全 文 ：　第 27卷 第 3期
2006 年 5 月
武汉大学学报(医学版)
Medical Journal o f Wuhan Unive rsity
Vol.27 No.3
May , 2006
作者简介:景海霞 ,女 , 1979- ,医学硕士生 ,主要从事皮肤免疫的研究
通讯作者:盛晚香 ,女 , 1952- ,教授 ,硕士生导师 ,主要从事皮肤免疫与皮肤性病研究
当归多糖对豚鼠银屑病样皮损
中角质形成细胞凋亡的影响
景海霞　盛晚香
武汉大学中南医院皮肤科　武汉　430071
摘要　目的:从细胞凋亡角度探讨当归多糖对豚鼠耳部银屑病样模型的作用。方法:50 g/ L 普萘洛尔乳剂外
涂豚鼠耳背皮肤 ,制备银屑病样模型 , 然后随机分成模型对照组(Ⅰ)、低剂量组(Ⅱ)、中剂量组(Ⅲ)、高剂量组
(Ⅳ),依次给予生理盐水 、100 , 200 , 400 mg/ kg当归多糖腹腔注射。应用末端标记技术(TUNEL)分别检测各组
皮损治疗前后表皮角质形成细胞凋亡情况。结果:造模后豚鼠耳部上皮角质形成细胞凋亡指数与涂药前相比明显
增加(P<0.05), Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ组治疗后皮损凋亡指数显著高于治疗前(P Ⅱ <0.05 , P Ⅲ <0.05 , P Ⅳ <0.01)。结论:当归
多糖对普萘洛尔诱发的豚鼠耳背银屑病样模型有治疗作用 , 其作用机理可能与其促进角质形成细胞的凋亡有关。
关键词　当归多糖;银屑病;动物模型;角质形成细胞;细胞凋亡
中图分类号　R758 .63　文献标识码　A　文章编号　1671-8852(2006)03-0377-04
Influence of Angelica Polysaccharide on Apoptosis in
Keratinocytes of Psoriasis-like Lesions of Guinea Pigs
JING Haixia , SHENG Wanxiang
Dept.of Dermatology ,Zhongnan Hospital of Wuhan Universi ty ,Wuhan 430071 ,China
Abstract
Objective:To invest igate the inf luence o f angelica poly saccharide on apoptosis in psoriasis-
like lesions of guinea pig s.Methods:Proprano lol emulsion(50 g/L)was applied on ears back of
Guinea pig s to produce the pso riasis-like models , then the forty guinea pigs randomly divided into
four groups:model control g roup(Ⅰ), low-dose g roup(Ⅱ), mid-dose g roup(Ⅲ)and high-do se
group(Ⅳ).Normal saline and 100 , 200 and 400 mg/kg angelica poly saccharide w ere injected in-
t ra-abdominally respectively .And in each g roup the apopto sis o f keratinocytes in their skin le-
sions befo re and af ter t reatment w as detected by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated
dU TP nick end-labeling(T UNEL)technique.Results:There w as a larg e number of apoptosis ke-
ratinocy tes in psoriasis-like lesions of guinea pig s ears.Compared w i th that o f normal guinea
pig s , the apoptosis index w as increased(P<0.05).Expression o f apoptotic cel ls in pso riasis-like
lesions af te r injecting angelica poly saccharide in g roup Ⅱ , Ⅲ and Ⅳ was signif icantly higher than
that befo re t reatments(P Ⅱ <0.05 and P Ⅲ <0.05 , P Ⅳ <0.01)re spectively.Conclusion:Angelica
po ly saccharide might have a therapeutic ef fect on the pso riasis-like lesions in the epide rm is of
guinea pig s ears induced by propranolo l ointment , and the mechanism may be related to the in-
crease in the frequency o f apoptotic keratinocy tes in lesions.
DOI :10.14188/j.1671-8852.2006.03.029
武汉大学学报(医学版) 第 27 卷
Key Words　A ngelica Po ly saccharide;Psoriasis;Animal M odel;Keratinocyte;Apoptosis
　　当归(Angel ica sinensis)为伞形科当归属植物
当归的干燥根 ,是一种常用的传统中药。当归多糖
(Angelica poly saccharide , ASP)是其主要成分之
一 ,近年来国内外研究发现其对机体免疫系统[ 1-3] 及
抗肿瘤[ 4] 方面有明显作用 。而银屑病是一种多基因
遗传背景下的 T 细胞异常的免疫性疾病[ 5] 。目前 ,
银屑病与细胞凋亡的关系受到越来越多学者的重
视。为探讨当归多糖对银屑病皮损细胞凋亡的影
响 ,我们构建了豚鼠耳部银屑病样病理模型[ 6] ,采用
原位末端标记技术(TUN EL)检测了当归多糖治疗
前后皮损中的细胞凋亡状况。现将研究报道如下 。
1　材料与方法
1.1　当归多糖　由我院当归研发室提供 ,纯度约
85%左右 。
1.2　实验动物　40只健康成年豚鼠 ,体重 300-400
g 左右 ,性别不拘 ,雌雄分养 ,由湖北省疾病预防控
制中心提供。
1.3　模型制备　用新鲜配制的 10%Na2S 溶液脱去
豚鼠耳背毛发 ,次日开始实验。按文献[ 6] 将普萘洛
系(湖北华中药业有限公司生产 ,批号:20050403)配
制成 50 g/L 乳剂 ,均匀涂于豚鼠耳背 ,涂抹厚度 1.0
mm ,面积 10 mm ×10 mm ,每日 4次 ,连续 3周。每
周从 40只豚鼠中随机取下 4只耳廓皮肤作标本 ,石
蜡包埋 , HE 染色 ,光镜下观察组织学变化 。
1.4　分组及给药方法　造模成功后 ,将 40 只豚鼠
随机分成 4组 ,每组 10只 。模型对照组(Ⅰ)用生理
盐水腹腔注射;低剂量组(Ⅱ)、中剂量组(Ⅲ)、高剂
量组(Ⅳ)分别用 100 , 200 , 400 mg/kg 当归多糖腹
腔注射 ,每日 1次 ,连续 10 d。
1.5　取材及组织学观察　于涂药前后和分组处理
后 10 d 分别取材。具体为:乙醚麻醉后 ,取耳廓皮
肤标本 ,用 4%多聚甲醛液固定 ,石蜡包埋 , HE 染
色 ,光镜下观察皮肤病理改变 。参考 Baker[ 7] 的方法
制定组织学评分标准 ,具体如下:角质层中发现 Mu-
nro 小脓肿计 2.0分;过度角化 0.5分;角化不全1.0
分。表皮层中发现颗粒层变薄或消失 1.0 分;棘层
肥厚 1.0 分;皮突延长 、起伏 ,根据轻 、中 、重程度分
别计 0.5 ,1.0 ,1.5分 。真皮层单一核及多形核细胞
浸润 ,根据轻 、中 、重程度分别计 0.5 , 1.0 , 2.0分;乳
突上顶 0.5分;毛细血管扩张 0.5分。
1.6　原位凋亡细胞检测　采用 T UNEL 法 。试剂
盒由武汉博士德生物工程公司提供 。切片脱蜡后 ,
以新鲜配制的体积分数为 3% H 2O 2室温处理 10
min ,蒸馏水冲洗。加 TBS 1∶200新鲜稀释的蛋白
酶 K 37 ℃消化 15 min , TBS冲洗 。加标记缓冲液 ,
每片 20 μl ,取 TdT 和 DIG-d-U TP 各 1 μl ,加入 18
μl标记缓冲液中 ,混匀后加在切片上 ,置于湿盒中
37 ℃标记 2 h , TBS 冲洗 。加封闭液 50μl/片 ,室温
作用 30 min 。用封闭液按 1∶100的比例稀释生物
素化抗地高辛抗体 ,每片 50 μl加切片上 , 37 ℃湿盒
中反应 30 min , TBS 冲洗 。用 TBS 1 ∶100 稀释
SABC(链酶亲和素-过氧化物酶),混匀后加至切片
上 , 37 ℃反应 60 min , TBS 冲洗 。加 DAB显色液显
色 10 min ,水洗。苏木素轻度复染 ,常规封片 、镜检。
1.7　结果判定标准 　细胞核中出现棕黄色颗粒者
为阳性细胞 ,即凋亡细胞。在每张阳性切片上选取5
个阳性细胞最多的高倍视野(×400)计算凋亡指数
(AI),即 500个细胞中凋亡阳性细胞所占的比例 ,取
平均值为计量指标 ,用 x±s表示 。
1.8 　统计方法 　实验数据以 x ±s 表示。应用
SPSS 11.0软件 ,采用 t检验进行统计分析 ,以 P<
0.05为差异有统计学意义 。
2　结果
2.1　HE染色结果　涂药前(正常豚鼠)皮肤可见菲
薄的角质层 ,颗粒层约 1-3层 ,棘细胞层约 3-5层 ,呈
多角形 ,基底层为单层柱状细胞。真表皮交界较平 ,
真皮内有散在少数单核细胞浸润 。涂药后(造模豚
鼠)镜下可见广泛角化过度及灶性角化不全 ,颗粒层
变薄或消失 ,棘层明显肥厚 ,表皮突延伸呈棒状;真
皮乳头上伸 、杵状变及毛细血管扩张 ,血管周围可见
单一核及多形核细胞浸润。统计分析后表明涂药前
后组织学积分差异有显著性(P<0.01 ,表 1),提示
豚鼠耳部产生银屑病样病理改变 ,造模成功 。
表 1　涂药前后豚鼠耳部组织学积分( x±s)
Tab.1　Baker score of guinea pigs ears before
and after application of 50 g/ L propranolol emulsion
Group n Baker score t P
Pre-t reatmen t 40 0.83±0.59
Post-t reatment 40 6.27±0.81 3.463 <0.01
2.2　TUNEL检测结果　涂药前(正常豚鼠)皮肤仅
在颗粒层有散在少许细胞呈中等强度染色 ,而基底
细胞层和棘细胞层未见明显染色 。涂药后(造模豚
鼠)表皮各层均见阳性染色 ,尤以颗粒层和棘细胞层
中上部较多 。经统计学分析 ,涂药后豚鼠耳部皮损
378
　第 3 期 景海霞 , 等.当归多糖对豚鼠银屑病样皮损中角质形成细胞凋亡的影响
角质形成细胞凋亡指数明显高于正常豚鼠皮肤(P<
0.05 ,表 2)。
表 2　涂药前后豚鼠表皮角质形成细胞凋亡指数( x±s)
Tab.2　Apoptosis index(AI)of keratinocytes in epidermis
of guinea pigs ears before and after application
of 50g/ L propranolol emulsion
Group n AI t P
Pre-t reatm en t 40 0.120±0.208
Post-t reatment 40 0.262±0.146 2.236 <0.05
　　Ⅰ组治疗前后表皮角质形成细胞凋亡指数无显
著性差异(P Ⅰ >0.05), Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组治疗后表皮各层
均见明显的凋亡细胞(图 3),其凋亡指数显著高于治
疗前(P Ⅱ <0.05 , P Ⅲ <0.05 , P Ⅳ <0.01 ,表 3),但
Ⅱ、Ⅲ 、Ⅳ组之间治疗后皮损中角质形成细胞凋亡指
数比较无统计学意义(均为 P>0.05)。
表 3　治疗前后表皮角质形成细胞凋亡指数( x±s)
Tab.3　Apoptosis index(AI)of keratinocytes in epidermis
of guinea pigs ears before and after treatment
with angelica polysaccharide
Groupn n
AI
Pre-t reatm en t Post-t reatment t P＊
Ⅰ 10 0.265±0.143 0.263±0.137 1.734 >0.05
Ⅱ 10 0.259±0.138 0.473±0.192 2.678 <0.05
Ⅲ 10 0.263±0.141 0.494±0.213 2.942 <0.05
Ⅳ 10 0.261±0.144 0.522±0.234 3.324 <0.01
　＊C om pared betw een pre- and pos t-t reatmen t in AI;no dif ference
of apoptosis indices after treatment w as found am on g Group Ⅱ , Ⅲ
and Ⅳ, P>0.05
3　讨论
银屑病是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤
病 ,由于其发病机理尚不明确 ,从而给治疗带来了极
大困难。20世纪 70年代以来 ,科学家们发现多糖及
糖复合物参与和介导了细胞各种生命现象的调节 ,
特别是免疫功能的调节。多糖尤其是中药多糖因其
具有增强机体免疫功能及抗肿瘤等药理作用 ,而且
几乎没有毒性 ,愈来愈引起国内外学者们的兴趣。
当归是我国传统中药之瑰宝 , 具有补血 、活血等功
效 ,其主要成分—当归多糖近年来也逐渐引起众多
学者的关注。商澎等[ 4] 在研究当归多糖 AP-O 组分
对小鼠移植肿瘤的抑制作用时发现给药组的脾脏质
量明显大于对照组 ,胸腺质量均明显小于对照组 ,说
明当归多糖对机体的免疫器官有明显的作用。当归
多糖对淋巴细胞也有较强的活性作用 ,可促进小鼠
体内外脾淋巴细胞的增殖 ,激活淋巴细胞的增殖活
性。当归多糖对机体免疫功能的机理 ,与其对免疫
器官以及淋巴细胞和细胞介质的作用有关 。当归多
糖亦可使荷瘤小鼠的巨噬细胞数目及吞噬能力以及
脾细胞的 NK活性显著增加 ,从而提高主动免疫治
疗效应[ 8] 。鉴于当归多糖对机体的非特异和特异性
免疫功能均有促进作用 ,本实验中我们欲从角质形
成细胞凋亡角度出发 ,来探讨当归多糖腹腔注射对
豚鼠银屑病样动物模型的治疗作用。
在本实验中 ,我们采用 TUNEL 技术检测了造
模前后及当归多糖治疗后豚鼠银屑病样皮损中角质
形成细胞的凋亡情况。涂药前(正常豚鼠)皮肤仅颗
粒层部分角质形成细胞阳性;而涂药后(造模豚鼠)
皮肤各层均分布 TUNEL 阳性细胞 ,且阳性强度明
显高于正常豚鼠皮肤 ,这说明细胞凋亡的异常增多
可能在银屑病模型中有十分重要的意义 ,这与 Bian-
chi的研究结果相一致 。Bianchi等发现银屑病中存
在着明显的细胞凋亡[ 9] ,他认为这种增多的细胞凋
亡对银屑病起有益作用 ,可借助其加快的细胞凋亡
清除过多增殖的角质形成细胞 。这也为解释银屑病
皮损表皮更新时间缩短提供了可能的理论依据 。当
归多糖三个剂量组治疗后 ,豚鼠耳部皮肤 T UNEL
阳性细胞数均有不同程度增加 ,与治疗前相比差异
有显著性 ,表明当归多糖对豚鼠银屑病样皮损中角
质形成细胞的凋亡有促进作用 ,但三个剂量组治疗
后凋亡指数比较并无统计学差异 ,推测可能与中药
作用时间迟缓 、实验用药和观察时间过短有关。当
归多糖腹腔注射诱导豚鼠耳部银屑病样皮损表皮角
质形成细胞凋亡增加的现象 ,推测可能是某些未达
到正常分化程度的角质形成细胞在药物作用下加速
凋亡速度被清除出去的结果 ,当归多糖具有促进角
质形成细胞凋亡的作用 ,从而维持细胞群体数量的
自身稳定 ,达到治疗银屑病的作用 。但本实验只是
一个初步的结果 ,有待进一步深入研究来探讨当归
多糖对银屑病角质形成细胞凋亡的确切作用 ,从而
为临床治疗银屑病开辟出新的领域。
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(2005-12-26 收稿)
编辑　沈建国
(上接第 376页)
娠的维持中起重要作用 ,而 Th1 型细胞因子刺激产
生的免疫使流产率 、先兆早产率增加 ,使妊娠中止 ,
不利于妊娠。可见 Th1/Th2间平衡对妊娠的结局
有一定影响。
40%的 PROM 与亚临床感染有关。本实验研
究发现一定浓度的 TNF-α刺激胎膜细胞后 IL-18的
表达明显增加 , IL-18是一种 T H1型反应的刺激因
子。由此推测 PROM 的发生可能与 IL-18诱导 Th1
细胞的细胞毒作用 ,而 Th1细胞的细胞毒作用是由
FasL 介导的。Fas-FasL 系统是机体清除无用的免
疫细胞 ,维持免疫系统自身稳定的重要因素 。 IL-18
可增强 Th1细胞 、NK 细胞 FasL 的表达从而选择性
地增强了 Fas-FasL介导的细胞毒活性。Fas通过与
其特异性配体 FasL 结合而在细胞膜表面发生聚合
形成复合物通过 FADD(带有死亡结构领域的 Fas
相关蛋白)与 caspase-8(半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋
白酶)特异的结构域结合并使 caspase-8形成二聚体
自身激活 ,进而引起下游 caspase-3等酶系激活而导
致胎膜细胞凋亡 。
综上所述 , PROM 时可能由于局部亚临床感染
TNF-α升高导致 IL-18 增加诱导 Th1 应答 ,通过
Fas-FasL 介导的细胞毒作用最终胎膜细胞凋亡 。这
可能是 PROM 发生的机理之一 。PROM 的发生有
着复杂的机制 ,对其深入研究将有助于进一步阐明
PROM 的发病机制及探索有效的治疗 PROM 的方
法。
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(2005-11-16 收稿)
编辑　孙孝云
380