQP-RFP数
据的±10%作为基本标准来控制 BZYQPs 批间质量变异 ,
为中药质量控制提供了可供选择的参照数据。
参考文献
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(收稿日期:2009-09-21;修回日期:2009-10-08)
小叶黑柴胡超高效液相色谱指纹图谱研究
汤芳玲1 , 2 , 蔡光明1* , 袁波2 , 蔡霈1 , 张卓勇3 , 刘丽萍1 (1.中国人民解放军第 302医院全军中药研究所 , 北京
 100039;2.沈阳药科大学药学院 , 沈阳 110016;3.首都师范大学 , 北京 100048)
摘要:目的 建立小叶黑柴胡 UPLC 指纹图谱分析方法并进行聚类分析。方法 采用Waters BEH TM C18 (50 mm×
2.1 mm , 1.7 μm)色谱柱 , 以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱 , 流速:0.6 mL·min-1 , 检测波长:203 nm , 柱温:
  基金项目:北京市政府专项基金 (0853279)。
作者简介:汤芳玲 , 女 , 硕士 , 主要从事药物质量控制研究 , Tel:(010) 66933324 , E-m ail:fangjie006@163.com   *通讯作者:
蔡光明 , 男 , 研究员 , 主要从事药物分析和中药化学研究 , Tel:(010) 66933323 , E-m ail:cgml004@vip.sina.com
Cen t ral South Pharmacy.March 2010 , Vol.8 No.3 中南药学 2010年 3月第 8卷第 3期
 231 
30 ℃。结果 通过检测 10 批小叶黑柴胡药材 , 建立其 UPLC 指纹图谱 , 共标定了 28 个共有指纹峰 , 根据聚类分
析结果 , 可将药材质量分为 2 大类 , 8 个相似度较高的药材分为一类 , 相异度高的 2、 5 号药材分为另一类。结论 
所用方法稳定 、 重复性好 , 可用于小叶黑柴胡药材的质量控制。
关键词:小叶黑柴胡;超高效液相色谱;指纹图谱;聚类分析
中图分类号:R284 , O234    文献标识码:A    文章编号:1672-2981 (2010)03-0231-05
Fingerprint of Bupleurum.smithii Wol f f var.parvi f oliaum Shan et Y.Li
by ultra performance liquid chromatography
TANG Fang-ling 1 , 2 , CAI Guang-ming1* , YUAN Bo2 , CAI Pei1 , ZH ANG Zhuo-yong3 , LIU L i-ping1 (1.China
Mi litary Instit ute of Chinese Materia Med ica , 302 Military Hospital of China , Bei jing 100039;2.Shenyang
Pharmaceutical University , S henyang 110016;3.Captia l Normal University , Bei jing 100048)
Abstract:Objective  To establish the fing erprint of Bup leurum.smithii Wol f f var.parvi f oliaum Shan et Y.Li by
UPLC , and to car ry out hiera rchical cluste r analysis.Methods Wate rs BEHT M C18 (50 mm×2.1 mm , 1.7μm)col-
umn was used.The mobile pha se w as composed of ace tontrile and wa te r w ith a g radient elution.The flow rate was
0.6 m L·min -1 w ith PDA detected at 203 nm.The colum n temperature w as 30 ℃.Results Af te r detecting 10 ba t-
ches o f Bup leurum.smithii Wol f f var.parvi f oliaum Shan e t Y.Li , an UPLC finge rprint w as developed with 28 com-
mon peaks.The 10 ba tches o f samples could be divided into 2 g rade s by hie rarchical cluster analysis.One g roup includ-
ed 8 samples with high similarity , w hile No.2 and No.5 materials with high div ersity was in the o the r gr oup.Conclu-
sion This method is stable and repea table , and can be used to cont rol the quality of Bupleurum.smithii Wol f f
var.parv i f oliaum Shan et Y.Li.
Key words:Bupleurum.smithii Wol f f var.parv i f oliaum Shan et Y.Li;UPLC;fing erprint;cluster analysis
    小 叶 黑 柴 胡 B up leurum.smithii Wol f f
var.parv i f oliaum Shan et Y.Li 为伞形科 (Umbelliferae)
柴胡属植物 , 主要分布于我国的青海 、 宁夏 、 山西 、 内蒙
古 、 河北等地 , 并作为柴胡入药用。宁夏 、 山西等省的地方
药材标准已将其收录。小叶黑柴胡以全草入药 , 为全面建立
小叶黑柴胡质量控制的方法 , 本课题组分别对其根和茎叶部
分进行研究 , 柴胡的入药部位根具有和解退热 , 疏肝解郁 ,
升阳举气之功效[1] , 柴胡皂苷类成分是其活性成分之一 , 本
文通过采用超高效液相色谱法建立小叶黑柴胡根部分指纹图
谱研究[2-7] 。超高效液相色谱法采用 1.7μm 颗粒度的色谱柱
填料 , 能够获得更高的柱效 , 具有更高的分离效率及灵敏
度 , 分析时间也大大缩短 , 再结合闪式提取器高效 、 快速 、
简便的提取方法[8-9] , 为小叶黑柴胡的质量控制提供了高效 、
可行的新方法。
1 仪器与试药
ACQ UITY超高效液相色谱仪 (配有二级管阵列检测
器 , 美国Waters 公司), JHBE-20A 型闪式提取器 (北京
金鼐科技发展有限公司), A L204型电子分析天平 (梅特勒-
托利多有限公司), 柴胡皂苷 a、 d 对照品 (昆明科翔生物有
限公司 , 纯度 98%)、 乙腈 (Burdick ﹠ Jackson 公司 , 色谱
纯)、 Millipore 超纯水 (美国 Millipo re公司 , 18 Ψ)、 甲醇 、
氨水 (北京化工厂 , 分析纯)。小叶黑柴胡药材共 10 批 , 经
解放军 302 医院全军中药研究所肖小河研究员鉴定为小叶黑
柴胡 Bupleurum.smithii Wol f f var.parvi f oliaum Shan e t
Y.Li的根 (见表 1)。
表 1 小叶黑柴胡药材来源
Tab 1 Source of Bupleurumsmithii Wolf f var. parvi foliaumShan et Y.Li
样品号 (No.) 样品来源 (sample source)
1 河北张家口 , 购买于安国
2 内蒙海拉尔Ⅰ , 购买于安国
3 内蒙海拉尔Ⅱ , 购买安国
4 青海刚查县 , 购买于青海西宁
5 青海海宴县 , 购买于青海西宁
6 青海大通县 , 09年 7月实地采摘
7 青海祁连山草原 , 09年 7月实地采摘
8 青海门源县 , 09年 7月实地采摘
9 山西大同县 , 购买于安国
10 山西阳曲县 , 购买于安国
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适用性
Water s BEH C18 (50 mm×2.1 mm , 1.7 μm)色谱柱 ,
流动相:乙腈 (A)-水 (B), 进行梯度洗脱 , 0 ~ 2 min
(5%~ 10%A), 2 ~ 3 min (10% ~ 15%A), 3 ~ 5 min
(15%~ 20%A), 5 ~ 9 min (20%~ 40%A), 9 ~ 11 min
(40%~ 45%A), 11 ~ 14 min (45%~ 60%A), 14 ~ 18 min
(60%~ 100%A), 检测波长:203 nm , 流速:0.6 mL ·
min-1 , 柱温:30 ℃。在本色谱条件下柴胡皂苷 a、 d 的保
留时间分别为 9.138 、 10.689 min , 2 个成分分离良好 , 理
论塔板数>70 000 , 与相邻未知峰的分离度均>1.5。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取柴胡皂苷 a、 d 对照品适量 , 溶解于 25 mL 容
量瓶中并用甲醇定容 , 制得浓度分别为 0.118 、 0.223 mg ·
中南药学 2010年 3月第 8卷第 3期 Cent ral Sou th Pharmacy.March 2010, Vol.8 No.3
 232 
mL-1的 a、 d混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密称取药材粉末 1.0 g置于100 m L烧杯中 , 加入 5%
氨水甲醇溶液 (100 m L甲醇中加 5 mL 氨水)30 m L , 用闪
式提取器提取 3 次 , 2 min· 次-1 , 合并提取液浓缩至干 ,
残渣用甲醇溶解于 5 mL 容量瓶 , 过 0.22 μm 滤膜即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 取 10 号供试品溶液 , 按 “ 2.1” 项下
色谱条件连续进样 6 次 , 测定指纹图谱精密度 , 各共有峰保
留时间及峰面积的 RSD均<3%。符合指纹图谱分析要求 ,
精密度良好。
2.4.2  重复性试验 取 10 号供试品药材粗粉 6 份 , 按
“2.3” 项下方法制备 , 以 “2.1” 项下的色谱条件进行测定 ,
各共有峰保留时间及峰面积的 RSD 均<3%, 符合指纹图谱
分析要求 , 重复性良好。
2.4.3 稳定性试验 取 10 号供试品溶液 , 按 “ 2.1” 项下
色谱条件 , 分别于 0、 2 、 4、 6 、 8、 12、 24 h 进行测定 , 记
录指纹图谱 , 各共有峰保留时间及峰面积的 RSD 均<3%,
表明供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。
2.5 小叶黑柴胡指纹图谱测定[ 10-12]
取柴胡皂苷 a、 d 的对照品溶液及 10 批供试品溶液进
样 , 按 “2.1” 项下的色谱条件记录 20 min 的色谱图 (见图
1 ~ 3), 确定了 28 个共有峰作为特征峰 , 其中 15 、 19 号峰
分别为柴胡皂苷 a、 d 色谱峰 , 样品中 1 、 2、 16、 17、 18 、
24 号 6 个未知成分色谱峰吸收值很高 , 经二极管阵列检测
器分析 , 光谱吸收与柴胡皂苷不一致 , 排除了为皂苷类成
分 , 经实验与北柴胡比较 , 为小叶黑柴胡的特征峰。柴胡皂
苷 a分离较好且成分稳定 , 为已知成分 , 故选为指纹图谱的
参照物 (S), 设其保留时间和峰面积为 1 , 计算共有峰的相
对保留时间和相对峰面积(见表 2 ~ 3)。
表 2 10批小叶黑柴胡药材指纹图谱共有峰的相对保留时间
Tab 2 Releative retention time of common peaks for sample 10batches
峰号
(peak No.)
相对保留时间 (releat ive retent ion tim e)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 0.0256 0.0256 0.0257 0.0256 0.0256 0.0253 0.0256 0.0251 0.0256 0.0256
2 0.0336 0.0336 0.0337 0.0334 0.0335 0.0336 0.0337 0.0332 0.0336 0.0336
3 0.283 0.282 0.280 0.283 0.282 0.283 0.281 0.283 0.283 0.282
4 0.298 0.299 0.300 0.292 0.298 0.298 0.298 0.295 0.299 0.298
5 0.317 0.316 0.318 0.317 0.312 0.314 0.316 0.317 0.317 0.316
6 0.328 0.325 0.329 0.329 0.327 0.328 0.317 0.320 0.328 0.328
7 0.409 0.405 0.403 0.410 0.409 0.407 0.409 0.412 0.410 0.409
8 0.509 0.508 0.511 0.510 0.508 0.509 0.509 0.502 0.506 0.509
9 0.566 0.568 0.564 0.568 0.563 0.566 0.565 0.565 0.567 0.566
10 0.670 0.669 0.672 0.671 0.669 0.669 0.668 0.666 0.670 0.669
11 0.803 0.803 0.808 0.805 0.802 0.803 0.801 0.803 0.803 0.806
12 0.857 0.854 0.857 0.856 0.853 0.854 0.852 0.854 0.855 0.853
13 0.912 0.911 0.915 0.913 0.910 0.911 0.916 0.912 0.911 0.910
14 0.937 0.935 0.940 0.938 0.935 0.936 0.934 0.935 0.936 0.937
15 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
16 1.039 1.038 1.033 1.041 1.037 1.039 1.039 1.042 1.039 1.038
17 1.114 1.112 1.119 1.116 1.113 1.114 1.114 1.118 1.115 1.113
18 1.135 1.134 1.139 1.137 1.133 1.134 1.134 1.138 1.135 1.134
19 1.171 1.169 1.164 1.172 1.168 1.169 1.167 1.166 1.170 1.172
20 1.259 1.258 1.264 1.261 1.257 1.258 1.258 1.260 1.259 1.258
21 1.603 1.602 1.610 1.606 1.601 1.603 1.606 1.605 1.604 1.605
22 1.624 1.621 1.629 1.625 1.620 1.622 1.625 1.624 1.623 1.621
23 1.683 1.682 1.690 1.686 1.681 1.683 1.686 1.686 1.684 1.682
24 1.769 1.768 1.766 1.772 1.766 1.768 1.772 1.766 1.770 1.767
25 1.872 1.873 1.881 1.882 1.871 1.873 1.877 1.878 1.875 1.872
26 1.901 1.900 1.908 1.904 1.898 1.900 1.904 1.908 1.902 1.899
27 1.969 1.968 1.967 1.973 1.966 1.968 1.973 1.966 1.970 1.967
28 1.981 1.980 1.988 1.989 1.978 1.980 1.985 1.988 1.982 1.979
2.6 指纹图谱相似度评价
采用国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系
统软件 , 用中位数法建立对照指纹图谱 , 采用夹角余弦法计
算 10 批药材相似度 , 其中 7 批药材相似度>0.900 , 内蒙海
拉尔Ⅰ , 青海海宴县相似度分别只有 0.310 、 0.274 , 采自
青海门源的药材相似度为 0.897 , 结果见表 4。
2.7 各产地药材指纹图谱的聚类分析
对样品的相似度进行聚类分析 , 结果显示 , 检测药品质
量大概分 2 大类 , 第一类有 1、 3 、 10 、 7 、 8、 4 、 9、 6;第
二类有 2、 5 , 与其他 8 个样品相异度较高 , 提示药材可能
受产地 、 地理因素 、 采摘季节的影响较大或是药材商提供的
伪品 (见图 4)。
Cen t ral South Pharmacy.March 2010 , Vol.8 No.3 中南药学 2010年 3月第 8卷第 3期
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表 3 10批小叶黑柴胡药材指纹图谱共有峰的相对峰面积
Tab 3 Releative area of common peaks for the 10 sample batches
峰号
(peak No.)
相对峰面积 (releative peak area)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 6.025 4.723 5.880 7.209 3.118 6.781 3.759 2.815 3.963 7.673
2 3.497 2.349 4.004 2.041 3.331 3.985 4.165 2.808 3.421 5.131
3 0.734 0.250 0.519 0.642 0.511 0.840 0.989 0.655 0.459 0.767
4 0.780 0.415 0.760 0.648 0.600 1.230 1.475 0.959 0.457 0.785
5 0.621 0.084 0.631 1.002 0.099 0.726 0.706 0.590 0.494 0.792
6 0.494 0.255 0.513 0.752 0.561 0.918 0.831 0.567 0.455 0.565
7 0.995 0.413 0.953 1.172 0.890 1.010 0.925 0.916 0.695 0.897
8 0.660 0.139 0.615 0.819 0.144 0.797 0.761 0.695 0.374 0.651
9 0.714 0.342 0.862 0.921 0.324 0.855 0.732 0.630 0.488 0.938
10 0.920 0.331 0.567 0.923 0.260 0.800 0.744 0.781 0.682 0.988
11 1.818 0.221 1.074 3.206 0.146 0.839 0.715 0.734 0.855 0.959
12 2.964 0.186 1.702 2.238 0.117 0.715 0.612 0.607 0.908 1.227
13 2.251 1.125 1.968 1.464 1.596 2.176 2.029 1.561 1.626 2.157
14 1.041 0.323 0.934 0.385 0.313 0.339 0.310 0.366 0.376 0.817
15 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
16 19.446 0.445 14.232 17.198 0.461 35.146 38.729 38.448 11.858 18.193
17 6.343 1.120 5.019 3.829 1.297 7.741 7.245 5.936 1.002 6.213
18 18.155 0.069 14.697 5.669 0.100 7.653 8.680 3.641 1.497 18.098
19 0.796 2.272 0.967 0.344 1.909 0.424 0.469 0.657 0.384 1.057
20 0.329 1.438 0.401 0.096 1.534 0.213 0.170 0.329 0.031 0.405
21 0.077 0.037 0.047 0.055 0.055 0.106 0.136 0.103 0.026 0.035
22 0.205 0.042 0.105 0.136 0.063 0.286 0.406 0.327 0.002 0.102
23 0.236 0.383 0.187 0.254 0.798 2.417 2.371 1.497 0.095 0.211
24 0.278 0.240 0.267 0.346 0.123 0.220 0.534 0.515 0.436 0.172
25 0.321 0.218 0.251 0.198 0.194 2.017 2.018 3.245 0.478 0.499
26 0.449 0.252 0.262 0.294 0.505 0.393 0.714 0.606 0.147 0.309
27 0.344 0.279 0.225 0.233 0.330 0.238 0.184 0.131 0.219 0.355
28 0.327 0.395 0.281 0.290 0.363 0.304 0.260 0.195 0.255 0.475
图 3 小叶黑柴胡样品的对照色谱指纹图谱
Fig 3 Reference fingerprin t chromatog ram of Bup leurum.sm ithi i
Wol f f var.parvi f oliaum Shan et Y.Li
表 4 10批药材相似度
Tab 4 Similarity of 10 batches of medical materials
批号
(batch)
相似度
(similarit y)
批号
(batch)
相似度
(simi lari ty)
1 0.918 6 0.947
2 0.310 7 0.909
3 0.919 8 0.897
4 0.978 9 0.984
5 0.274 10 0.914
中南药学 2010年 3月第 8卷第 3期 Cent ral Sou th Pharmacy.March 2010, Vol.8 No.3
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图 4 小叶黑柴胡的聚类分析图
Fig 4  H ierarchical clus ter analysi s figu re of Bup leurum.smithi i
Wol f f var.parvi fol iaum Shan et Y.Li
3 结论
在该色谱条件下 , 小叶黑柴胡根部分提取物有较好的分
离。通过对 10 批药材相似度评价和聚类分析 , 结果表明内
蒙海拉尔Ⅰ , 青海海宴县 2 个产地的药材相异度较高 , 各个
产地共有峰的相对保留时间 RSD<3%, 相对保留峰面积有
较大的差异 , 表明不同的地理位置和气候条件可能对药材的
组成和含量存在一定的影响 , 标定了 28 个共有峰 , 非共有
峰占总峰面积的 10%以下 , 符合指纹图谱测定的技术要求。
总之 , 该方法用于小叶黑柴胡的质量控制稳定 、 可靠 、 重复
性好。
4 讨论
本实验采用二极管阵列检测器对柴胡皂苷 a、 d 进行全
波长扫描 , 在 203 nm 吸收最强 , 故选其为检测波长 , 皂苷
为紫外末端吸收 , 为消除甲醇本底吸收引起的干扰 , 选择乙
腈-水进行梯度洗脱。柴胡皂苷 a、 d 之间高含量未知成分的
色谱峰对其分离造成干扰 , 经流动相梯度多次优化 , 整体色
谱峰有较好的分离 , 柴胡 a、 d 分离度也达到完全分离的要
求。
以柴胡皂苷 a、 d 的含量总和为指标 , 对比研究了闪式
提取 、 超声提取 、 回流提取 3 种方法 , 结果闪式提取优于超
声提取 、 回流提取 , 并利用正交试验法确定了最优的闪式提
取工艺。比较了 3%吡啶-甲醇 、 5%氨水甲醇 、 2%氢氧化钾
-甲醇 3种不同的提取溶剂 , 结果用 5%氨水甲醇提取最优。
本文所采用的闪式提取法吸收了传统的粉碎 、 搅拌 、 振
动 、 浸渍 、 萃取等技术的优点 , 大大缩短了提取时间 , 同时
最大程度避免了对有效成分的稳定性影响 , 是一种对有效成
分快速 、 强化提取的方法 , 具有提取效率高 、 提取溶剂用量
少 、 常温操作 、 环保等优点。
参考文献
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(收稿日期:2010-01-12;修回日期:2010-01-29)
《中南药学》 2009年计量指标
  根据 《中国科技期刊引证报告 (核心版)》 (2009 年版), 《中南药学》 计量指标统计如下。
总被引
频次
影响
因子
即年
指标
他引总
引比
引用半
衰期
被引半
衰期
基金论
文比
引用
刊数
扩散
因子
学科影
响指标
学科扩
散指标
439 0.560 0.077 0.65 5.34 3.25 0.20 245 1.59 0.73 3.77
Cen t ral South Pharmacy.March 2010 , Vol.8 No.3 中南药学 2010年 3月第 8卷第 3期