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高效液相色谱法测定海南香茅中绿原酸的含量



全 文 :DOI:CNKI:46-1049/R.20111223.1229.019
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/46.1049.R.20111223.1229.019.html
[收稿日期]2011-12-08  [修回日期]2011-12-20  网络出版时间:2011-12-23 12:29
[基金项目]海南省教育厅高等学校科学研究资助项目(Hjkj2010-36)
[作者简介]王勇(1982-),男,硕士,药学与中药学实验师,电话:0898-31350773,电子信箱:wangyong1982_2004@yahoo.com.cn。
高效液相色谱法测定海南香茅中绿原酸的含量
王 勇,魏 娜,董静静
(海南医学院药学院,海南 海口 571101)
  [摘要]目的:建立海南香茅中绿原酸的高效液相色谱含量测定方法。方法:采用高效液相色谱法,phe-
nomenox luna C1 8 色谱柱(250mm ×4.6mm,5μm),以乙腈-水-冰醋酸(12∶88∶1)为流动相,流速
为1.0mL/min,检测波长为327nm。结果:绿原酸在0.166 4~1.664 0μg范围内,峰面积与绿原酸
的进样质量呈良好线性关系,线性方程为Y=1 334 267.8 X-2 392.2(r=0.999 9),平均回收率为
101.58%,RSD为1.84%。结论:建立的高效液相色谱测定法简便、快速,重复性好,准确度高,可作为
香茅药材的质量控制方法。
[关键词]香茅;绿原酸;含量;高效液相色谱法
[中图分类号]R284.1;O657.72 [文献标识码]B [文章编号]1007-1237(2012)04-0445-03
Determination of chlorogenic acid in the herb of Cymbopogon citrus from Hainan by HPLC
WANG Yong,WEI Na,DONG Jing-jing
(School of Pharmaceutical Sciences,Hainan Medical University,Haikou 571101,China)
[Foundation Project]:Higher School Scientific Research Funded Project of Hainan Provincial Education Department
(Hjkj2010-36)
[Author]:WANG Yong (1982-),Male,Experimentalist,M.M.,Tel:0898-31350773,E-mail:
wangyong1982_2004@yahoo.com.cn.
Received:2011-12-08  Revised:2011-12-20  JHMC,2012;18(4):445-447
View from specialist:It is creative,and of certain scientific and educational value.
[ABSTRACT]Objective:To establish a method for the determination of chlorogenic acid in the herb
of Cymbopogon citrus from Hainan by HPLC.Methods:HPLC determination was carried out on a phe-
nomenox luna C1 8column(250mm×4.6mm,5μm)with acetonitrile-water-acetic acid(12∶88∶1)as
mobile phase at a flow rate of 1.0mL/min and the detection wavelength was set as 240nm.Results:There
was good linear relationship for chlorogenic acid in the range of 0.166 4-1.664 0μg.The linearity equation
was Y=1 334 267.8 X-2 392.2(r=0.999 9).The average recovery was 101.58%and RSD was 1.84%.
Conclusions:The established method is simple,quick,reproducible and accurate,which can be used for the
quality control of Cymbopogon citrus.
[KEY WORDS]Cymbopogon citrus;Chlorogenic acid;Assay;HPLC
  香茅为禾本科香茅属植物香茅Cymbopogon
citratus(DC.)Stapf的干燥全草,具有抑菌、消炎、
抗病毒、抗氧化、降压、免疫调节与肿瘤抑制等药理
活性,其主要成分有挥发油类成分如柠檬醛、月桂烯
等,黄酮类成分如芹菜素、山奈酚、槲皮素、木樨草素
等,苯丙素类化合物如绿原酸、咖啡酸、对羟基桂皮
酸等[1]。近年来药理学研究表明绿原酸具有抗氧
化、抗肿瘤、抗病毒、免疫调节及降糖等多种作用[2],
与香茅全草的药理作用具有一定相关性,可能是其
发挥药理活性的主要成分之一。目前关于香茅化学
544
海南医学院学报 2012,18(4)
Journal of Hainan Medical University
 
DOI:10.13210/j.cnki.jhmu.2012.04.003
成分尤其是水溶性成分质量控制的文献报道较少,
本实验采用高效液相色谱法对香茅药材中的绿原酸
含量进行测定,以期为香茅药材的质量控制提供参
考。
1 仪器与试药
LC-6AD高效液相色谱仪,配以LC-10ADvp紫
外检测器(日本岛津仪器公司),N2000色谱工作站
(浙江智达有限公司),AUW220D电子分析天平(日
本岛津仪器公司),JASCO紫外可见分光光度计(日
本分光光度仪器公司),SK5200LHC超声波清洗器
(上海科导超声仪器有限公司),手提式多功能粉碎
机(上海广沙工贸有限公司)。
3批 香 茅 药 材 (批 号 20100712、20100815、
20110803)均购自海南凤生香草园,经海南医学院药
学院药用植物学与生药学教研室曾念开副教授鉴定
为禾本科香茅属植物Cymbopogon citratus(DC.)
Stapf的干燥全草;乙腈(Tedia公司)为色谱纯,水
为超纯水,甲醇、冰醋酸均为分析纯,绿原酸对照品
(批号:110753-200413)由中国药品生物制品检定所
提供。
2 方法与结果
2.1 溶液的配制
2.1.1 对照品溶液的制备 取经减压干燥12h后
的绿原酸对照品适量,置25mL棕色量瓶中,加
50%甲醇超声使溶解,配成浓度为0.083 2mg/mL
的溶液,摇匀,过0.45μm微孔滤膜,续滤液作为对
照品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备 取香茅药材适量,低温
干燥后粉碎,过40目筛。取药材粉末2 g,精密称定,
置具塞锥形瓶中,精密加入25 mL50%甲醇,称重,
超声提取45 min,放冷,用50%甲醇补足减失的重
量,摇匀,滤过,取续滤液过0.45μm 微孔滤膜,即
得。
2.2 检测波长的选择
取绿原酸对照品溶液适量,加50%甲醇稀释
后,在200~400nm波长范围内扫描,结果绿原酸
对照品在327nm处有最大吸收(图1),因此,确定
其检测波长为327nm。
图1  绿原酸对照品溶液紫外扫描图
2.3 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱为phenomenox luna C1 8(250mm ×
4.6mm,5μm ),流动相为乙腈-水-冰醋酸(12∶
88∶1),流速:1.0mL/min,检测波长:327nm,进
样量10μL。在此条件下供试品溶液中绿原酸与相
邻色谱峰的分离度大于1.5,对照品与供试品溶液
色谱图中理论塔板数按绿原酸计分别为10 373、11
359,拖尾因子分别为1.065、1.066。对照品与供试
品溶液色谱图如图2A、B所示。
          A  B
图2 对照品(A)与供试品(B)溶液的HPLC图
644  海南医学院学报 Vol.18No.4Apr.2012
2.4 线性关系的考察
分别精密吸取对照品溶液2、4、8、10、16、20μL
进样,记录绿原酸峰面积,结果如表1所示,以峰面
积对进样量进行线性回归,回归方程为:Y=1 334
267.8 X-2 392.2(r=0.999 9)。结果表明绿原
酸进样量在0.166 4~1.664 0μg范围内,与峰面积
呈良好线性关系。
2.5 精密度试验
取对照品溶液10μL,连续进样6次,记录色谱
图峰面积值。绿原酸峰面积RSD为0.60%,表明
该方法精密度良好。
2.6 重复性试验
取同一批号样品(20110803),按“2.1项”中供
试品溶液制备方法制备6份供试品溶液,分别进样
10μL,记录色谱图峰面积值,按外标法计算绿原酸
含量。绿原酸含量的RSD值为1.08%,表明该方
法重复性良好。
2.7 稳定性试验
取同一供试品溶液分别于配制后0、1、2、4、6、8
h 进 样 10 μL,测 得 绿 原 酸 峰 面 积 的 RSD
为1.32%,表明供试品溶液在8h内稳定性良好。
2.8 加样回收率试验
取已 知 含 量 的 香 茅 药 材 粉 末 (绿 原 酸 含
量0.751mg/g)6份,每份约1g,精密称定,分别精
密加入绿原酸对照品溶液(0.812mg/mL)1.0mL,
按“2.1项”中供试品溶液制备方法制备溶液。在
“2.3项”色谱条件下进样10μL,记录色谱图峰面积
值,计算回收率,结果见表2,平均回收率为101.
58%,RSD为1.84%。
表1 线性关系测定结果
1  2  3  4  5  6
进样量(μg) 0.166 4  0.332 8  0.665 6  0.832 0  1.331 2  1.664 0
峰面积 211 661.5  438 586.5  899 869.5  1 109 556  1 774 794  2 211 845
表2 绿原酸加样回收率试验(n=6)
No
称样量
(g)
样品含量
(mg)
加入量
(mg)
测得量
(mg)
回收率
(%)
平均回收率
(%)
RSD(%)
1  1.000 3  0.775 3
2  1.000 1  0.775 2
3  1.000 1  0.775 2
4  1.000 2  0.775 3
5  1.000 3  0.775 3
6  1.000 5  0.775 5
0.812 0
1.586 7  99.93
1.592 5  100.66
1.605 6  102.27
1.623 1  99.89
1.626 5  104.82
1.603 1  101.92
101.58  1.84
2.9 样品含量测定
取3批香茅药材粉末,按“2.1项”供试品溶液
制备方法制备,平行3份,按“2.3项”色谱条件分别
进样,按外标法计算样品中绿原酸的含量,结果见表
3。
表3 3批香茅药材绿原酸含量测定结果(n=3)
批号 绿原酸含量(mg/g)
20100712  0.762 8
20100815  0.775 1
20110803  0.761 1
3 结论
3.1 提取溶剂的选择
曾考察过直接用甲醇超声提取,但发现甲醇提
取溶液含叶绿素较多,溶液颜色较深,杂质干扰严
重,后参考文献[3-5]改用50%甲醇超声提取,叶绿
素明显减少,分离效果较好。
3.2 提取时间的考察
曾考察过香茅药材粉末用50%甲醇超声提取
15、30、45、60min,结果发现超声15、30min提取不
完全。超声提取45min和60min,绿原酸含量差
别较小,因此最终选取超声提取时间为45min。
3.3 流动相的选择
实验中曾对甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶1)、乙腈-
水(10∶90)、乙腈-0.4%磷酸(10∶90)、乙腈-水-冰
醋酸(8∶92∶1)、乙腈-水-冰醋酸(10∶90∶1)、乙
腈-水-冰醋酸(12∶88∶1)等流动相系统进行考察,
结果以乙腈-水-冰醋酸(12∶88∶1)出峰时间早,分
离效果好。
3.4 低温避光保存
绿原酸对光照较敏感,长时间光照易分解,药材
应低温避光保存,实验操作中也应注意避光,溶液应
置于棕色量瓶中。
(下转第451页)
744王勇等.高效液相色谱法测定海南香茅中绿原酸的含量 
侵入、粘附牙本质小管的能力,早期便可进入牙本质
小管。随感染时间的增加,细菌侵入牙本质小管的
深度加深,生物膜的形态也发生变化。形态的变化
表现为微集落间有通道相隔到通道相隔逐渐缩小,
从细菌菌体表面光滑到表面出现点状突起以及细菌
表面由丝状纤维建立联接。感染后3周可观察到粪
肠球菌生物膜微集落相互结合,细菌间普遍由丝状
纤维建立联接,细菌间建立通信,成熟、稳定的生物
膜形成。提示单一的粪肠球菌菌种在没有其他种类
细菌协同作用下可在离体牙内形成根管生物膜,并
造成根管深层的感染,细菌在根管内不是以单一的
个体存在,而是相互间建立通信。粪肠球菌形成生
物膜的能力,反映了在感染根管内该菌种具有较强
致病性的原因。粪肠球菌粘附、侵入牙本质小管深
处的能力,提示在根管治疗的过程中,随着根管的清
理、扩大,根管内及管壁浅层的细菌及其产物可随病
变牙本质的去除而明显减少,但存在于感染根管牙
本质小管深层内的细菌,难以被清除干净并可再度
进入根管内未充填严密的间隙,成为导致根管治疗
失败的潜在因素。同时提示临床上应早期进行根管
内感染的控制和清除,防止细菌增殖和入侵根管系
统隐蔽部位而增加清除的难度。粪肠球菌根管感染
模型的成功建立,可利用这一模型评价各种感染清
除措施的效果,以利于临床选择更有效的治疗方式
及提高根管治疗的成功率。
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(上接第447页)
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