全 文 ：黄花石蒜花蕊和花葶组织中总 RNA
提取方法的比较
〔摘要〕 目的 筛选适合黄花石蒜花蕊和花葶组织中总脱氧核糖核苷酸（RNA）的提取方法。 方法 采用 CTAB 法、
SDS 法和植物总 RNA 提取试剂盒法对黄花石蒜花蕊和花葶组织中总 RNA 进行提取并比较其效果。 结果 CTAB 法和
SDS 法均不能提取到完整的 RNA；植物总 RNA 提取试剂盒能有效地去除蛋白质、多糖及 DNA，28S 条带的荧光亮度
是 18S 条带的 2 倍左右，OD260/280值在 1.8~2.0 之间，花蕊和花葶的产率分别为 304.1 μg/g 和 255.8 μg/g，并且试剂盒
法提取的总 RNA 通过 RT-PCR 扩增能获得特异性条带。 结论 试剂盒法适合黄花石蒜花蕊和花葶组织总 RNA 的提
取，提取的总 RNA 质量高、完整性好、产率高，符合后续实验的要求。
〔关键词〕 黄花石蒜；花蕊；花葶；脱氧核糖核苷酸
〔中图分类号〕R284.1 〔文献标识码〕B 〔文章编号〕doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2012.01.008.031.04
Comparison of total RNA extraction between Lycoris
aurea Herb Flowers and scapes
TANG Jin-feng, LU Yao-bang*， GUI Liu-zi
(Pharmaceutical College，TCM University of Hunan, Changsha, Hunan 410208, China)
〔Abstract〕 Objective To screen a suitable method for extracting total RNA from Lycoris au-
rea Herb flowers and scapes. Methods The CTAB and SDS extracting techniques and plant total
RNA extraction were used to extract the total RNA from Lycoris aurea Herb flowers and scapes
and the techniques were compared. Results Both CTAB and SDS methods were not effective to
extract intergative total RNA; the plant total RNA extraction kit could effectively remove protein,
polysaccharides and DNA, 28S bands of fluorescence intensity was about 2 times of the 18S bands,
the values of OD260/280 was between 1.8 and 2.0, the draba of flowers and flower yield were
304.1 μg/g and 255.8 μg/g, and the total RNA extracted by kit extraction amplificated by RT-
PCR could gain the specific band. Conclusion The plant total RNA extraction kit is more suitable
to extract total RNA from Lycoris aurea Herb flowers and scapes, and the total RNA is much su-
perior qualitive and better integritive.
〔Key words〕 Lycoris aurea Herb; stamens; scapes; RNA; kit method
唐金凤，鲁耀邦 *，桂柳姿
（湖南中医药大学药学院，中药药性与药效三级科研实验室，湖南省中药现代化研究实验室，湖南 长沙 410208）
〔收稿日期〕2011－09－28
〔基金项目〕湖南省自然基金资助项目(10JJ2024)；湖南省教育厅科研基金资助项目(07A052)。
〔作者简介〕唐金凤(1985-)，女，湖南衡阳人，在读硕士研究生，主要从事中药资源与质量研究工作。
〔通讯作者〕* 鲁耀邦，男，教授，硕士研究生导师，E-mail:luyb414@sina.com。
黄花石蒜(Lycoris aurea Herb.)又称忽地笑、金
花石蒜等， 系石蒜科石蒜属植物, 属多年生草本植
物，内含生物碱 [1]、多糖、黄酮、氨基酸及凝集素等化
学成分， 其中加兰他敏含量比其他石蒜属植物高 [2]。
·中药分析·
2012 年 1 月第 32 卷第 1 期
Jan． 2012 Vol． 32 No． 1
湖 南 中 医 药 大 学 学 报
Journal of TCM Univ． of Hunan 31
加兰他敏具有可逆性和选择性抑制乙酰胆碱酯酶
（AChE） 及调节烟碱型乙酰胆碱受体的双重作用，是
治疗阿尔茨海默氏病 （Alzheimer’s Disease, AD）的
首选药物之一。 临床研究表明，加兰他敏可明显改善
老年痴呆症患者的认知能力且毒副作用小， 其作为
治疗轻度至中重度 AD的药物已在欧盟国家上市[3-5]。
除此之外，加兰他敏还可用于小儿麻痹后遗症、重症
肌无力、闭角形青光眼和术后肠肌麻痹等症的治疗，
我国从 1977 年将其收载于《中国药典》[6]，近年来加
兰他敏已成为我国出口创汇的重要产品之一[7]。但由
于天然植物中含量较低， 致使加兰他敏在药物市场
上供不应求，价格昂贵[8]。 随着人口老龄化程度的日
益严重，加兰他敏的需求量逐年增加，仅仅依靠目前
的扩大种植面积、 探索黄花石蒜快繁技术等手段已
很难满足市场需求， 因此应运用先进的生物技术手
段，探索黄花石蒜中加兰他敏的合成途径，开发高产
加兰他敏的石蒜品种， 才能有望从根本解决加兰他
敏的原料来源问题。
通过研究表明黄花石蒜生殖器官花蕊中加兰他
敏含量最高、根次之，花葶中最少[9－10]，后期研究从黄
花石蒜花蕊和花葶两个加兰他敏含量差别最大的部
位入手， 探讨加兰他敏生物合成及代谢途径中的关
键酶基因。这一研究的重要一环是提取纯度高、完整
性好的总脱氧核糖核苷酸。 江玉梅等[10]用改良 CsCl
密度梯度离心法成功提取石蒜叶片和鳞茎总 RNA，
但该方法不适合黄花石蒜花蕊和花葶总 RNA 的提
取， 其他提取总 RNA 方法未见在石蒜属植物中报
道， 目前常用的提取总 RNA 方法有 CTAB 法、SDS
法、异硫酸氰胍法、试剂盒法等。 本文通过比较 3 种
黄花石蒜花蕊和花葶组织总 RNA的提取方法，从中
筛选出最优方法，为后续逆转录提供较佳的模板。现
将实验方法与结果报道如下。
1 材料
1.1 药材
黄花石蒜于 2010 年 7月 4日采自湖南衡山，经
湖南中医药大学中药鉴定教研室潘清平教授鉴定为
石蒜科石蒜属植物（Lycoris aurea Herb.）。 用自来水
冲洗掉黏附在黄花石蒜上的泥土， 再用去离子水冲
洗 1 遍，用手术刀将根、鳞茎、花葶、花瓣、花蕊分开
处理，最后用灭菌的焦碳酸二乙脂(DEPC)迅速冲洗
2 次再置于灭菌滤纸上吸干水 [11]，塑料袋封装，迅速
置于-80 ℃冰箱中保存。
1.2 试剂及前处理方法
十六烷基三甲基溴化铵 （CTAB）、LiCl、十二
烷基硫酸钠 （SDS）为合肥博美公司产品 ；焦碳酸
二乙酯 （DEPC）为 invitrogen 产品 ；RNAprep pure
植物总 RNA 提取试剂盒 (TIANGEN，北京 )；DNase
Ⅰ (Promega)；琼脂糖 （GENE TECH COMPANY）；
100bp DNA ladder (北京鼎国生物技术有限责任
公 司 )；Blend Taq 和 dNTP (TOYOBO)；M -MLV
Reverse Transcriptase(Promega)；引物 （北京擎科生
物技术有限公司）； 其他试剂均为国产分析纯或
电泳纯。
RNA 提取中所用的溶液除 Tris 外， 均用 0.1%
DEPC 水处理并高压灭菌， 含 Tris 的溶液用经高压
灭菌的 DEPC 水直接配制； 塑料制品用 0.1%DEPC
水处理 12 h并高压灭菌后烘干备用；玻璃器皿及研
钵等物品用锡箔纸包裹于 180 ℃烘烤 4 h 以上 [11]。
有机玻璃的电泳槽等， 先用去污剂洗涤， 双蒸水冲
洗，乙醇干燥，再浸泡在 3%H2O2室温 10 min，然后
用灭菌 0.1%DEPC水冲洗，晾干。
2 方法
2.1 总 RNA提取方法
2.1.1 CTAB法 参照周丽侠等[12]的 CTAB法。称取
新鲜的黄花石蒜花蕊和花葶各 0.1 g 进行总 RNA
的提取， 提取后用 50 μL RNase-free ddH2O 溶解
RNA，-80 ℃保存备用。
2.1.2 SDS 法 根据李岩等[11]的改良 SDS 法作适当
修改 。 （1） 称取新鲜的黄花石蒜花蕊和花葶各
0.15 g， 置于含液氮的研钵中碾成粉末状迅速转移
至 2 mL 离心管中，加入 0.6 mL SDS 提取液[2%(m/
M)SDS、 硼砂0.025 mol/L (pH 8.5)，DEPC 水处理]、
0.06 mL β-巯基乙醇、0.4 mL Tris 苯酚和 0.3 mL
氯仿，剧烈震荡 10 min。 （2）4 ℃ 12 000 r/min 离
心 5 min， 将上清液移入新离心管， 加入 0.3 mL
Tris 苯酚和0.3 mL 氯仿， 冰浴 10 min 震荡 2 次。
（3）4 ℃ 12 000 r/min 离心 5 min， 将上清移入新
离心管， 向上清液中加入等体积 4 mol/L LiCl和 1/2
体积无水乙醇， 冰浴 15 min。 （4）4 ℃ 12 000 r/min
离心 10 min，弃上清，加入适量的灭菌 DEPC 水溶解
沉淀 。 （5） 待沉淀充分溶解后 ， 加入 1/10 体积
2 mol/L NaAc 和 3 倍体积无水乙醇，-20 ℃冰箱中
湖南中医药大学学报 2012 年第 32 卷32
放置 10 min。（6）4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，弃
上清，用 75%乙醇洗涤沉淀 2次。 （7）将沉淀于真空
中干燥 5 min， 加入 50 μL RNase-free dd H2O 溶
解 RNA，-80 ℃保存备用。
2.1.3 试剂盒法 按照 TIANGEN 公司 RNAprep
pure植物总 RNA提取试剂盒说明书进行操作，最后
得到收集液 100 μL，-80 ℃保存备用。
2.2 总 RNA的质量检测
2.2.1 浓度及纯度测定 取 2 μL RNA 提取液，溶
于 98 μL RNase-free ddH2O 中，用核酸蛋白分析仪
测定 RNA 样品在 230、260、280、320 nm 处的吸光
度，分析样品纯度及产率。无污染的总 RNA其 A260/280
为 1.8~2.0、A260/230为 2.0~2.3。通过吸光度值可以得出
RNA浓度（A260的 RNA为 40 μg/mL）进而计算 RNA
产率：RNA产率 （μg/g）=[A260×稀释倍数×40 μg/mL×
VRNA(mL)]/药材质量。
2.2.2 完整性检测 取 8 μL RNA提取液加入适量
上样缓冲液，采用 1.0%琼脂糖凝胶在 100 V 下电泳
25 min，电泳完成后于凝胶成像系统中成像。
2.2.3 DD -PCR 检测 cDNA 第一链的合成参照
Promega公司 M-MLV逆转录说明书进行。 以合成的
单链 cDNA 为模板， 进行 DD-PCR。 PCR 反应体系
（25 μL）：cDNA 1μL，10 ×PCR buffer 2.5 μL，dNTP
(10 mM)0.5 μL，Tap聚合酶 0.25 μL， 随机引物(5μM)
和锚定引物 （5μM） 各 1 μL， 加 RNase-free H2O至
25 μL。 PCR反应条件: 94 ℃预变性 5 min；25个循环
（94 ℃变性 30 s，40 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min）；
10个循环 （94 ℃变性 30 s，50 ℃退火 1 min，72 ℃延
伸 1 min）；72 ℃延伸 8 min，最后于 4 ℃保温。PCR产
物在 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳[14－15]上检测目的条带。
3 结果
3.1 总 RNA的纯度和产率
表 1 中实验结果表明：3 种不同方法提取的总
RNA 浓度及产率从高到低依次为 CTAB 法、试剂盒
法和 SDS法。 但纯度以试剂盒法最高，且耗时最少。
采用核酸蛋白分析仪可以分析检测 RNA 的纯度与
产率。 RNA 的 OD260/280为 1.8~2.0，比值<1.8，可能有
蛋白质或苯酚污染；比值>2.0，可能是所用的抽提液
中有残留的 β-巯基乙醇等杂质。 RNA的 OD260/230为
2.0~2.3， 低于或高于此范围表明样品可能有蛋白质
或多糖的污染。 结果见表 1。
1：黄花石蒜花蕊组织；2：黄花石蒜花葶组织
a. CTAB 法; b. SDS 法; c.试剂盒法
图 1 不同方法提取黄花石蒜花蕊和花葶组织
总 RNA 的琼脂糖凝胶电泳图谱
表 1 3 种方法提取黄花石蒜花蕊和花葶组织总 RNA 的纯度及产率
A
A
A
OD
OD
( /mL
( /g)
0.2 59 0.683 0.321 2 .64 2.13 1366.8 683.4
CTAB
0.4 90 0.673 0.494 1 .37 1.36 1345.9 673.0
0.0 50 0.097 0.059 1 .92 1.65 193.8 64.6
SDS
0.0 42 0.074 0.056 1 .78 1.32 148.1 49.4
0.0 70 0.152 0.083 2 .17 1.83 304.1 304.1
0.0 57 0.128 0.065 2 .24 1.97 255.8 255.8
3.2 不同方法提取的总 RNA的完整性检测
3 种方法提取的黄花石蒜花蕊和花葶组织总
RNA经 1%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图 1。
由图 1 可见，3 种提取方法提取黄花石蒜花蕊
和花葶中的总 RNA效果不同。其中 CTAB法提取的
RNA浓度较大，28 S、18 S和 5 S条带不清晰，且条
带附近有明显的拖尾现象，说明所提取的 RNA 有严
重的降解， 另外该电泳图还表明 RNA 液中还有
DNA 及蛋白质污染痕迹；SDS 法提取的 RNA 能看
到 3条主条带， 但 28 S和 18 S的荧光亮度约为 1∶
1，且花中还残留少量 DNA；试剂盒法提取的总 RNA
28 S 和 18 S 2 条特征条带清晰， 且其荧光亮度约
为 2∶1，表明总 RNA 较完整，没有降解，也无明显的
基因组 DNA污染，符合后续逆转录的要求。
唐金凤，等 黄花石蒜花蕊和花葶组织中总 RNA 提取方法的比较第 1 期
μg μg
33
3.3 DD-PCR检测
图 2 可见， 用差异显示引物进行 PCR 扩增后，
通过 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测出了一系列条
带，其中以 400~1 000 bp 尤为丰富，说明用试剂盒
法提取的 RNA可以用于进一步的实验。实验结果见
图 2。
4 讨论
黄花石蒜花蕊和花葶中含有较多的多糖和
DNA， 实验发现黄花石蒜花蕊和花葶的裂解样品上
限为 0.15 g，超过这一上限，则出现较多半悬浮液，
不易分离出纯 RNA； 电泳时加样孔内的杂质较多，
DNA 污染严重， 且 RNA 条带模糊不清甚至会出现
4~5个条带。另外，提取过程中应避免直接用体积分
数高的乙醇洗涤沉淀， 防止离心管壁上的多糖形成
沉淀包裹住 RNA，使 RNA沉淀极难溶解。 提取过程
中用到 β-巯基乙醇可以防止酚类等次生化合物被
氧化而与 RNA结合， 变性蛋白及有效抑制 RNA 酶
的活性。
CTAB 是一种较强的去污剂， 对蛋白质的变性效果
明显强于 SDS， 该法具有成本低且能有效地去除样
品中的蛋白质、多糖、多酚等物质，能从一般材料中
提取完整性好、纯度高的 RNA，但是不适合黄花石
蒜总 RNA 的提取；将水浴温度调至 65 ℃，虽然避
免了材料中淀粉的糊化，使之更易于分离除去，但同
时也提高了 RNA 降解的速度； 该法用 DNase Ⅰ去
除 DNA，使提取成本大大提高。 SDS 法中高浓度的
NaCl有利于去除多糖， 而且通过 LiCl 沉淀 RNA 也
可以将 DNA及部分多糖留在上清液中，能有效地去
除 DNA 和多糖的污染，不需 DNase，成本低；无水乙
醇在-20℃条件下沉淀 RNA，也能有效地去除多糖；
但该法提取的 RNA产率较低，并且提取过程中 LiCl
虽然可选择性地沉淀大片段 RNA，但是不能沉淀小
分子 RNA（如 5S RNA），残留的 Cl－会抑制 RNA 的
体外翻译，Li＋则抑制 RNA 的逆转录。 植物总 RNA
试剂盒法虽然成本较高， 但提取的黄花石蒜花蕊和
花葶总 RNA质量最高，并且能满足后期的逆转录极
扩增的需要。
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M：Marker；H、J：分别为花蕊和花葶；15、16、17 分别表示随机
引物 15、16、17；锚定引物均为 29 号锚定引物
图 2 黄花石蒜花蕊和花葶总 RNA 的 DD-PCR扩增
产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
湖南中医药大学学报 2012 年第 32 卷
（本文编辑 杨 瑛）
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