全 文 ：基金项目:湖南省科技厅科学技术研究项目(编号:03JZY3016)
作者简介:熊建华(1969-),女 ,江西农业大学副教授。
E-mail:xjhxjh69@163.com
通讯作者:刘仲华
收稿日期:2007 -06-11
第 23卷第 5期
2 0 0 7年 1 0月
Vol.23, No.5
Oct.2 0 0 7
巴拉圭茶多酚的提取纯化工艺及抑菌效果研究
ExtractionandpurificationofpolyphenolsinIlexparaguarensisand
itsantibacteriostaticactivities
熊建华 1, 2
XIONGJian-hua1, 2
刘仲华 1
LIUZhong-hua1
王克勤 1
WANGKe-qin1
(1.湖南省天然产物工程技术中心 ,湖南 长沙 410128;2.江西农业大学食品科学系 , 江西 南昌 330045)
(1.TheHunanEngineeringandTechnologyCenterforNaturalProducts, Changsha, Hunan410128, China;
2.DepartmentofFoodScience, JiangxiAgriculturalUniversity, Nanchang, Jiangxi330045, China)
摘要:以多酚的质量分数为评判指标 , 对巴拉圭茶多酚的乙
醇回流提取工艺 、粗多酚的纯化工艺进行研究;采用 K-B
纸片法探讨巴拉圭茶多酚对食品中常见致病菌的抑菌活性。
结果显示:乙醇的体积分数为 70%, 回流时间 60 min,回流温
度 80℃, 料液比 1∶10为多酚的最佳提取工艺条件;乙酸乙
酯是多酚最好的纯化试剂 , 纯化后多酚的质量分数为
80.04%, 纯化后的多酚具有较强的抑菌活性。
关键词:巴拉圭茶多酚;提取工艺;纯化工艺;抑菌活性
Abstract:Therefluenceextractionandpurificationprocedureofpolyphe-
nolsinIlexparaguarensiswereinvestigatedwiththecontentofpolyphenols
asindex;theantibacteriostaticactivitiesagainstpathogenicbacteriaindiet
wereestimatedusingK-Bfilterpaperslipmethod.Theresultsshowed
thattheoptimumextractionconditionswere10foldof70% ethanol, dipin
80 ℃ water, refluxing60 min;EtoAcwasthebestreagentforpurification,
thecontentofpolyphenolswas80.64% afterpurification;thepurepoly-
phenolsshowedconsiderableantibacterialefect.
Keywords:PolyphenolsinIlexparaguarensis;Extraction;Purification;An-
tibacteriostaticactivities
巴拉圭茶(Ilexparaguarensis)属冬青科冬青属 , 原产于
南美 , 是热带或亚热带多年生常绿灌木。其干叶和嫩茎可加
工制成碎茶。巴拉圭茶具有较好清除自由基 , 治疗炎症 、消
化不良 、肥胖 、癌症等药理作用 [ 1 ～ 5] , 在许多国家与地区都受
到关注 , 它被收录在《阿根廷的食物碥码 》、《英国草药药典》
和《德国植物药大全(CommissionE)》等书中 [ 3] 。随着国际交
流的不断深入 , 巴拉圭茶已引进我国市场。多酚是巴拉圭茶
的主要药用成分 , 含量丰富 ,研究表明 [ 6, 7]巴拉圭茶的多酚成
分主要是绿原酸类物质 , 包括绿原酸 , 咖啡酸 , 异绿原酸 A,
异绿原酸 B, 异绿原酸 C, 以及少量的槲皮素 、芦丁 、三奈酚等
类黄酮类物质。笔者研究巴拉圭茶多酚的制取方法及巴拉
圭茶多酚的抑菌活性 , 以期为深入了解及利用巴拉圭茶提供
依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
巴拉圭茶:阿根廷进口;
绿原酸标准品:中国药品生物制品检定所;
茶多酚 TP:湖南金农生物资源股份有限公司 , 纯度
80%;
硫酸庆大霉素:华北制药厂 , 8万单位 /2 mL;
大肠杆菌 C8309(Escherichiacoli)、链球菌 C55605
(streptococcussp)、沙门氏菌 C79-74(solmonellaparatyhpi):
中国兽药监测所;
牛肉膏蛋白胨培养基;
UV-2550紫外可见分光光度计:日本岛津公司;
98-I-B型电子调温电热套:天津市泰斯特仪器有限公
司;
R-200型旋转蒸发仪:瑞士 BǜCHI公司;
CBN18-30型冷却水器:上海 Heto;
AIPHR1-2LD冷冻干燥机:德国 CHRIST公司;
SHZ-95型循环水式多用真空泵:河南予华仪器厂;
AirTech无菌操作台:苏净集团泰安公司;
DNP-9162恒温培养箱:上海精密试验设备有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 巴拉圭茶多酚的制备流程
78
1.2.2 多酚的醇提最佳工艺参数的确定 乙醇价廉易得 ,
无毒 , 选择性好 ,极性较高 , 是酚类较好的提取剂。 将巴拉圭
茶叶用乙醇回流提取多酚。巴拉圭茶多酚的乙醇回流提取
最优工艺采用正交试验确定 , 根据单因素试验对巴拉圭茶多
酚提取率最有影响的 4因素乙醇体积分数 、回流时间 、回流
温度 、料液比作为考察对象 ,进行正交试验设计 ,选用 L9(34)
正交试验 , 见表 1。
表 1 因素水平表
水
平
A乙醇体积分数
/%
B回流时间
/min
C回流温度
/℃ D料液比
1 60 60 70 6
2 70 90 80 8
3 80 120 90 10
1.2.3 粗多酚的纯化工艺 将提取液浓缩至一定体积 , 得
到浓缩液 , 浓缩液用石油醚萃取去除叶绿素和脂溶性成分 ,
再用氯仿萃取去除咖啡碱。剩余溶液使用极性不同的试剂
乙酸乙酯 、正丁醇 、异戊醇进行纯化 , 比较纯化效果。将纯化
效果最好的试剂萃取得到的总多酚(TIPP)用于活性研究。
1.2.4 巴拉圭茶多酚的测定 巴拉圭茶多酚测定采用 Fo-
lin-Ciocalteu比色法 ,因巴拉圭茶多酚主要为绿原酸类物质 ,
选用绿原酸作为多酚测定的对照品 ,将绿原酸用甲醇配成质
量浓度为 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.5, 3.0 mg/mL的标准溶液 , 分别
取标准溶液 1 mL于 100 mL容量瓶中 , 加入 50 mL蒸馏水 ,
再加 5 mLFolin-C试剂 、摇匀后加入 15 mLNa
2
CO
3
,于 30 ℃
反应 2 h,在波长 760 nm处测定吸光值 , 得出绿原酸质量浓
度与吸光度之间的回归方程:
y=1.004 302x+0.010 25
r=0.999 8
精密称取各提取物干燥粉末 20 ～ 100 mg,用甲醇溶解定
容于 50mL容量瓶 , 取 1 mL于 100 mL容量瓶中 , 如前进行
显色反应 , 测定吸光度并用回归方程计算多酚的质量分数。
1.3 体外抑菌试验 [ 8 ～ 10]
1.3.1 菌液制备 所用菌株使用前将菌种先接种于平板 ,
于 37 ℃培养 24h后 ,挑选典型菌落接种于液体培养基中 ,再
于 37 ℃培养 18 h后 , 通过细菌总数测定 , 将菌液稀释至
105 ～ 106个菌 /mL, 备用。
1.3.2 抑菌效果的测定 含药物纸片制备:将巴拉圭茶多
酚配成多酚质量浓度为 30 mg/mL的溶液 , 过滤除菌备用。
每张纸片(直径 6mm)加药物样品溶液 5μL, 空白对照为生
理盐水 , 阳性对照为 400 μg/mL的硫酸庆大霉素(GS)和
30 mg/mL的茶多酚(TP)。
采用 K-B纸片法进行:将固体培养基加热后倒入平皿
内 , 每个平皿约 20mL。待培养基凝固后 ,用灭菌吸管吸取菌
悬液 0.1 mL注入平皿内 , 再用灭菌的涂布棒迅速将菌液涂
抹均匀 , 制成含菌平板。用无菌镊子将浸透的药品滤纸片放
在含菌平板上 , 把每个处理过的培养皿放到 37 ℃培养箱中
培养 24h,用游标卡尺测定抑菌圈直径的大小 , 并以此判断
不同样品对供试菌的抑制效果。
1.4 数据统计处理
采用方差分析。
2 结果与讨论
2.1 正交试验分析
取巴拉圭茶 100 g,按表 1设计的工艺进行回流提取 、过
滤 , 滤液浓缩并冷冻干燥制成粉末 , 采用 “ 1.2.4”方法测定并
计算提取物干燥粉末多酚质量分数。结果见表 2, 正交试验
数据的方差分析结果见表 3。
表 2 巴拉圭茶多酚回流提取正交试验结果
试验
号
A体积
分数
B回流
时间
C回流
温度
D料液
比
多酚质量分数 /%
试验 1 试验 2 平均
1 1 1 1 1 27.14 27.04 27.09
2 1 2 2 2 28.79 28.19 28.49
3 1 3 3 3 32.79 31.45 32.12
4 2 1 2 3 34.05 35.00 34.53
5 2 2 3 1 32.13 32.03 32.08
6 2 3 1 2 32.11 31.56 31.84
7 3 1 3 2 27.16 26.56 26.86
8 3 2 1 3 28.55 29.55 29.05
9 3 3 2 1 27.02 27.50 27.26
K1 175.40 176.95 175.95 172.86 269.74 268.88
K2 196.88 179.24 180.55 174.37
K3 166.34 182.43 182.12 191.39
k1 /3 29.23 29.49 29.33 28.81
k2 /3 32.81 29.87 30.09 29.06
k3 /3 27.72 30.41 30.35 31.90
R 5.09 0.91 1.03 3.09
从表 2极差分析可看出 , 影响多酚含量的因素主次顺序
分别为乙醇体积分数 、料液比 、回流温度 、回流时间。乙醇体
积分数和料液比的差异最大 , 极性 R值分别为 5.09和 3.09,
其它二因素中 , 回流温度次之 , 回流时间的影响最小 。从方
差分析表可看出:乙醇浓度与料液比是起主导作用的变异来
79
提取与活性 2007年第 5期
源 , 其对试验结果的影响最大 , 呈极显著水平 (F<0.01);
回流温度对试验结果也有影响 , 呈显著性水平(F<0.05);
回流时间对提取效果影响不大(F>0.01);最佳浸提条件为
A2B1C2D3 ,即乙醇的体积分数为 70%, 回流时间 60 min, 回
流温度 80 ℃,料液比 1∶10,多酚的质量分数为 34.53%。从
正交试验结果可看出 ,乙醇体积分数为 70%时 , 提取的多酚
质量分数高于乙醇体积分数为 60%和 80%, 可能是乙醇体
积分数低时 , 多酚不能充分溶出 , 乙醇体积分数高时会将杂
质带出 , 纯度反而下降。料液比明显地影响绿原酸的提取效
果 , 因为物质在固液两相有一定的分配比 , 提高提取溶液的
体积 , 利于绿原酸的溶出。
表 3 正交试验方差分析表
自由度 平方和 均方 F F0.05 F0.01
区组 1 0.04 0.04 5.32 11.26
A 2 82.01 41.00 134.20＊＊ 4.46 8.65
B 2 2.53 1.26 4.13 4.46 8.65
C 2 3.43 1.71 5.61＊ 4.46 8.65
D 2 35.30 17.65 57.76＊＊ 4.46 8.65
误差 8 2.44 0.31
总和 17 125.74
2.2 有机溶剂纯化巴拉圭茶多酚
巴拉圭茶多酚粗提液去除叶绿素 、脂溶性物质及咖啡碱
后 , 采用溶剂法对其进行纯化 , 结果见表 4。乙酸乙酯 、正丁
醇 、异戊醇 3种溶剂对巴拉圭茶多酚均有一定纯化效果 , 乙
酸乙酯的萃取效果较佳 , 纯化后多酚的质量分数为 80.64%,
正丁醇的效果其次 , 多酚的质量分数为 58.96%, 异戊醇的效
果较差 , 多酚的质量分数为 51.11%。这可能是由于巴拉圭
茶多酚的主要成分为绿原酸类物质 , 它们的极性较大 , 更易
溶于乙酸乙酯。
表 4 不同溶剂对巴拉圭茶多酚纯化效果的比较 /%
溶剂 乙酸乙酯 正丁醇 异戊醇
多酚质量分数 80.64 58.96 51.11
2.3 巴拉圭茶多酚的抑菌试验结果
采用纸片法检测巴拉圭茶多酚的抑菌效果 ,结果见表 5。
巴拉圭茶多酚(TIPP)对 3种菌均有一定的抑菌效果 , 其对沙
门氏菌的抑菌作用强于茶多酚(P<0.01),对大肠杆菌 、链球
菌的抑菌作用弱于茶多酚(P<0.01)。巴拉圭茶多酚对大肠
杆菌 、沙门氏 菌 、链球菌的 抑菌效 果弱于庆 大霉素
(P<0.01),但庆大霉素对人体有肾毒性 、耳毒性 、过敏反应
等副作用 [ 11] 。
表 5 巴拉圭茶多酚的抑菌效果 /mm
菌种 TIPP TP 阳性(庆大霉素) 空白(生理盐水)
大肠杆菌 20.03 ±0.85cB 22.19 ±0.43bB 24.82 ±0.32aA 0
沙门氏菌 21.56±0.76aA 17.12 ±0.47bB 22.66 ±0.24aA 0
链球菌 16.38 ±0.73Cc 18.36 ±0.52Bb 23.67 ±0.37Aa 0
肩注小写字母相同表示差异不显著 ,不同表示差异显著;大写字母相同表示差异未达极显著 ,不同表示差异极显著。
3 结论
巴拉圭茶多酚与庆大霉素等抗生素比较 , 在临床应用上
更为安全 、方便 ,和茶多酚一样可开发成为预防和治疗疾病
的保健品 、食品添加剂和天然药物。
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