全 文 ：白花蛇舌草中车叶草苷的提取分离及含量测定的研究
高丹 ,赵呈呈 ,李海燕 ,金牮 ,金向群＊
(吉林大学药学院 ,长春 130021)
摘要　目的:建立白花蛇舌草中车叶草苷的提取分离工艺及车叶草苷的高效液相色谱含量测定方法。方法:用硅胶柱层析分
离白花蛇舌草醇提取液中的车叶草苷 ,以甲醇 -乙酸乙脂 -水(3∶3∶2;4∶3∶2;5∶3∶2;6∶3∶2;7∶3∶2;8∶3∶2;9∶3∶2;10∶3∶2)进行
洗脱。将馏分(甲醇 -乙酸乙脂 -水比例 4∶3∶2;5∶3∶2;6∶3∶2)合并 ,经几次硅胶柱层析后再次合并相似馏分 , 回收洗脱剂 ,得
无色结晶 , 即车叶草苷;将分离得到的车叶草苷作为对照品 ,使用 HPLC法对白花蛇舌草中车叶草苷的含量进行测定。色谱柱
为 KromasilC
18
(4.6 mm×250 mm, 5 μm)柱 , 流动相为乙腈 -0.2%磷酸(5∶95), 流速 0.8 mL· min-1 , 检测波长 240 nm, 柱温
30.0 ℃。结果:所得车叶草苷纯度在 99%以上;车叶草苷进样量在 0.4 ～ 2.0 μg范围内线性关系良好(r=0.9998), 平均回收
率(n=6)为 97.7%。结论:该方法结果准确 、简便 ,为车叶草苷的提取分离及白花蛇舌草含量测定提供了新方法。
关键词:白花蛇舌草;车叶草苷;提取分离工艺;高效液相色谱法;含量测定
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2010)09-1654-04
StudyonextractionandisolationofasperulosidefromHedyotisdifusa
Wild.andassaybyHPLC
GAODan, ZHAOCheng-cheng, LIHai-yan, JINJian, JINXiang-qun＊
(PharmaceuticalColegeofJilinUniversity, Changchun130021, China)
Abstract　Objective:ToestablishamethodofextractionandisolationofasperulosidefromHedyotisdifusaWild.
andassaybyHPLC.Methods:Gelsilicacolumnchromatographywasselectedtoisolateasperulosidefromtheex-
tractsofHedyotisdifusa;Theeluantwasmethanol-ethylacetate-water(3∶3∶2;4∶3∶2;5∶3∶2;6∶3∶2;7∶3∶2;8∶
3∶2;9∶3∶2;10∶3∶2);Thefractionofdistilatewithmethanol-ethylacetate-water(4∶3∶2;5∶3∶2;6∶3∶2)were
incorporate.Theworkofabove-mentionedwasrepeated.Theeluantwasreclaimed, andthecolourlesscrystalthat
wasasperulosidewasobtained.Theasperulosideabovewasusedasreferencesubstance, andHPLCmethodwasused
forassayingtheasperulosidecontentfromHedyotisdifusa.TheseparationwasperformedonaKromasilC18(250
mm×4.6 mm, 5 μm)columnwithacetonitrile-0.2% aqueousphosphoricacid(5∶95)asmobilephaseataflow
rateof0.8mL· min-1.Thedetectionwavelengthwassetat240nmandthecolumntemperaturewasmaintainedat
30 ℃.Results:Thecolourlesscrystalwasasperulosidebyassessment, andthepuritywasmorethan99%.Theline-
arrangeofasperulosidewas0.4-2.0 μg(r=0.9998), whiletheaveragerecovery(n=6)was97.7%.Conclu-
sion:Themethodisaccurateandconvenient.Itisanewmethodontheextractionandassayofasperuloside.
Keywords:HedyotisdifusaWild.;asperuloside;extractionandabstractiontechnology;HPLC;asay
白花蛇舌草始载于 《广西中药志 》,为茜草科
(Rubiaceae)一年生草本植物白花蛇舌草(Hedyotis
difusaWild.)的全草 ,主要含有蒽醌类 、萜类 、甾
类 、有机酸类 、多糖类 、环烯醚萜类等 [ 1] 。然而 ,白
花蛇舌草还未收载入中国药典 ,前期工作中有人采
用 TLC法 [ 2]和 HPLC法[ 3 ～ 5]对其中的齐墩果酸 、熊
果酸 2种有机酸含量进行测定 ,运用 HPLC测定车
叶草苷成分未见报道。
车叶草苷为环烯醚萜类化合物 ,具有抗菌 、抗氧
化 、抗诱变 ,抗肿瘤 [ 6] 、消炎镇痛等广泛的药理作
用。本文建立白花蛇舌草中车叶草苷的提取分离工
艺及车叶草苷的高效液相色谱含量测定方法 ,对白
花蛇舌草进行含量测定的评定。
—1654— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(9)
＊ 通讯作者　Tel:(0431)85619662;E-mail:jinxq@jlu.edu.cn
DOI :10.16155/j.0254-1793.2010.09.035
1　仪器与试剂
YF-40型无压循环煎药机 (东华医疗设备有
限责任公司);BC-R1001旋转蒸发器(上海贝凯生
物化工设备有限公司);HH-2数显恒温水浴锅(金
坛市江南仪器厂);101-A型数显电热鼓风干燥箱
(上海沪南仪器联营厂);ZF-Ⅰ型三用紫外分析仪
(上海顾村光电仪器厂);JT2001电子天平(上海精
天电子仪器有限公司), AB204-N分析天平(梅特
勒 -托利多仪器有限公司);DRX-500型核磁共振
仪(美国 Bruker公司);LC-10AT高效液相色谱仪
(日本岛津), SPD-10A紫外检测器(日本岛津),
2010双通道色谱工作站(浙江大学);KQ-250D数
控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
白花蛇舌草购于长春市宏检药材公司 ,经本院生
药教研室王广树副教授鉴定为白花蛇舌草(Hedyotis
difusaWild.);水(重蒸水 ,临用前制备),氘代水(核
磁用),乙腈(色谱纯),无水乙醇 、甲醇 、乙酸乙脂 、磷
酸等(分析纯);柱层析用硅胶(200 ～ 300目)、薄层层
析用硅胶 G(青岛海化工厂)。
2　方法与结果
2.1　车叶草苷的提取制备　将白花蛇舌草用 60%乙
醇回流提取 2次 ,每次 3 h,加醇量为药材的 8倍 ,合
并提取液 ,滤过 ,滤液回收乙醇至无醇味 ,得浓缩液备
用;将浓缩液中加入 2倍体积水 ,放置 24 h,过滤 ,将
滤液浓缩 ,用石油醚萃取 ,将石油醚层弃去 ,将水层浓
缩 ,减压干燥(控制真空度≤0.08MPa;温度:80 ～ 85
℃),得粗提物。将粗提物溶于甲醇 ,与等量硅胶拌
样 ,上样于硅胶柱 ,以甲醇 -乙酸乙脂 -水不同比例
(极性递增梯度如下:3∶3∶2;4∶3∶2;5∶3∶2;6∶3∶2;
7∶3∶2;8∶3∶2;9∶3∶2;10∶3∶2)进行洗脱 。薄层色谱
跟踪 ,合并相似馏分。合并用比例为 4∶3∶2;5∶3∶2;
6∶3∶2的甲醇 -乙酸乙脂 -水洗脱的馏分 ,再经几
次硅胶柱层析后再次合并相似馏分 ,回收洗脱剂 ,得
无色结晶。
2.2　车叶草苷的结构确定　“2.1”项下制备的化
合物为无色针晶 ,薄层紫外灯下呈现暗斑 , 10%的硫
酸乙醇显蓝色。结合所做的1HNMR和 13CNMR谱图
数据与文献相比较 ,发现该化合物的谱图数据与已
知化合物车叶草苷的谱图数据基本一致 ,所以确定
该化合物为车叶草苷 ,分子式为 C18 H22O11。1 HNMR
谱图显示了葡萄糖的质子信号 δ3.23 ～ 4.78,同时
还显示了 4位取代 , 7, 8位为双键的环烯醚萜的特
征质子信号 δ5.98(1H, d, J=1.5 Hz, H-1), δ
7.45(1H, d, J=2.1Hz, H-3), δ5.35(1H, brd, J=
6.5Hz, H-6), δ5.77(1H, brs, J=1.6Hz, H-7),
δ4.92(1H, dd, J=14.3Hz, 1.3 Hz, H-10), δ4.78
(1H, dd, J=14.3Hz, 1.2 Hz, H-10)。将所得到化
合物的图谱数据与文献报道的车叶草苷 (asperulo-
side)数据 [ 7]相比较 ,结果基本一致 ,推断此化合物
为车叶草苷。见图 1 ～ 3及表 1。
图 1　车叶草苷结构式
Fig1　Structureformulaofasperuloside
图 2　车叶草苷 1HNMR谱图
Fig2　1HNMRspectrumofasperuloside
图 3　车叶草苷 13CNMR谱图
Fig3　13CNMRspectrumofasperuloside
—1655—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(9)
表 1　化合物与文献 13C-NMR(D2O)谱数据比较
Tab1　Comparisonof13C-NMRspectraldata
betweencompoundandliterature
No. 化合物(compound)δC 文献(literature)δC
C-1
C-3
C-4
C-5
C-6
C-7
C-8
C-9
C-10
C-11
C-12
C-13
C-1′
C-2′
C-3′
C-4′
C-5′
C-6′
95.31
151.82
108.45
41.36
85.68
127.92
145.06
44.72
63.65
168.95
22.92
172.67
103.92
75.30
79.26
71.88
76.38
63.65
95.4
152.4
107.2
38.4
88.8
130.7
144.7
45.9
64.0
170.8
22.7
172.5
101.1
75.1
78.8
72.1
78.0
63.2
2.3　HPLC法测定白花蛇舌草中车叶草苷含量
2.3.1　供试品溶液制备　取白花蛇舌草 0.90 g,用
60%乙醇回流提取 2次 ,每次 3 h,加醇量分别为药
材的 8倍 ,合并提取液 ,滤过 ,滤液回收乙醇至无醇
味 ,蒸干 ,用无水乙醇约 80mL移至 100mL量瓶中 ,
超声(250W, 40kHz)30min,取出放至室温 ,以无水
乙醇定容至 100mL。以 0.45μm微孔滤膜滤过 ,取
续滤液作为供试品溶液。
2.3.2　对照品溶液　取车叶草苷对照品(按 “ 2.1”
项下方法自制 ,由 HPLC面积归一化法标定纯度大
于 99%),在 60 ℃减压干燥 4 h,精密称取适量 ,加
无水乙醇制成每 1 mL含 150 μg的对照品溶液 。
2.3.3　色谱条件　采用大连中汇达科学仪器公司
KromasilC18(4.6 mm×250mm, 5μm)色谱柱 ,以乙
腈 -0.2%磷酸 (5∶95)为流动相 ,流速 0.8 mL·
min-1 ,检测波长 240 nm, 柱温 30.0 ℃, 进样量
10 μL。在上述色谱条件下 ,车叶草苷与其他成分分
离良好 ,见图 4。
2.3.4　线性关系考察　精密称取在 60 ℃减压干燥
4 h的车叶草苷对照品 10.0 mg,置 50 mL量瓶中 ,加
无水乙醇至刻度 ,摇匀 ,制成每 1 mL含 0.2 mg的溶
液 ,精密吸取此溶液 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0mL,分别
置 10 mL量瓶中 , 加无水乙醇至刻度 , 摇匀。按
“2.3.3”项下色谱条件分别平行进样 3次 ,进行测定。
以车叶草苷对照品进样量 X(μg)为横坐标 ,以峰面积
图 4　流动相(A)、对照品(B)及样品(C)色谱图
Fig4　Chromatogramsofmobilephase(A), referencesubstance(B), and
sample(C)
1.车叶草苷(asperuloside)
值 Y为纵坐标作图 ,所得回归方程为:
Y=1.196×106X+2.470×104　　 r=0.9998
表明车叶草苷进样量在 0.4 ～ 2.0μg范围内线性关
系良好。
2.3.5　精密度考察　精密吸取供试品溶液 10 μL,
连续进样 6次 ,计算车叶草苷峰面积的 RSD(n=6)
为 0.53%,表明仪器精密度良好 。
2.3.6　稳定性试验　将供试品溶液在室温分别放
置 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24h后 ,按 “2.3.3”项下色谱条
件进样 ,测定峰面积 ,计算出 RSD(n=7)为 0.77%,
说明供试品溶液在 24 h内稳定 。
2.3.7　重复性试验　取同一样品 6份 ,精密称定 ,
按照 “2.3.1”项下方法制备供试品溶液 ,按 “2.3.3”
项下色谱条件进样测定 。结果样品中车叶草苷含量
平均值(n=6)为 1.49%, RSD为 0.68%,表明本方
法重复性良好 。
2.3.8　加样回收率试验　取已测知车叶草苷含量
(1.49%)的白花蛇舌草药材 0.45 g6份 ,分别精密
加入车叶草苷对照品约 6.8 mg,按照 “2.3.1”项下
—1656— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(9)
方法制备供试溶液 ,按 “ 2.3.3”项下色谱条件进样
测定车叶草苷的量 ,计算回收率 ,结果平均回收率
(n=6)为 97.7%, RSD为 1.6%。
2.3.9　样品测定　精密称取白花蛇舌草药材 3份 ,
按照 “2.3.1”项下方法制备供试品溶液 ,按 “2.3.3”
项下色谱条件进样测定 ,采用外标一点法测定含量 。
结果表明:白花蛇舌草中车叶草苷的平均含量(n=
3)为 1.48%, RSD为 2.1%。
3　讨论
3.1　提取条件的选择　考察了不同溶剂(50%乙醇 、
60%乙醇 、70%乙醇 、80%乙醇)、溶剂倍数(6, 8, 10
倍)、提取次数(1, 2, 3次)、提取时间(1, 2, 3 h)下的
提取效率 ,发现 8倍 60%乙醇回流提取 2次 ,每次
3 h,车叶草苷提取效率最高。
3.2　分离纯化工艺的优化　实验中发现醇提浓缩
液直接干燥上硅胶柱分离纯化困难 ,小极性杂质太
多 。用石油醚萃取后可除去此部分小极性杂质 。
3.3　车叶草苷的鉴定 　谱图数据中 13 C-NMR
(D2O)δC=22.92,可能是连羰基的甲基碳信号;δC=
75.30, 79.26, 71.88, 76.38, 63.65, 95.31,可能是葡萄
糖碳信号 ,通过这些特征性碳信号 ,比照文献数据 ,能
较快捷地鉴定车叶草苷的结构。
3.4　检测波长的选择　经 200 ～ 400 nm波长扫描 ,
240nm处车叶草苷有最大吸收且干扰峰较少 ,故选
择 240nm作为检测波长。
3.5　流动相的选择　考察流动相甲醇 -水(10∶90)、
乙腈 -水(10∶90)、甲醇 -0.2%磷酸(10∶90)、乙腈
-0.2%磷酸(10∶90),发现对照品在乙腈 -0.2%磷
酸(10∶90)条件下 9min左右出峰 ,且峰形较好 ,但发
现样品干扰峰太多 ,调整乙腈 -磷酸比例为 5∶95,车
叶草苷的出峰时间在 20 min左右 ,并且在该色谱条
件下 ,峰形较好 ,没有其他峰干扰 。
3.6　小结　本文通过对白花蛇舌草提取分离得到
车叶草苷 ,并对白花蛇舌草中车叶草苷的含量进行
了 HPLC测定。实验结果表明:该法线性关系良好 ,
回收率较高 ,具有分析速度快 、灵敏度高 、分离性能
好的特点 ,因此可为白花蛇舌草药材质量控制和评
价提供分析方法。
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(本文于 2009年 10月 29日收到)
—1657—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(9)