全 文 ：85
东紫苏(Elsholtiza bodinieri Vaniot)总黄酮的
提取及其抗氧化、免疫活性的研究
毛 媛1，吕留庄1，刘克武2，刘克海1，*
(1.上海海洋大学食品学院，上海 201306;
2.黑龙江省林副特产研究所，黑龙江省非木质林产品研发重点实验室，黑龙江牡丹江 157011)
收稿日期:2015－11－05
作者简介:毛媛(1991－) ，女，硕士研究生，研究方向:食品科学与工程，E－mail:13262975153@ 163.com。
* 通讯作者:刘克海(1977－) ，男，博士，副教授，研究方向:中药新制剂，E－mail:khliu@ shou.edu.cn。
基金项目:上海市教育委员会重点学科建设项目(J50704) ;黑龙江省森林工业总局攻关项目(sgzjY201402)。
摘 要:采用正交实验筛选东紫苏总黄酮的提取工艺;利用清除超氧阴离子自由基(O －2·)和清除双氧水(H2O2)实验，
考察东紫苏总黄酮的抗氧化活性;通过小鼠体内碳粒廓清实验，评价东紫苏总黄酮的免疫活性。结果显示，东紫苏总
黄酮的最佳提取工艺为:料液比 1∶ 20(g /mL)、提取温度 60 ℃、回流时间 3 h;在 50～200 μg /mL的浓度范围内，东紫苏
总黄酮对 O －2·和 H2O2 的清除率分别为 26.36% ～73.94%和 48.56% ～77.39%，半数抑制浓度 IC50分别为 108.07 μg /mL
和 50.59 μg /mL;中剂量和高剂量组可显著提高小鼠碳粒廓清指数 K和吞噬指数 α。表明东紫苏总黄酮具有良好的抗
氧化和免疫活性。
关键词:东紫苏，总黄酮，抗氧化，免疫
Extraction and its antioxidant，immune activities of
total flavonoids from Elsholtzia bodinieri Vaniot
MAO Yuan1，LV Liu－zhuang1，LIU Ke－wu2，LIU Ke－hai1，*
(1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China;
2.Heilongjiang Forest By－Product and Speciality Ｒesearch Institute，Heilongjiang Provincial Key Laboratory of
Non－wood Forest Product Development，Mudanjiang 157011，China)
Abstract:The extract conditions of total flavonoids from Elsholtzia bodinieri Vaniot were optimized by designing
orthogonal test.Its antioxidant activity was assessed thorugh the superoxide anion radical and hydrogen peroxide
scavenging ratio.Its immune activity was researched by carbon clearance test.The optimal extraction conditions
were determined as follow:the extraction temperature was 60 ℃，the reflux time was 3 h，the liquid－material ratio
was 1∶ 20(g /mL).At the range of concentration of 50～200 μg /mL，the scavenging ratio for O －2· and H2O2 was
26.36%～73.94% and 50.56% ～ 77.39%，and IC50 was 108.07 μg /mL and 46.53 μg /mL，respectively.The carbon
clearance index K and phagocytic ratio α were increased significant in the high－ dose group and middle－ dose
group.Thus，total flavonoids from Elsholtzia bodinieri Vaniot possessed good antioxidant and immune activities.
Key words:Elsholtiza bodinieri Vaniot;flavonoids;antioxidant activity;immune activity
中图分类号:TS201.4 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2016)09－0085－04
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2016． 09． 008
东紫苏别名凤尾茶、野山茶、小山茶、小香薷、牙
刷草等，是唇形科香薷属的矮小半灌木状植物，主产
于我国云南、贵州、甘肃等地［1］。据报道，东紫苏是香
薷属植物中现存的唯一食药两用的植物［2］。东紫苏
外形美观，植株含挥发油，气味清香，还含有黄酮类、
甾体、萜类、酚类、鞣质、氨基酸、多肽、蛋白质、多糖、
苷类等活性成分，且含有多种有益的微量元素，具有
较高的食用、药用和观赏价值［1］。
据研究表明，东紫苏中黄酮含量丰富，高达 10%
以上，不同产地有所差异［3］。目前对东紫苏的研究多
集中在挥发油，但对其黄酮研究较少，除木犀草素和槲
皮素的抑菌活性外，其他活性尚未见报道。黄酮化合
物药理作用主要包括降血脂、抗氧化、抗炎、调节免疫、
镇痛、抗肿瘤等。本文通过正交实验提取了东紫苏的
总黄酮，并首次对其清除自由基活性、免疫活性进行研
究，为东紫苏的开发利用提供了一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
86
东紫苏 购买于云南省文山，常温避光储藏;芦
丁标准品 纯度 ＞ 96.6%，购买于 Sigma;鲁米诺 纯
度≥97%，Sigma，购买于国药集团化学试剂有限公
司;乙醇、甲醇、正丁醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化
钠、碳酸钠、碳酸氢钠、EDTA、双氧水、邻苯三酚、印
度墨水等:分析纯，购买于国药集团化学试剂公司。
ICＲ小鼠 SPF级，18～20 g，上海斯莱克实验动物
有限责任公司，合格证号:2007000577656.动物于实
验前在动物房环境中适应一周。
毛细管 100 mm，1.8～2.2 mm，购买于国药集团化
学试剂有限公司 粉碎机，FW100 型，上海安锐自动
化仪表有限公司;水浴锅 HH2 型，上海比朗仪器制
造有限公司;旋转蒸发仪 ＲE－52C 型，上海青浦沪
西仪器厂;分光光度计 PharmaSpec UV－3600，日本
shimadzu公司;酶标仪 SH－1000 型，北京华拓鸿达
科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 东紫苏总黄酮含量的测定
1.2.1.1 标准曲线的绘制 东紫苏中总黄酮含量的
测定方法采用 NaNO2 －Al(NO3)3 －NaOH 分光光度
法［4］。准确称取 10 mg 干燥的芦丁标准品于 50 mL
容量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀。分别吸取该溶液
0，1，2，3，4，5 mL 于 25 mL 容量瓶中，加入 1 mL 5%
的 NaNO2 溶液，摇匀，还原 6 min 后，加入 1 mL 10%
的 Al(NO)3 溶液，摇匀，络合 6 min 后，加入 10 mL
4%的 NaOH 溶液，摇匀，显色 15 min 后，用水定容，
继续静置 15 min，在 500 nm处测定各溶液的吸光度，
并以吸光度值(A)作为纵坐标，溶液浓度(C)作为横
坐标绘制标准曲线，得出线性方程。
1.2.1.2 样品测定 取 0.1 mL 提取液，按上述方法，
测定各提取液在 500 nm 处的吸光度。根据所得线
性方程及稀释倍数计算东紫苏中总黄酮的含量，计
算公式为:
w =
V × c·25a
m
式中:w－东紫苏中总黄酮的含量;c－根据样品吸
光度及标品线性方程得出的浓度;a－提取液的稀释
倍数;V－萃取溶剂的体积;m－东紫苏的质量。
1.2.2 东紫苏总黄酮的提取
1.2.2.1 提取流程 东紫苏洗净→烘干、剪碎→粉碎→称
量→乙醇回流→上清液→蒸干→水复溶→正丁醇萃取→正丁
醇相→蒸干→乙醇溶解→4 ℃保存［4］
1.2.2.2 提取工艺优化 采用 1.2.2.1 的提取工艺流
程，根据前期单因素实验结果选择提取温度、回流时
间和料液比 3 个因素，采用 L9(3
4)正交表按照表 1
进行实验。
1.2.3 东紫苏总黄酮抗氧化活性的研究
1.2.3.1 清除超氧阴离子自由基(O －2·)能力的测定
东紫苏总黄酮清除超氧阴离子自由基的能力通过
鲁米诺－邻苯三酚－CBS(Na2CO3－NaHCO3)体系的化
学发光法测定［5］。用 0.05 mol /L 的 NaOH 配制
0.05 mol /L的鲁米诺溶液，置于暗处保存，临用前将
其用蒸馏水稀释至 0.001 mol /L，作为溶液 A;配制
0.05 mol /L pH10.2 的 Na2CO3 － NaHCO3 缓冲液(含
0.1 mmol /L的 EDTA)作为溶液 B。将 A和 B 以体积
比为 1 ∶ 2混合，配制成鲁米诺－碳酸盐缓冲液。用
1 mmol /L的盐酸配制成 0.01 mol /L 的邻苯三酚溶
液，临用前用水将其稀释至 6.25 × 10 －4mol /L。样品用
60%乙醇稀释成 50、100、150、200 μg /mL、1 mg /mL。
测量时，样品组依次加入样品 10 μL、邻苯三酚溶液
10 μL、鲁米诺－磷酸盐缓冲液 150 μL;对照组依次加
入蒸馏水 10 μL、邻苯三酚溶液 10 μL、鲁米诺－磷酸
盐缓冲液 150 μL。在 20 ℃下启动反应，每隔 0.6s记
录一次发光强度，连续记录 30 s。
表 1 因素水平表
Table 1 Factor and level
水平
因素
A温度
(℃)
B时间
(h)
C料液比
(g /mL)
1 60 1 1∶ 10
2 70 2 1∶ 20
3 80 3 1∶ 40
1.2.3.2 清除双氧水能力(H2O2)的测定 东紫苏总
黄酮清除双氧水的能力通过鲁米诺－过氧化氢化学
发光体系测定［6］。配制 0.1 mmol /L 的鲁米诺碳酸盐
缓冲液(Na2CO3 － NaHCO3 0.05 mol /L，pH = 9.4)和
0.15 mol /L的 H2O2，将样品溶液用 60%乙醇稀释成
50、100、150、200 μg /mL、1 mg /mL。测量时，样品组依
次加入样品 10 μL、双氧水 10 μL、鲁米诺－磷酸盐缓冲
溶液 150 μL;对照组依次加入蒸馏水 10 μL、双氧水
10 μL、鲁米诺－磷酸盐缓冲溶液 150 μL。在20 ℃下，
每隔 0.6 s记录一次发光强度，连续记录 30 s。
自由基清除率计算公式为:
Ｒ =
Lc －Ls
Lc
× 100
式中:Ｒ－自由基清除率，%;Lc－对照组的发光强
度;Ls－样品组的发光强度。
1.2.4 东紫苏总黄酮免疫活性的研究 免疫活性通
过碳粒廓清实验测定［7－8］。将 24 只小鼠随机分为 4
组，每组 6 只。分别为模型对照组、黄酮低剂量组
(100 mg /kg)、黄酮中剂量组(150 mg /kg)、黄酮高剂
量组(200 mg /kg)。每天称重、灌胃提取液 1 次，模
型对照组给以生理盐水(0.2 mL /10 g)。于第 14 d给
药 1 h后，对每只小鼠尾静脉注射用生理盐水稀释 5
倍的印度墨汁(0.1 mL /10 g)，待墨汁注入，立即计
时。2 min(T1)和 10 min(T2)后，分别从每只小鼠眼
眶取血 100 μL，加到 4 mL 0.1%的 NaHCO3 溶液中，
在 660 nm处测其吸光度值，计算碳粒廓清指数 K。
然后将小鼠处死，取肝脏、脾脏，用滤纸吸干表面的
血液，称其重量，计算吞噬指数 α。计算公式如下:
K =
lgOD1－lgOD2
T2 －T1
式中:K－碳粒廓清指数;OD1、OD2 － 2 min 和
10 min时采血的吸光值;T2、T1 －两次采血的时间
差，min。
87
α =
3
槡K·
BW
LW + SW
式中:α－吞噬指数;BW－小鼠的体重，g;LW－小
鼠的肝脏重量，g;SW－小鼠的脾脏重量，g。
1.2.5 数据分析 采用 SPSS 18 软件对数据进行统计
学描述和分析，结果以珋x ± s表示，采用单因素方差分析
进行多组间均值比较，采用 Origin 8.0进行图像绘制。
2 结果与分析
2.1 总黄酮含量测定标准曲线
以干燥的芦丁为标准品，采用 NaNO2 －Al(NO3)3
－NaOH分光光度法绘制标准曲线，如图 1。回归方
程为 Y = 15.400X + 0.0128，r = 0.9989。标准曲线显
示，在 0.008～0.04 mg /mL的浓度范围内，芦丁标准品
的 500 nm处的吸光度与浓度呈良好的线性关系。
图 1 芦丁标准曲线
Fig.1 Standard curve of rutin
2.2 总黄酮提取工艺的优化
提取温度、回流时间和料液比 3 个因素正交实
验结果见表 2。由表 2 可知，对东紫苏总黄酮提取效
果的影响因素大小依次为料液比 ＞回流时间 ＞提取
温度。由表 3 可知，B、C 具有显著性差异，为影响黄
酮提取工艺的主要因素，而 A则不具有显著性意义，
为次要因素。
表 2 正交实验结果
Table 2 Ｒesult of orthogonal experiment
实验号 A B C D
提取液浓度
(mg /mL)
1 1 1 1 1 2.971
2 1 2 2 2 6.120
3 1 3 3 3 3.902
4 2 1 2 3 5.611
5 2 2 3 1 3.011
6 2 3 1 2 4.417
7 3 1 3 2 3.210
8 3 2 1 3 3.475
9 3 3 2 1 6.677
K1 12.993 11.792 10.863 12.659
K2 13.039 12.606 18.408 13.747
K3 13.362 14.996 10.123 12.988
k1 4.331 3.931 3.621 4.219
k2 4.346 4.202 6.136 4.582
k3 4.454 4.999 3.374 4.329
Ｒ 0.123 1.068 2.762 0.363
对主要因素 B、C 水平选择，从综合评分 B3 ＞ B2
＞ B1、C2 ＞ C1 ＞ C3，宜分别选 B3、C2;因素 A 影响较
小，为节约能源，应选 A1。故确定优化条件为
A1B3C2，即提取温度为 60 ℃，回流提取为 3 h，料液比
为 1∶ 20(g /mL)。
表 3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
方差来源
离差
平方和
自由度 方差 F值 显著性
A 0.027 2 0.013 0.224
B 1.849 2 0.924 15.931 *
C 14.013 2 7.006 120.793 ＊＊
D 0.207 2 0.104 1.793
误差 e(A + D) 0.234 4 0.058
注:F0. 05(2，4)= 6.94，F0. 01(2，4)= 18.00。
2.3 东紫苏总黄酮抗氧化活性
2.3.1 超氧阴离子自由基(O －2·)清除能力 在碱性
条件下，邻苯三酚发生自动氧化，产生 O －2·，O
－
2·在发
光体系中，使化学发光增效剂鲁米诺(Luminol，3－氨
基邻苯二甲酰肼)氧化，进而产生一个电子激发态
的中间产物，当其从激发态返回基态时伴随着能量
释放，产生化学冷光，用酶标仪即可测定发光强
度［5］。在发光体系中，发光的强度与 O －2·的浓度呈
正比。若样品有清除 O －2·的作用，则发光强度会下
降，由发光强度的下降趋势，可判断清除率的增加
趋势。由表 4 可知，东紫苏总黄酮的浓度越高，对
O －2·的清除率越大，在 50～200 μg /mL 的浓度范围
内，清除率为 26.36% ～73.94%，半抑制浓度 IC50为
108.07 μg /mL。表明东紫苏总黄酮对 O －2·具有较
强的清除作用。
表 4 东紫苏总黄酮对超氧阴离子自由基(O －2·)
清除率的影响(n = 4，x ± s)
Table 4 Effect of flavonoids from EBV on O －2·(n = 4，x ± s)
组别 浓度(μg /mL) 超氧阴离子清除率(%)
对照组 500 74.51 ± 1.62
样品 1 组 50 26.36 ± 4.46＊＊
样品 2 组 100 53.63 ± 5.79＊＊
样品 3 组 150 67.25 ± 1.11＊＊
样品 4 组 200 73.94 ± 1.83＊＊
注:与对照组对照，＊＊p ＜ 0.01，差异极显著;表 5 同。
2.3.2 双氧水(H2O2)清除能力 在碱性条件下，
H2O2 会氧化冷发光剂鲁米诺，产生化学发光。通过
测定发光信号的变化来检验样品对 H2O2 的清除能
力［5］。同 2.3.1，由发光强度与样品浓度的关系可知
东紫苏总黄酮对 H2O2 的清除率，由表 5 可知，东紫
苏总黄酮的浓度越高，对 H2O2 的清除率越大，并且
在 50～200 μg /mL的浓度范围内，清除率为 48.56% ～
77.39%，半抑制浓度 IC50为 50.59 μg /mL，表明东紫
苏总黄酮对 H2O2 具有较高的清除作用。
东紫苏总黄酮对 O －2·和 H2O2 均具有较好的清
除作用，表明其具有良好的抗氧化活性。
88
表 5 东紫苏总黄酮对双氧水(H2O2)
清除率的影响(n = 4，x ± s)
Table 5 Effect of flavonoids from EBV on H2O2(n = 4，x ± s)
组别 浓度(μg /mL) 双氧水清除率(%)
对照组 1 52.74 ± 7.63
样品 1 组 50 48.56 ± 0.79＊＊
样品 2 组 100 60.83 ± 2.31＊＊
样品 3 组 150 70.38 ± 1.15＊＊
样品 4 组 200 77.39 ± 1.18＊＊
2.4 东紫苏总黄酮免疫活性
碳粒廓清实验是通过测定血液中碳粒的消失速
度来反映单核巨噬细胞系统吞食异物的能力，碳粒
廓清指数 K和吞噬指数 α 越大，表明其体内免疫作
用越强［8］。由表 6 可知，相对于对照组，实验组的 K
值和 α值都有提高，并且高剂量组呈现了极显著性
差异(p ＜ 0.01)，说明东紫苏黄酮可以明显增强小鼠
腹腔巨噬细胞的吞噬功能，具有促进小鼠免疫功能
的作用。有研究表明:减少过氧化脂质 LPO 损伤，可
提高机体的免疫作用［9］。因此，推测东紫苏总黄酮的
免疫功能与其具有良好的抗氧化活性和清除自由基
能力，从而降低 LPO 损伤免疫细胞的风险有关［10］。
但其确切的作用机理还需进一步研究。
表 6 东紫苏总黄酮对小鼠巨噬细胞
吞噬功能的影响(n = 6，珋x ± s)
Table 6 Effect of flavonoids from EBV
on carbon clearance test of mice(n = 6，珋x ± s)
组别
剂量
(mg /kg) 碳粒廓清指数
K 吞噬指数 α
模型对照组 － 0.097 ± 0.0008 3.8419 ± 0.112
低剂量组 100 0.0107 ± 0.0026 3.8496 ± 0.327
中剂量组 150 0.0153 ± 0.0011* 4.7749 ± 0.394＊＊
高剂量组 200 0.0204 ± 0.0033＊＊ 5.4999 ± 0.295＊＊
注:与模型组对照，* p ＜ 0.05，＊＊p ＜ 0.01。
3 结论
本实验通过正交实验筛选了回流提取东紫苏总
黄酮的最佳工艺条件:料液比 1 ∶ 20(g /mL)、温度
60 ℃、时间 3 h，且料液比对提取效果的影响最大，其
次为时间，温度对其影响较小。此外，东紫苏总黄酮的
含量丰富，并且对超氧阴离子自由基和双氧水的清除
效果明显，IC50分别为 108.07 μg /mL 和 50.59 μg /mL，
表明东紫苏总黄酮具有良好的抗氧化作用，是一种
天然抗氧化剂。通过小鼠体内碳粒廓清实验，表明
东紫苏总黄酮可增强小鼠体液免疫，对小鼠体质有
一定的改善作用。本实验对东紫苏的进一步研究和
开发提供了理论依据，今后有必要对东紫苏黄酮的
具体成分，以及与活性相关的成分进行深入研究。
参考文献
［1］云南省植物研究所 .云南植物志［M］.北京:科学出版社，
1997，1:731.
［2］ Gong MX， Zhou GP.Textual reserch of Elsholtzia
plants.Beijing Tradit Chin Med Press，1996.
［3］陈海云，高言明 .分光光度法对凤尾茶中总黄酮的含量分
析［J］.微量元素与健康研究，2006，23(6):18－19.
［4］库咏峰 .肉桂总黄酮提取分离分析及抗氧化活性研究
［D］.广西:广西大学，2012.
［5］郭晓青，陈晓靓，杨春梅，等 .紫苏叶活性成分及抗氧化性
研究［J］.食品与机械，2014，30(4):179－185.
［6］李书艺，周玮婧，孙智达，等 .荔枝皮原花青素的体外抗氧
化活性和对 DNA 损伤的保护作用［J］.食品科学，2010，31
(1):14－18.
［7］王钦博 .桑黄抗氧化活性成分的筛选及其分离纯化［D］.
上海:上海师范大学，2011.
［8］ George A， Chinnappan S， Choudhary Y， et al.
Immunomodulatory activity of an aqueous extract of Polugonum
minus Huds on Swiss albino mice using carbon clearance assay
［J］.Asian Pacific Journal of Tropical Disease，2014，4(5):
398－400.
［9］罗千古，周玖瑶，李毓祺，等 .黄芪丹参提取液对小鼠免疫
系统的影响［J］.中国医药导报，2011，8(2):23－24.
［10］储岳峰 .九种中药成分的免疫增强活性及其作用机理研
究［D］.南京:南京农业大学，
檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾
2003.
(上接第 84 页)
性［J］.中国油脂，2011，36(12) :73－76.
［14］Sanford L，Kowalski S，Ｒonning C，et al.Glycoalkaloid
contents in tubers from Solanum tuberosum populations selected
for potato leafhopper resistance［J］.American Journal of Potato
Ｒesearch，1992，69:693－703.
［15］孙翔宇，高贵田，段爱莉，等 .多不饱和脂肪酸的研究进
展［J］.食品工业科技，2012，33(7):418－423.
［16］姜伟，石红旗，衣丹，等 .共轭亚油酸血脂调节作用的研
究［J］.中国粮油学报，2006，21(3):160－162.
［17］李志香，沈翠平 .多不饱和脂肪酸对人体的作用［J］.生物
学通报，1998，33(1) :9－10.
［18］周远明，郑国生，马传利 .牡丹雄蕊油的提取及化学成分
研究［J］.中国粮油报，2015，30(3) :59－61.
［19］杨得坡，李杰梅，曾晓晖，等 .共轭亚油酸的抗氧化活性
及其抗氧化剂筛选［J］.中国食品添加剂，2007，(2):136－139.
［20］朱保忠，李琳 .α－亚麻酸与抗氧化剂联用对果蝇寿命及
小鼠抗氧化能力的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，
2008，12(7):1264－1267.