全 文 ：基金项目:湖南省科技厅科学技术研究项目(项目编号:03JZY3016)
作者简介:熊建华(1969-), 女 ,江西农业大学食品学院副教授 、博
士。 E-mail:xjhxjh69@163.com
收稿日期:2008-03-06
第 24卷第 4期
2 0 0 8年 7月
Vol.24, No.4
July.2 0 0 8
巴拉圭茶多酚体外抗氧化性能研究
StudyoninvitroantioxidanteffectsofpolyphenolsinIlexparaguariensis
熊建华 1, 2
XIONGJian-hua1, 2　
刘仲华 2
LIUZhong-hua2　
黄建安 2
HUANGJian-an2
(1.江西农业大学食品学院 , 江西 南昌　330045;2.湖南省天然产物工程技术中心 ,湖南 长沙　410128)
(1.DepartmentofFoodScience, JiangxiAgriculturalUniversity, Nanchang, Jiangxi330045, China;
2.TheHunanEngineeringandTechnologyCenterforNaturalProducts, Changsha, Hunan410128, China)
摘要:通过与茶多酚(TP)、绿原酸(CA)的对比试验 ,研究巴拉
圭茶多酚(IPP)的抗氧化能力。采用羟自由基(· OH)、二苯
代苦味酰自由基(DPPH)、超氧阴离子自由基(O-2 · )的清除
率测定法及 TBA法评价 IPP清除自由基和阻止亚油酸过氧
化的能力。结果表明:IPP对· OH的清除效果良好(IC50 =
0.021mg/mL);对 DPPH清除能力(IC
50
=0.009 8 mg/mL)强
于 CA弱于 TP;对 O-2 ·的清除能力(IC50=0.033 mg/mL)强
于 CA稍弱于 TP;对亚油酸也有很好的抗氧化作用。体外
试验证明:IPP具有较强的抗氧化能力。
关键词:巴拉圭茶多酚;茶多酚;绿原酸;抗氧化作用
Abstract:ToinvestigatetheantioxidantactivityofpolyphenolsinIlexpara-
guariensis(IPP)bycomparingwithteapolyphenols(TP)andchlorogenic
acid(GA)s.TheantioxidantactionofpolyphenolsinIlexparaguariensis
towardshydroxylradical, 1, 1-diphenyl2-picrylhydrazyl, superoxidized
anionicradicalandlinoleicacidwastested, appraisedofantioxidative
efectsofpolyphenolsinIlexparaguariensis.onhydroxylfreeradical, the
scavengingefectofIPPisverygood(IC50 =0.021mg/mL).Thescaven-
gingactivityonDPPHfreeradical(IC50 =0.009 8 mg/mL)isstronger
thanCAs, butweakerthanTPs, andthescavengingactivityonsuperox-
idefreeradical(IC
50
=0.033 mg/mL)isbeterthanCAs, butweaker
thanTPs, Moreover, IPPshowsstrongantioxidantactivitiesonlinoleic
acid.ExperimentsinvitroindicatedthatIPPblingsaboutstronganti-oxi-
dativeefect.
Keywords:Ilexparaguariensispolyphenols;Teapolyphenols;Chlorogenic
acid;Antioxidantproperties
随着人们生活水平的提高和对合成抗氧化剂危害性认
识的深入 , 人们正在开发和利用各种天然高效的抗氧化剂。
巴拉圭茶(Ilexparaguarensis)属冬青科冬青属 ,原产于南美 ,
是热带或亚热带多年生常绿灌木。其干叶和嫩茎可加工制
成碎茶 , 巴拉圭茶具有较好的清除自由基 、治疗炎症 、消化不
良 、肥胖 、癌症等药理作用 [ 1 ～5] ,现在许多国家与地区都在关
注 , 2004年中华人民共和国卫生部公告(第 6号)将巴拉圭
茶净油或提取物列入食品用香料名单。
巴拉圭茶含有丰富的多酚 , 其主要成分是绿原酸类物
质 , 包括绿原酸 、咖啡酸 、异绿原酸 A、异绿原酸 B、异绿原酸
C,以及少量的槲皮素 、芦丁 、三奈酚等类黄酮类物质 , 成为人
们看好的一种天然抗氧化剂。 本试验通过测定巴拉圭茶多
酚(Ilexparaguariensispolyphenols以下简称 IPP)对 · OH、二
苯代苦味酰自由基(DPPH)和 O-
2
·的清除率 ,同时用硫代巴
比妥酸(TBA)法测定其对亚油酸的抗氧化作用 ,研究 IPP的
体外抗氧化性能 , 以期为人们了解和利用巴拉圭茶提供一些
试验数据。
1　仪器与材料
1.1　仪器
UV-2550紫外可见分光光度计:SHIMADZU公司;
MCI-250生化培养箱:广州万宝;
LXJ-Ⅱ型离心机:上海医用分析仪器厂;
HH.SY21-Ni恒温水浴锅:北京长源实验设备厂;
精密电子天平:瑞士 Startorius;
移液枪:德国 Eppendorf。
1.2　材料
巴拉圭茶:阿根廷;
巴拉圭茶多 酚 (IPP):实验室制备 [ 6] , 产品纯度
80.64%。
1.3　主要试剂
磷酸氢二钠 、磷酸二氢钠 、乙醇 、硫代巴比妥酸(TBA)、
三氯乙酸 、正丁醇;
58
DOI :10.13652/j.issn.1003-5788.2008.04.039
亚油酸:Fluka公司;
DPPH:Sigma公司;
绿原酸(CA):中国药品生物制品检定所;
茶多酚(TP):湖南金农生物资源股份有限公司 , 产品纯
度 80%;
抗超氧阴离子自由基及产生超氧阴离子自由基测试盒 、
羟自由基测定试剂盒:南京建成生物工程研究所。
2　试验方法
2.1　清除羟自由基 · OH能力测定
Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应:H
2
O
2
+Fe2+※Fe3++OH- +· OHH2O2的量和 Fenton反应产生
的 · OH量成正比 ,当给予电子受体后 , 用 gress试剂显色 ,形
成红色物质 , 其呈色与 · OH的多少成正比关系。准确的将
巴拉圭茶多酚配成一系列浓度 ,具体操作按照试剂盒说明书
进行 , 蒸馏水调零 , 于 550nm处测定各管吸光度值 ,茶多酚 、
VC为对照品。巴拉圭茶多酚对· OH的清除率 K可用按式
(1)计算:
K=对照管 OD值 -测定管 OD值对照管 OD值 ×100% (1)
2.2　清除 DPPH自由基能力测定
准确地将巴拉圭茶多酚 、茶多酚 、VC配成一系列浓度溶
液 , 备用。另配制浓度为 2.0×10-4 mol/LDPPH乙醇溶液
和其它相应溶剂溶液 ,避光保存。取 2 mLDPPH溶液 , 加人
2 mL同一溶剂溶解的待测物 , 充分混合。 25 ℃ 避光反应
30 min后在 517 nm处测定其吸光度。另取 2 mL待测溶液
加 2 mL溶剂及 2mLDPPH溶液加 2mL溶剂混匀后在同等
条件下反应 , 并测定其吸光度。各待测物对 DPPH的清除率
K按式(2)计算:
K=[ 1 -(Ae-Af)/Ac] ×100% (2)
其中:
Ae——— 2mLDPPH溶液 +2 mL待测溶液 , 吸光度值;
Af——— 2mL待测溶液 +2 mL溶剂 ,吸光度值;
Ac——— 2 mLDPPH溶液 + 2 mL溶剂 ,吸光度值。
2.3　清除超氧阴离子自由基 O-2 ·能力测定
模拟人体中黄嘌呤与嘌呤氧化酶反应系统 ,产生超氧阴
离子自由基 O-
2
· , 加入电子传递物质及 gress氏显色剂 , 使
反应体系呈现紫红色 , 蒸馏水调零 , 用分光光度计测其
550nm处的吸光度 , 计算出巴拉圭茶多酚溶液对 O-2 ·的清
除能力。准确的将巴拉圭茶多酚配成一系列浓度 , 具体按照
试剂盒说明书操作 , 并以茶多酚和 VC为对照品。
按式(3)计算清除率:
K=对照管 OD值 -测定管 OD值对照管 OD值 ×100% (3)
2.4　TBA法测定巴拉圭茶多酚对亚油酸的抗氧化性能
为了更好地测定巴拉圭茶多酚的抗氧化性能 , 采用 TBA
法 [ 7]测试其对亚油酸自氧化的阻断作用。
将所有受试组巴拉圭茶多酚配成质量分数为 0.2%、
0.1%的溶液 ,在不同的具塞试管中 ,分别加入 4 mL的受试
溶液 、4 mL同浓度的对照茶多酚溶液 、空白对照为 95%的
酒精 4mL,加入 4.1 mL体积分数为 2.5%亚油酸 、pH为 7.5
磷酸缓冲液 8.0 mL和无离子水 3.9 mL, 混匀后置于培养箱
中于(40±1)℃下培养 , 定时取待测样品 1 mL, 加人 25%的
三氯乙酸 1 mL, 混匀 ,放置 , 终止反应。然后加人 0.67%的
TBA1 mL(用 0.5% 的三氯乙酸配制), 于沸水浴中加热
10 min。取出冷却后加人 4 mL正丁醇 , 摇匀 , 于 4 000 r/min
离心 10min,取上层正丁醇液 , 于 532 nm测定吸光度 A值。
3　结果与分析
3.1　巴拉圭茶多酚清除羟自由基· OH能力
羟基自由基是活性氧中最活泼的自由基 , 也是毒性最大
的自由基。它几乎能与活细胞中任何分子发生反应 , 且反应
速度极快。 IPP、TP、CA对 · OH的清除结果见图 1。从图 1
可知 , 3种物质对· OH均有较强的清除能力 , 并且随着它们
在反应液中浓度的升高 ,清除率呈上升趋势 , IPP、TP、CA清
除 · OH的 IC50(IC50表示对羟自由基· OH产生 50%清除
所需的样品浓度值)分别为:0.021, 0.030, 0.027 mg/mL。
IPP清除 · OH的能力强于 TP和 CA。
图 1　IPP、TP、CA对· OH的清除能力
Figure1　ScavengingactivitiesofIPP、TPandCAon· OH
3.2　巴拉圭茶多酚清除 DPPH自由基的能力
N, N-二苯基三硝基苯肼(DPPH)自由基 , 由于苯环的共
轭和位阻及硝基的吸电子作用 , 是一个非常稳定的自由基 ,
在反应体系中 , 若受试物能清除它 , 则提示受试物具有降低
羟自由基 , 烷自由基或过氧自由基的能力和打断脂质过氧化
链反应的作用。 DPPH结构中有 3个苯环 , 1个 N原子上有 1
个孤对电子 , 在 516 nm附近有强吸收 , 其乙醇溶液呈深紫
色 , 加入受试物后 ,孤对电子被配对 , 溶液颜色由紫色向黄色
变化 , 吸光度变小 , 吸光度变小的程度与自由基被清除的程
度呈线性关系。因而可用分光光度法进行定量分析 [ 8 , 9] 。
由图 2显示 , IPP、TP、CA对 DPPH自由基的清除率随浓
度的增加 , 呈上升趋势 , TP清除能力最强 , 其次是 IPP, CA的
清除能力稍弱 , IPP、TP、CA清除 DPPH自由基的 IC50分别为
0.009 8, 0.004 1, 0.014 4 mg/mL。
59
提取与活性 　 2008年第 4期
图 2　IPP、TP、CA对 DPPH的清除能力
Figure2　ScavengingactivitiesofIPP、TP、CAonDPPH
3.3　巴拉圭茶多酚抗超氧阴离子 O-2 ·能力
超氧阴离子自由基是第 1个生成的氧自由基 , 又是所有
氧自由基的前身 , 可以转化为其他氧自由基。因此 , 对超氧
阴离子自由基的清除可以有效地减少氧自由基的生成 , 具有
非常重要的意义。 IPP、TP、CA对 O-2 ·的清除结果见图 3。
从图 3显示 , 3种物质对 O-2 ·自由基均表现出较强的清除
效果 , 且随着浓度的增加 , 清除率也逐渐增强 ,其中 TP清除
O-
2
·自由基的能力稍好于 IPP, 但当浓度达到 0.040 mg/mL
时 , IPP清除 O-2 ·自由基的能力与 TP相当 , CA对 O-2 ·的
清除能力稍弱。 IPP、TP、CA的 IC50分别为 0.033, 0.030,
0.042mg/mL。
图 3　IPP、TP、CA对 O-2 ·的清除能力
Figure3　ScavengingactivitiesofIPP、TPandCAonO-2 ·
3.4　TBA法测定巴拉圭茶多酚对亚油酸的抗氧化性能
脂质过氧化反应的最终产物丙二醛(MDA)在酸性条件
下与硫代巴比妥酸 (TBA)共热 , 生成粉红色物质三甲川
(3, 5, 5—三甲基恶唑-2, 4-二酮), 其最大吸收波长在 532 nm,
可通过吸光度值得知脂质过氧化的情况 , TBA法中 , A值越
小表明抗氧化物的抗氧化能力越强。由图 4～ 5可知 , 2种不
同浓度的 IPP对脂质过氧化反应有阻断作用 , 且浓度升高 ,
阻断作用增强 , 在第 10天时 , 亚油酸氧化达到最高值 , 同一
浓度的 IPP溶液比 TP溶液的 A值高 , 但低于 CA溶液的 A
值 , 表明 IPP对亚油酸抗氧化能力不及 TP, 但强于 CA。进
入氧化的后期 , 由于分解的醛类物质受到再氧化生成酸 , 因
此油脂酸败至一定程度时 , 其丙二醛物质生成减少 , TBA值
下降 , 即测得的 A值下降 , 表明油脂已剧烈酸败 [ 10]。
图 4　0.2%巴拉圭茶多酚对亚油酸的抗氧化能力
Figure4　Antioxidantactivitiesof0.2% IPPonlinoleicacid
图 5　0.1%巴拉圭茶多酚对亚油酸的抗氧化能力
Figure5　Antioxidantactivitiesof0.1% IPPonlinoleicacid
4　结论
IPP对 · OH的清除效果较好(IC50 =0.021 mg/mL), 强
于 TP和 CA;对 DPPH的清除能力(IC50 =0.009 8 mg/mL)强
CA,弱 TP;对 O-2 ·的清除能力(IC50=0.033 mg/mL)强 CA,
稍弱 TP;对亚油酸过氧化具有较好的阻断作用 , 且随着浓度
的升高 , 阻断作用增强 , IPP对亚油酸的抗氧化效果强于 CA,
稍弱于 TP。 IPP清除· OH、DPPH、O-2 ·自由基的 IC50均较
小 , 其中 IPP对 DPPH自由基的清除能力最强 , IC50最小 , 对
· OH自由基的清除能力其次 , 对 O-2 ·自由基的清除能力稍
弱。
体外试验结果表明:IPP具有较好的清除自由基和阻断
亚油酸过氧化的能力 , 由于巴拉圭茶是食品 , 且含有丰富的
多酚类物质 , 开发成为一种保健品或天然药物 , 用于预防和
治疗由氧化引起的各种疾病将会有广阔的前景。
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(下转第 104页)
60
第 24卷第 4期 熊建华等:巴拉圭茶多酚体外抗氧化性能研究 　
2.3.1　进行 Friedman检验
F=12 242 +122 +…242
10 ×3 ×(3 +1)-3 ×10 ×(3 +1)=9.6
查 Friedman检验表得 Fc(3, 10, 0.05)=6.20, Fc(3,
10, 0.01)=8.6,所以 , 在 1%水平下 , 样品之间有显著差异。
2.3.2　统计分组 在 1%水平下 , 进行多重比较和分组 , 根据
各样品的秩和 Rp,从小到大将样品初步排序为:
R
1
　　 R
2
　　R3
RB RA RC
14 20 26
r(I, α)=q(I, α) 10 ×3 ×(3 +1)
12
=0.913q(I, α)。
比较与分组:
r(3, 0.05)=3.022r(2, 0.05)=2.529
由于
R3 -R1 =24 -12 r(3, 0.05), 不可划线
R3 -R2 =24 -24 =0 r(2, 0.05), 可划线
R2 -R1 =24 -12 =12 r(2, 0.05),不可划线
结果如下:B　A　C。所以在 1%的显著水平上 , 样品 B
最好 , 样品 A、C在嗜好性上无显著性差别。因此 , 选择 pH
为 3.8。
3　结论
感官评定方法是新近发展起来的食品产品配方手段 , 通
过感官分析可以解析食品本身的感官特性 , 从而为配方确定
人员提供关于产品感官性质的重要而有价值的信息 , 为产品
的研发和质量控制提供依据。 饮料配方中的甜酸比是影响
产品口感和风味的重要因素。在本试验中 , 选用白砂糖作为
甜味剂 , 选用柠檬酸作为酸味剂 , 采用感官评定方法分析不
同的甜酸比配方对水溶液体系的风味的影响 , 确定了使溶液
体系具有适宜的甜酸度的甜味剂 、酸味剂的配方为:白砂糖
8%,柠檬酸 0.16%,糖酸质量比 50∶1(W∶W), 调节饮料的
pH为 3.8。本研究的方法和结论为真实的饮料配方中的甜
酸比的确定提供了方法指导和试验依据。
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