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HPLC和 UPLC法对比测定千里香药材中九里香酮的含量
王静 1 ,韩正洲 1 ,杨立伟 2 ,徐强1 ,杨海宏2
　第一作者　Tel:(0755)83360999;E-mail:wangjing-64644@163.com
(1.华润三九医药股份有限公司 , 深圳 518029;2.广东省药品检验所 ,广州 510180)
摘要　目的:用高效液相色谱(HPLC)法与超高效液相色谱(UPLC)法对比测定千里香药材中九里香酮的含量。方法:分别建
立了 HPLC和 UPLC测定千里香药材中九里香酮含量的方法。 HPLC法为 AKZONOBELKromasil100-5 C18(4.6 mm×250
mm, 5 μm)色谱柱 ,以乙腈 -水(30∶70)为流动相 , 流速 1 mL· min-1 ,检测波长 337 nm, 柱温 30 ℃;UPLC法为 WatersAcquity
BEHC18(2.1mm×50mm, 1.7μm)色谱柱 ,以乙腈 -水(23∶77)为流动相 , 流速 0.5mL· min-1 ,检测波长 337 nm, 柱温 30℃。
结果:2种方法所得含量测定结果一致。 HPLC法和 UPLC法加样回收率的 RSD分别是 1.8%和 1.7%。结论:HPLC和 UPLC
法测定千里香中九里香酮的含量 ,方法简便 , 结果准确可靠。 UPLC较 HPLC法更加简便迅速 , 既达到了分析的高通量 ,得到更
高的分析灵敏度 , 又大大提高了分析速度 , 减少了有机溶剂的消耗。 UPLC法能够成功替代 HPLC法 ,为千里香药材质量控制
提供新的检测方法。
关键词:超高效液相色谱法;高效液相色谱法;九里香酮;千里香
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2010)08-1499-03
ComparisonofUPLCandHPLCforthedeterminationof6 , 8 , 3′, 4′,
--tetramethoxyflavoneinMurayapaniculata(L.)Jack
WANGJing1 , HANZheng-zhou1 , YANGLi-wei2 , XUQiang1 , YANGHai-hong2
(1.SanJiuMedical＆Pharmaceuticalco., LTD., Shenzhen518029, China;2.GuangDongInstituteforDrugControl, Guangzhou510180, China)
Abstract　Objective:Tocomparethemethods—HPLCandultraperformanceliquidchromatography(UPLC)for
thedeterminationof6, 8, 3′, 4′, --tetramethoxyflavoneinMurrayapaniculata(L.)Kack.Method:Respectively
establishtheHPLCandUPLCmethodsforthedeterminationof6, 8, 3′, 4′, --TetramethoxyflavoneinMurraya
paniculata(L.)jack.AAKZONOBELKromasil100-5 C18column(4.6 mm×250 mm, 5μm)wasadoptedwith
methanol-water(30∶70)asmobilephaseataflowrateof1 mL· min-1;detectivewavelengthwassetat337 nm
andcolumntemperaturewas30 ℃ inHPLC.AWatersAcquityBEHC18 column(2.1 mm×50mm, 1.7 μm)was
adopted, withacetonitrile-water(23∶77)asmobilephaseataflowrateof0.5 mL·min-1;detectivewavelength
wassetat337nmandcolumntemperaturewas30℃ inUPLC.Results:Bothofthetwomethodsforthedetermina-
tionhadthesameresults.TheRSDoftheaveragerecoveryofHPLCandUPLCwere1.8% respectively, 1.7%.
Conclusion:HPLCandUPLCmethodsforthedeterminationof6, 8, 3′, 4′, --tetramethoxyflavoneinMurraya
paniculata(L.)Jackaresimple, theresultsareaccurateandreliable.ThemajoradvantagesofUPLC, overHPLC
arethespeedofanalysis, thenarowerpeaks(givingincreasedsignal-to-noiseratio), UPLCcannotonlyincrease
separationspeedandeficiency, butalsoreducesolventconsumptionandanalysistime.UPLCasanewdetection
methodcanreplaceHPLCforthequalitycontrolofMurrayapaniculata(L.)Jack.
Keywords:UPLC;HPLC;6, 8, 3′, 4′, --tetramethoxyflavone;Murayapaniculata(L.)Jack
　　超高效液相色谱(ultraperformanceliquidchro-
matography, UPLC)是近几年推出的一种新的液相色
谱技术。 UPLC与传统的 HPLC技术相比 ,能获得更
高的柱效 ,并且在更宽的线速度范围内柱效保持恒
—1499—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(8)DOI :10.16155/j.0254-1793.2010.08.018
定 ,因而其峰容量 、分离效率 、灵敏度和分辨率较常
规的 HPLC有很大的提高 ,为复杂体系的分离分析
提供了良好的平台 [ 1] 。目前 , UPLC已用于生物药
物 、天然产物 、代谢组学等方面研究 ,但 UPLC在中
药分析应用中较少见 。
千里香(Murayapaniculata(L.)Jack)为芸香科
九里香属植物 ,味辛 、微苦 ,性温 ,有小毒 ,是一种用途
广泛的中药材。其主要分布于我国西南部 ,有行气止
痛 、活血散瘀 、祛风除湿 、麻醉镇惊等功能。用于治疗
胃痛 、风湿痹痛;外治牙痛 ,跌扑肿痛 ,虫蛇咬伤等[ 2] 。
现代药理研究表明 ,千里香具有抗生育和终止妊娠 、
抗菌消炎 、抗甲状腺 、降血糖 、麻醉镇静以及增强免疫
功能等作用[ 3] 。千里香含有多种香豆素类 、黄酮类化
合物 、生物碱及萜类成分。目前已从千里香中提取分
离出多种黄酮类成分 ,其中九里香酮(6, 8, 3′, 4′-四
甲氧基黄酮)为其主要成分 ,而关于九里香酮的含量
测定 、药理活性研究却鲜见报道。
本试验以千里香中九里香酮为含量测定指标 ,
建立并比较了 HPLC和 UPLC含量测定方法 。
1　仪器与试药
戴安 UItiMateTM3000型智能液相色谱仪 ,包括
四元泵处理器 、样品处理器 、柱温箱 、PDA检测器以
及 Chromeleon色谱工作站。 WatersAcquityUPLC
system,包括二元泵处理器 、样品处理器 、柱温箱 、
PDA检测器以及 Empower色谱工作站 。九里香酮
对照品 (华润三九医药股份有限公司自制 , 纯度
98.5%);千里香药材 (由华南植物园叶华谷教授鉴
定);乙腈为色谱纯(Merck公司);水为 Milipore超
纯水(18.2 Ψ)。其他试剂均为分析纯 。
2　方法与结果
2.1　色谱条件
2.1.1　HPLC色谱条件
色谱柱:AKZONOBELKromasil100-5 C18(4.6
mm×250 mm, 5 μm)色谱柱 ,流动相:乙腈 -水(30
∶70),流速:1 mL· min-1 ,检测波长:337 nm[ 4] ,柱
温:30 ℃,进样量:10 μL,自动进样 。
2.1.2　UPLC色谱条件
色谱柱:WatersAcquityITYBEHC18(2.1mm×
50 mm, 1.7μm),流动相:乙腈 -水(23∶77),流速:
0.5mL·min-1 ,检测波长:337 nm,柱温:30 ℃,进
样量:4μL,自动进样。
2.2　对照品溶液的制备　精密称取九里香酮对照品
适量 ,加甲醇制成每 1mL含 0.05mg的溶液 ,即得。
2.3　供试品溶液的制备　取千里香粉末(过四号
筛)约 1 g,精密称定 ,置具塞锥形瓶中 ,精密加入甲
醇 25 mL,称定重量 ,超声处理(功率 300W,频率 40
kHz)30 min,放冷 ,再称定重量 ,用甲醇补足减失的
重量 ,摇匀 ,滤过 ,取续滤液 ,即得 。
2.4　测定法　分别精密吸取对照品溶液 、供试品溶
液各 10μL注入 HPLC仪;另分别精密吸取对照品
溶液 、供试品溶液各 4 μL注入 UPLC仪;分别按外
标法计算 ,即得 。
2.5　线性关系考察及检测限
精密吸取九里香酮(0.05256 mg· mL-1)对照
品溶液 5, 10, 15, 20, 25μL,注入 HPLC色谱仪 ,以色
谱峰峰面积(Y)为纵坐标 ,以浓度(X)为横坐标 ,绘
制标准曲线。回归方程为
Y=708.3X-0.1445　 r=0.9996(n=6)
表明九里香酮在 0.2628 ～ 1.314 μg范围内线性关
系良好。并以 3倍信噪比(S/N=3)计算出检测限
为 1.1 ng。
精密吸取九里香酮(0.05256 mg· mL-1)对照
品溶液 1, 2, 4, 6, 8μL,注入 UPLC色谱仪 ,以色谱峰
峰面积(Y)为纵坐标 ,以浓度(X)为横坐标 ,绘制标
准曲线。回归方程为
Y=1.0×107X-1.037×103　r=0.9997(n=6)
表明九里香酮在 52.56 ～ 420.5ng范围内线性关系
良好 。并以 3倍信噪比(S/N=3)计算出检测限为
0.8 ng。
2.6　精密度试验
精密吸取 0.05256 mg· mL-1九里香酮对照品
溶液 10μL,注入 HPLC仪 ,连续进样 6次 ,九里香酮
峰面积的 RSD为 0.61%。
精密吸取上述对照品溶液 4μL,注入 UPLC仪 ,
连续进样 6 次 , 九里香酮峰面积的 RSD值为
0.35%。表明 HPLC和 UPLC仪器的精密度良好。
2.7　稳定性试验　仪器自动精密吸取供试品溶液
10, 4 μL分别注入 HPLC和 UPLC色谱仪 ,分别在
0, 2, 4, 6, 8, 12, 24 h进样 ,计算峰面积的 RSD,结果
HPLC法九里香酮峰面积的 RSD为 1.14%;UPLC
法九里香酮峰面积的 RSD为 0.87%。表明供试品
溶液在 24 h内稳定。
2.8　重复性试验　精密称取千里香药材粉末 1 g,
共 6份 ,按 “ 2.3”项下方法进行处理 ,并分别按照
HPLC和 UPLC各自液相色谱检测条件进行测定。
结果 HPLC法测定九里香酮含量的 RSD为 1.8%;
UPLC法测定九里香酮含量的 RSD值为 1.4%。表
明本方法的重复性良好 ,适于本品中九里香酮的提
—1500— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(8)
取和 HPLC、UPLC法分析。
2.9　加样回收试验　称取千里香药材粉末 6份 ,每
份 0.5g,精密称定 ,分别置具塞锥形瓶中 ,精密加入
相当于千里香药材中 100%量的九里香酮对照品溶
液 ,按 “2.3”项下方法处理 ,并分别按照 HPLC和 UP-
LC各自液相色谱检测条件进行测定 ,分别计算回收
率。 HPLC法的平均回收率为 98.1%, RSD为 1.8%;
UPLC法的平均回收率为 99.8%, RSD为 1.7%。
2.10　测定结果　取不同产地的千里香药材 3批 ,
分别按 “2.3”项下方法进行处理 ,并分别按照 HPLC
和 UPLC色谱检测条件 ,测定九里香酮的含量 ,用外
标法计算。
结果表明 , HPLC和 UPLC所测得千里香中九里
香酮的含量一致(表 1),色谱图见图 1。
表 1　HPLC和 UPLC法测定千里香中
九里香酮含量的结果对比(mg· g-1)
Tab1　ComparisonofUPLCandHPLCfor
determinationof6, 8, 3′, 4′, --tetramethoxy
flavoneinMurrayapaniculata(L.)Jack.
产地(producingarea) HPLC UPLC
广西凭祥(PingxiangGuangxiChina) 1.61 1.59
广西防城港(FangchenggangGuangxiChina) 1.42 1.43
越南同登(TongdengVietnam) 1.66 1.67
图 1　HPLC法对照品(A)和供试品(B)及 UPLC法对照品(C)和供
试品(D)色谱图
Fig1　HPLCandUPLCchromatogramsofreferencesubstancesandsample
1.九里香酮(6, 8, 3′, 4′, --tetramethoxyflavone)
3　讨论
3.1　以 HPLC法考察不同比例的甲醇 -水 、乙腈 -
水溶剂系统 ,分离度和峰形良好;但以 UPLC法考察
不同比例的甲醇 -水溶剂系统时 ,发现分离度和峰
形较差 ,将甲醇 -水调整为乙腈 -水时 ,分离度及峰
形良好。
3.2　UPLC法较 HPLC法具有高效 、快速 、灵敏优势。
HPLC法中九里香酮与相邻色谱峰的分离度为 2.76,
85min内完成测定;UPLC法中九里香酮的分离度为
1.93,在 17min内完成测定 ,较 HPLC法 ,分析速度提
高了 5倍。 UPLC法中九里香酮的检测限为 0.8 ng,
HPLC法为 1.1ng, UPLC法更加灵敏可靠。
3.3　UPLC法供试品色谱图中 ,可能是由于进样量
降低导致色谱峰的数量减少 ,对九里香酮与相邻色
谱峰分离度并无影响 ,对后续测定也无显著影响 。
3.4　本试验中建立了 HPLC、UPLC法测定千里香药
材中九里香酮含量的方法 ,并按 2005年版中国药典
一部附录中 “中药质量标准分析方法验证指导原则”
进行了方法学研究。比较了 HPLC法与 UPLC法含
量测定结果 ,可看出两法测定结果误差在规定范围以
内。UPLC法具有快速 、灵敏 、高分离度等优势 ,在保
证含量测定结果准确的前提下 ,将提高分析效率 ,节
省分析时间 ,减少溶剂损耗 ,降低分析成本。但 UPLC
法与 HPLC法比较 ,仪器成本较高。
参考文献
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(HPLC法测定三九胃泰颗粒中九里香酮的含量).ChinTradit
HerbDrugs(中草药), 2005, 36(3):375
(本文于 2009年 8月 9日收到)
—1501—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(8)