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彩叶草的组织培养快繁技术研究



全 文 :彩叶草的组织培养快繁技术研究
谢 林 1 ,邓群仙 2* ,李 洪 2 (1.四川农业大学生命理学院 ,四川雅安 625014;2.四川农业大学园艺学院 ,四川雅安 625014)
摘要 [目的 ]建立彩叶草快速繁殖体系。[方法]以绯巫彩叶草的茎段为外植体 ,对彩叶草增殖、生根及组培苗移栽的最适培养基及生
长情况进行研究。 [结果]绯巫彩叶草芽苗增殖的最适培养基为 MS+BA1.50 mg/L+NAA 0.05mg/L+水解酪蛋白 0.40g/L+蔗糖
30.0g/L,植株生长良好 ,成活率达 100.0%, 增殖倍数达 8.65;生根培养适宜的培养基为 1/2MS+NAA 0.10 ~ 0.50 mg/L, 生根率达
100.0%,平均不定根根数达 12.95~ 17.88条;生根培养基中用白糖代替蔗糖作碳源的外植体生根率达 100.00%,根多而长 ,植株生长良
好;试管苗移栽到腐叶土中成活率为 92.86%。 [结论 ]该研究结果可为建立彩叶草大规模工厂化育苗体系提供依据。
关键词 彩叶草;组织培养;增殖;生根;移栽
中图分类号 Q943.1  文献标识码 A  文章编号 0517-6611(2010)20-10547-03
StudyontheTissueCultureandRapidPropagationofColeusblumei
XIELinetal (ColegeofLifeandNaturalScience, SichuanAgriculturalUniversity, Ya an, Sichuan625014)
Abstract [ Objective] TheaimwastoestablisharapidpropagationsystemofColeusblumei.[ Method] StemofColeusblumei` Feiwu were
usedasexplants, theoptimummediaandgrowthsituationsoftheproliferation, rootingculture, andtransplantationofColeusblumei`Feiwu were
studied.[ Result] TheoptimummediumforshootsproliferationwasMS+1.50mg/LBA+0.05 mg/LNAA+0.40 g/Lcaseinhydrolysate+
30.00g/Lsucrose, thesurvivalratewas100.00%, multiplicationcoeficientwas8.65 andtheshootsgrowwel.Thesuitablerootingmedium
was1/2MS+ 0.10-0.50mg/LNAA, therootingratewasupto100%andeachshootcouldproduce13-17roots.Thewhitesugarwasusedas
carbonsourceinsteadofsucrosecouldmakeshootsproducemoreandlongrootswiththerootingratewas100.00% , theplantletsurvivalrate
was92.86%whentheplantletsweretransplantedintorotenleafsoil.[ Conclusion] Thisstudycouldprovidetheoreticalandtechnicalbasisfor
establishingalargeindustrialseedingsystemofColeusblumei.
Keywords Coleusblumei;Tissueculture;Propagation;Rooting;Transplanting
作者简介 谢林(1959-),女 ,四川成都人 ,中级实验师 ,从事电镜技术
研究。 *通讯作者。
收稿日期  2010-05-19
  彩叶草(ColeusblumeiBenth.)又名斑叶洋紫苏 、锦紫苏 、
五色草 、老来变 ,为唇形科鞘蕊花属多年生常绿草本观叶植
物 ,常作一 、二年生栽培。彩叶草叶面色彩斑斓 ,为主要的观
赏部位 ,以绿或紫红为基色 ,缀以或黄 、或红 、或橙 、或紫等多
种斑纹 ,或几色同在 ,色彩对比鲜明 ,观赏价值极高 ,是优良
的花坛 、室内盆栽与地栽花卉 [ 1-3] 。主要用于夏秋季节专用
盆栽或地栽花坛布置 ,同时也用作切花或配置花篮;曾入选
为群众喜爱的十大奥运花卉之一 [ 4] 。彩叶草对高温和日照
均有较强的忍耐力 [ 1-2] ,位列专家推荐的北京地区抗性较强
的 20种奥运花卉之一 [ 4] ,是环境绿化与家居美化的重要花
卉植物 [ 3] 。彩叶草品种繁多 ,主要是叶色 、叶形 、叶面图案都
富有特点和较高观赏价值的杂种彩叶草 [ 4] 。彩叶草通常采
用播种和扦插繁殖 [ 2 , 4-5] 。播种繁殖需年年购种 ,成本较高;
而扦插繁殖易受季节限制 ,影响繁殖系数。利用植物组织培
养的方法能够在较短时间内获得大量与母本性状一致的健
壮苗 ,可随时满足市场的需求。由于有机氮对很多植物组织
的生长有着良好的促进作用 ,而水解酪蛋白是以天然牛奶蛋
白为原料 ,含有 18种游离氨基酸。因此它常用于植物组织
培养中 [ 6] 。近年来在植物工厂化育苗中 ,为降低成本 ,已兴
起白糖代替蔗糖 [ 7-9] ,甚至无糖培养的研究热点 [ 10-13] 。目
前 ,彩叶草组织培养获得成功的报道并不多 [ 14-17] , 而关于水
解酪蛋白(CH)和蔗糖浓度以及白糖替代蔗糖对彩叶草芽增
殖的影响尚未见报道。
笔者从彩叶草 F1代种子培养得到无菌苗 ,以其带芽茎
段为外植体 ,研究了 BA、NAA、蔗糖及 CH浓度对彩叶草芽苗
增殖的影响 ,同时探讨了 NAA不同浓度及以食用白糖替代
分析纯蔗糖诱导彩叶草的生根效应 ,并探索了彩叶草组培苗
的移栽基质 ,以期筛选出彩叶草组培快繁的较优增殖和生根
培养基 ,为彩叶草的低成本快繁和大规模工厂化生产提供科
学依据 。
1 材料与方法
1.1 材料 供试品种为绯巫彩叶草 ,以其 F1代种子(购自
农友种苗股份有限公司)建立的无菌植株的带芽茎段为外
植体。
1.2 方法
1.2.1 无菌材料建立及芽苗增殖培养。彩叶草种子经 45
℃热水浸种 30 min后 ,用 70%酒精浸泡 30 s,再用 0.1%
HgCl2消毒 10 min,无菌水冲洗多次后 ,均匀接种于 MS+蔗
糖 20g/L+琼脂 6.0 g/L的诱导培养基上培养 21 ~ 28 d。待
彩叶草无菌植株长到一定高度后 ,剪取带 1个节位 ,长约 1.0
~ 1.5 cm的茎段作为增殖培养的外植体。增殖培养以 MS
为基本培养基 ,添加琼脂 6.0 g/L, pH值调至 5.8;以 BA、
NAA、蔗糖 、水解酪蛋白(CH)为因素 ,各因素设置 4个浓度
水平 ,采用 L16 (45)正交设计(表 1)。每处理接种 30个外植
体 ,重复 3次。
1.2.2 生根培养。选取增殖培养中生长健壮 ,长 2 cm以上
的无根苗作为外植体。以 1/2MS为基本培养基 ,添加蔗糖
20.0 g/L、琼脂 6.0g/L, pH值调至 5.8。生长素 NAA浓度设
置为:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L。简化生根培养基为 1/2
MS+NAA0.3 mg/L+20.0 g/L食用白糖。每处理接种 30
个外植体 ,重复 3次。
1.2.3 炼苗与移栽。当彩叶草组培苗不定根较多 ,根长为
3.0cm左右时 ,于培养室内松瓶塞炼苗 7 d。取出组培苗用
流水清洗外植体上残留的培养基 ,将其移栽入事先已消毒的
基质中 。移栽使用 4种基质:腐叶土 、蛭石 +腐叶土(体积
比 1∶1)、珍珠岩 +腐叶土(体积比 1∶1)、蛭石 +珍珠岩 +腐叶
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(20):10547-10549 责任编辑 张彩丽 责任校对 卢瑶
土(体积比 1∶1∶1)。所有基质均用 50%多菌灵 800倍液消
毒 。每种基质移栽组培苗 35株 ,重复 3次。
彩叶草组培苗移栽 7 d内覆盖白色塑料薄膜以保持较
高的空气湿度 , 7 d后去掉薄膜 ,注意遮阴保湿;移栽 14 d后
每 7 d喷施 1次 1 000倍的杨康微生物液体有机肥 ,每 7d转
盆 1次 ,使彩叶草能充分接受光照 。
1.3 培养条件 以上培养温度为(26±2)℃,光照时间 14
h/d,光照强度为 2 000 lx。
1.4 调查项目 增殖培养 45 d后统计各处理外植体的成活
率 、萌芽率及增殖倍数 ,生根培养 30 d后统计各处理的生根
率 、根数 、根长 、新梢数及植株生长量 ,移栽 60 d后统计各基
质的植株成活率 、新梢数及植株生长量。
1.5 数据处理 试验数据采用 DPSv6.55统计软件进行统
计分析 , 用 Duncan新复极差法进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 绯巫彩叶草芽苗增殖培养 将已萌发的腋芽剪切成小
段后接种至添加不同浓度 BA、NAA、蔗糖及 CH的增殖培养
基上 ,培养 21 ~ 28 d时观察发现 ,无糖(蔗糖浓度为 0)培养
基中的外植体陆续失绿变黄死亡 ,同时不同浓度蔗糖培养基
中外植体叶片的红色彩斑面积差异明显(图 1)。培养 45d
各处理外植体的成活及芽苗增殖情况差异显著(表 1)。统
计分析表明 ,在彩叶草芽增殖培养中 , BA、NAA、蔗糖及水解
酪蛋白对外植体的成活及芽苗增殖的影响均有极显著作用;
其中影响因素最大的是蔗糖 ,其次为 BA,而水解酪蛋白的作
用相对较小。
多重比较结果显示 ,在一定范围内随着 BA浓度的升
高 ,彩叶草茎段外植体成活率 、腋芽萌发率和芽苗增殖倍数
 注:a.培养基为 MS+BA2.0mg/L+NAA 0.1 mg/L+CH 0.8
g/L+蔗糖 10.0g/L;b.培养基为 MS+BA1.5mg/L+NAA
0.05mg/L+CH0.4g/L+蔗糖 30.0g/L。
 Note:a.MSwithBA2.0mg/L, NAA 0.1mg/L, CH 0.8g/Land
Sucrose10.0 g/L;b.MSwithBA 1.5 mg/L, NAA 0.05
mg/L, CH 0.4g/Landsucrose30.0g/L.
图 1 绯巫彩叶草的增殖情况
Fig.1 ThemultiplicationresultsofColeusblumei`Feiwu
均有明显升高 ,在 BA浓度为 1.5mg/L时达到最大值 ,当 BA
浓度为 2.0mg/L时则开始抑制彩叶草芽苗的增殖;培养基
中添加 NAA0.05~ 0.20mg/L和水解酪蛋白 0.4g/L均显著
促进彩叶草腋芽的萌发和生长;增殖培养基中随蔗糖浓度增
加 ,彩叶草茎段外植体的成活率和芽苗增殖倍数均升高 ,同
时叶片彩斑面积扩大 ,植株长势良好(表 2)。因此 ,在彩叶
草芽苗增殖培养中 ,为有效促进更多腋芽萌发 ,提高组培苗
质量 ,蔗糖以较高浓度 30.0g/L为好。
综合表 1和统计分析结果 ,培养基 MS+BA1.5mg/L+
NAA0.05 mg/L+CH0.4g/L+蔗糖 30.0 g/L的增殖效果
最好 ,适宜绯巫彩叶草芽苗增殖(图 1)。
表 1 不同 BA、NAA、CH及蔗糖浓度组合对绯巫彩叶草芽增殖的影响
Table1 EfectsofdifferentconcentrationsofBA, NAA, CHandsucroseonthebudmultiplicationofColeusblumei`Feiwu
组合号
No.of
combinations
因素
BA∥mg/L NAA∥mg/L 蔗糖∥g/LSucrose CH∥g/L
成活率∥%
Survivalrate
萌芽率∥%
Germinationrate
增殖倍数
Multiplicationtimes
1 0.5 0 0 0 26.77e 50.00d 1.69g
2 0.5 0.05 10.0 0.2 98.25a 98.25ab 3.46e
3 0.5 0.10 20.0 0.4 100.00a 100.00a 3.37ef
4 0.5 0.20 30.0 0.8 97.82a 97.82ab 3.96de
5 1.0 0 10.0 0.4 97.73a 100.00a 5.30c
6 1.0 0.05 0 0.8 49.02d 76.00c 2.40g
7 1.0 0.10 30.0 0 100.00a 100.00a 6.51b
8 1.0 0.20 20.0 0.2 100.00a 100.00a 4.73cd
9 1.5 0 20.0 0.8 98.15a 100.00a 7.81a
10 1.5 0.05 30.0 0.4 100.00a 97.92ab 8.65a
11 1.5 0.10 0 0.2 84.31b 90.70b 2.53fg
12 1.5 0.20 10.0 0 100.00a 100.00a 4.82cd
13 2.0 0 30.0 0.2 100.00a 100.00a 4.44cd
14 2.0 0.05 20.0 0 100.00a 100.00a 5.23c
15 2.0 0.10 10.0 0.8 100.00a 100.00a 4.90c
16 2.0 0.20 0 0.4 78.00c 70.02c 2.33g
 注:不同小写字母表示在 0.05水平有差异。下同。
 Note:Diferentsmallletersindicatediferenceat0.05level.Thesameasbelow.
10548           安徽农业科学                         2010年
表 2 不同浓度蔗糖对绯巫彩叶草增殖培养的影响
Table2 Effectsofdifferentconcentrationsofsucroseonthemultipli-
cationcultureofColeusblumei`Feiwu
蔗糖
g/L
Sucrose
成活率
%
Survivalrate
增殖倍数
Multiplication
times
植株长势
Growthvigor
ofplantlets
0 59.53b 2.24d 较弱 ,无彩斑
10.0 99.00a 4.62c 弱 ,无彩斑
20.0 99.54a 5.29b 壮 ,少量彩斑
30.0 99.46a 5.89a 较壮 ,大量彩斑
2.2 绯巫彩叶草生根培养 表 3结果显示 ,在蔗糖 20 g/L、
NAA0.1~ 0.5 mg/L的生根培养基中 ,绯巫彩叶草芽苗生根
率均高达 100.0%,不定根多且长 ,生根效果好 ,并且植株健
壮 ,萌发新梢多 ,叶片彩斑明显。生根培养基中以食用白糖
替代分析纯蔗糖 ,芽苗生根率仍高达 100.0%,平均根数 15
条 ,根长 5.17cm,植株平均生长量 2.98 cm,平均萌发新梢 5
个 ,植株生长良好 ,叶片彩斑明显(图 2),表明在绯巫彩叶草
生根培养中 ,用白糖作碳源同样可行 ,并能降低成本 。
图 2 绯巫彩叶草在生根培养基 1/2MS+NAA0.3mg/L+白糖
20.0g/L中的生根情况
Fig.2 TherootingresultofColeusblumei`Feiwu in1/2MS
withNAA0.3mg/Landwhitesugar20.0g/L
表 3 不同浓度 NAA对绯巫彩叶草生根的影响
Table3 EffectsofdiferentconcentrationsofNAAontherootingofColeusblumei`Feiwu
NAA
mg/L
生根率∥%
Rooting
rate
根数
Number
ofroots
根长∥cm
Length
ofroot
植株生长量∥cm
Growthquantity
ofplants
新梢数
Numberof
newshoots
0.1 100.0a 16.29a 4.37ab 3.62a 9.09ab
0.2 100.0a 15.18a 3.99b 2.65ab 8.75ab
0.3 100.0a 17.88a 4.17ab 2.65ab 9.14a
0.4 100.0a 12.95a 5.78a 2.91ab 6.57ab
0.5 100.0a 14.06a 5.75ab 2.48b 5.29b
2.3 绯巫彩叶草组培苗移栽 绯巫彩叶草组培苗移栽入不
同基质中的成活情况差异显著(表 4)。移栽至腐叶土中的
植株成活率最高 ,为 92.86%,而当基质为腐叶土与等体积珍
珠岩或蛭石混合时 ,有近 40%的植株死亡。移栽成活的彩叶
草组培苗在 4种基质中均生长良好 ,株形丰满 ,茎粗叶大 ,并
呈现大面积绯红色彩斑(图 3)。
表 4 不同基质对绯巫彩叶草组培苗移栽的影响
Table4 EffectsofdiferentmatrixonthetransplantationofColeus
blumei`Feiwu plantlets
基质Matrix
成活率∥%Survivalrate
植株生长量∥cmGrowthquantityofplants
新梢数Numberofnewshoots
腐叶土 Humussoil 92.86a 5.88a 9.38ab
蛭石 +腐叶土(体积比 1∶1) 62.86c 6.99a 9.29ab
Vermiculite+humussoil(V∶V=1∶1)
珍珠岩 +腐叶土(体积比 1∶1) 64.29c 5.41a 10.72a
Perlite+humussoil(V∶V=1∶1)
蛭石 +珍珠岩 +腐叶土(体积比 1∶1∶1) 84.29b 5.89a 8.00b
Vermiculite+perilte+humussoil(V∶V∶V=1∶1∶1)
3 小结与讨论
试验结果表明 ,在绯巫彩叶草芽苗增殖培养中 ,对外植
体的成活及芽苗增殖影响最大的是蔗糖 ,其次为 BA。芽苗
增殖以较高浓度的蔗糖 、细胞分裂素 、水解酪蛋白和较低浓
度的生长素配合使用效果较好 ,低浓度的蔗糖或无糖均不利
于彩叶草芽苗增殖和彩斑形成 ,而过高浓度的细胞分裂素
(BA2.0mg/L)则表现为抑制彩叶草芽苗的增殖。绯巫彩叶
草芽苗增殖效果最好的培养基是 MS+BA1.5 mg/L+NAA
图 3 移栽成活的绯巫彩叶草组培苗(60d)
Fig.3 ThetransplantedplantletsofColeusblumei`Feiwu
0.05 mg/ L+CH0.4 g/L+蔗糖 30.0 g/L。绯巫彩叶草生根
培养中用食用白糖替代分析纯的蔗糖 ,外植体在生根 、萌发
新梢及形成彩斑等方面均表现良好 ,与蔗糖效果相近 ,但食
用白糖价格仅为蔗糖的 1/10。因此 ,使用白糖代替蔗糖为彩
叶草组培苗低成本快繁 ,工厂化生产 ,提供了一条经济可行
的途径 。在彩叶草的增殖培养中是否同样可用白糖代替蔗
糖 ,值得进一步探讨。
绯巫彩叶草试管苗移栽死亡主要集中在前 10d内 ,表现
(下转第 10559页)
1054938卷 20期                谢林等 彩叶草的组织培养快繁技术研究
 注:M为MarkerDL5000;1~ 5为 KI法提取的 DNA条带。
 Note:M.MarkerDL5000;1-5.ThebandsofDNAextractedbyKI
method.
图 5 KI法提取DNA电泳图
Fig.5 ElectrophoretogramofDNAextractedbyKImethod
 注:M为MarkerDL1000;1~ 4为 KI法提取的 DNA扩增条带。
 Note:M.MarkerDL1000;1-4.TheamplicationbandsofDNAextrac-
tedbyKImethod.
图 6 KI法提取的 DNA扩增结果
Fig.6 TheamplificationresultsofDNAextractedbyKImethod
的完整性 [ 9] 。该试验将采集来的紫红丝膜菌先用液氮研磨处
理 ,然后分装 ,超低温(-80 ℃)保存 ,达到了减轻反复冻融导
致 DNA降解的目的。
DNA的提取方法主要有十二烷基硫酸钠(SDS)法和十六
烷基三甲基溴化铵(CTAB)法 ,其中 SDS是一种阴离子去垢
剂 ,在高盐环境下使蛋白质变性 ,从而裂解细胞 ,使其释放出
DNA;CTAB是一种阳离子去污剂 ,它既可以裂解细胞 ,又可以
与 DNA形成复合物。当处于低盐浓度时 ,复合物将会析出。
然而 , DNA提取的质量好坏主要取决于材料本身 ,由于不同材
料所含的化学物质不同 ,从而导致 DNA提取的难易程度也不
同。试验先通过液氮的研磨使细胞壁充分破裂 ,然后利用高浓
度 KI在短时间内直接裂解细胞膜 、核膜 ,使 DNA释放出来而
又不被破坏 ,再经过氯仿 、异戊醇 、异丙醇 、无水乙醇等步骤的
处理 ,在短时间内就可完成 DNA的提取。
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(上接第 10549页)
为根茎和叶片失水或腐烂。这是由于培养容器中的相对湿
度过高 ,光照不足 ,乙烯浓度过大 ,导致试管苗植株生长相对
纤弱 ,叶片上调节蒸腾速度的气孔开闭功能极不发达 [ 10] 。
因此 ,加强试管苗移栽前的驯化和移栽后前 2周的管理对提
高试管苗的存活 、促进其健壮生长非常重要 。
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