全 文 ：第30卷第 12期　　　　　　　 　西 南 大学 学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　2008年1 2月
Vol.30　No.12 Journal of Southw est Unive rsity (N atural Science Edi tion) Dec.　2008
文章编号:1673-9868(2008)12-0134-05
韭莲组培快繁及其石蒜碱和加兰他敏积累的研究＊
冯　巍1 , 2 , 3 , 　谈　锋1 , 2 , 3 , 　谢　峻1 , 　陈　斌1 , 　苏　静1
1.西南大学 生命科学学院 , 重庆 400715;2.三峡库区生态环境教育部重点实验室 , 重庆 400715;
3.重庆市三峡库区植物生态与资源重点实验室 , 重庆 400715
摘要:以韭莲组培苗鳞茎为试验材料 , 通过正交试验筛选出最佳的小鳞茎增殖培养基:MS+6-BA 0.5 mg/ L+
NAA 1.5 mg/ L+蔗糖 50 g/ L.将诱导得到的小鳞茎苗转入添加了不同激素和蔗糖浓度的 1/ 2MS 培养基上 , 得
到最适生根培养基为 1/ 2MS+NAA 0.5 mg/ L+蔗糖 15 g/ L , 移栽成活率 100%.利用 RP-HPLC 法测定组培苗
和野生苗鳞茎中石蒜碱和加兰他敏的含量 , 韭莲组培苗鳞茎中石蒜碱和加兰他敏的含量分别为 204.83 μg/g ,
98.7 μg/ g;野生苗鳞茎中石蒜碱和加兰他敏的含量分别为 225.36 μg/ g , 63.72 μg/ g.组培苗鳞茎中加兰他敏的
含量是野生苗鳞茎的 1.55 倍.
关　键　词:韭莲;组织培养;正交试验;石蒜碱;加兰他敏;反相高效液相色谱法
中图分类号:Q983.11 文献标识码:A
韭莲(Zephy ranthes grandi f lora Lindl.), 又名风雨花 、赛番红花(广西 、贵州)、红玉帘 , 石蒜科(Am-
a ry llidaceae)葱莲属(玉帘属 Zephyranthes Herb.)植物 , 多年生草本 , 原产南美 , 我国引种栽培供观赏[ 1] .
全草及鳞茎入药 , 有散热解毒 、活血凉血的功能 , 用于跌伤红肿 、毒蛇咬伤 、吐血 、血崩[ 2] .其繁殖培育主
要通过分球法繁殖 , 2 ～ 3年分球一次.采用组织培养方法可大量繁殖鳞茎 , 为快速繁殖种球创造了条件.陈扬
春[ 3] 就不同激素对韭莲小鳞茎诱导效果进行了初步研究 , 国内外还未见其它有关韭莲离体快繁的报道.
石蒜科石蒜属植物 , 含有石蒜碱 、力可拉敏和加兰他敏等生物碱 , 具有镇静 、镇痛 、解热 、降压 、抗炎 、
催吐 、抗病毒 、抗癌等作用[ 4] .目前尚没有关于韭莲中生物碱含量测定结果的报道 , 为充分利用和开发资
源 , 利用 RP-HPLC法测定了同科植物韭莲组培苗和野生苗鳞茎中石蒜碱和加兰他敏的含量.
1　材料和方法
1.1　材　　料
供试材料采自重庆忠县 , 由西南大学生命科学学院邓洪平副教授鉴定为韭莲 , 并将其栽培于西南大学
生命科学学院药用植物园.
1.2　培养条件
实验所选择的基本培养基为 MS 培养基 , 附加植物激素(6-BA 、NAA 、 IBA)和不同浓度的蔗糖 , 琼脂
7 g/L , 培养基 pH 值为 5.8.照度 800 lx , 光照时间为 12 h/d , 培养温度为(23±1)℃.
1.3　小鳞茎增殖培养及生根诱导
1.3.1　外植体的获取
将韭莲的鳞茎及根部洗净 , 剥去外层鳞片 , 切除根部和鳞茎上部的叶片 , 将整个鳞茎流水冲洗 1.5 h ,
切去鳞茎上半部分约1/2 ～ 2/3 , 将剩余带鳞茎盘的鳞茎移至超净工作台.切成四等份后置于 70%酒精中浸
＊ 收稿日期:2008-06-02
基金项目:重庆市三峡库区植物生态与资源重点实验室资助项目.
作者简介:冯　巍(1983-), 女 , 河南南阳人 , 硕士研究生 , 主要从事药用植物生物技术和生化工程方面研究.
通讯作者:谈　锋 , 教授 , 博士生导师.
DOI :10.13718/j.cnki.xdzk.2008.12.021
泡 0.5 ～ 1 min , 再用0.1%的升汞灭菌15 min.无菌水清洗 3 ～ 5遍 , 在无菌滤纸上吸干鳞茎表面水分后将
小鳞茎切留距鳞茎底部 1.0 ～ 2 cm的高度 , 之后将鳞茎切成带有鳞茎盘的双鳞片 , 竖插接种于小鳞茎诱导
培养基中 MS+6-BA 1.0 mg/ L+NAA 1.0 mg/L +蔗糖 30 g/ L.30天后将得到的小鳞茎剥下 , 作为鳞茎
增殖培养的试验材料.
1.3.2　小鳞茎的增殖培养
采用 L9(34)正交试验的方法来筛选最佳的小鳞茎增殖培养基 , 根据预实验确定了不同因素水平(表
1)、不同培养基配方(表 2), 将诱导得到的小鳞茎剥下后 , 切留距鳞茎底部 0.5 cm 左右的高度接种到不同
的增殖培养基中 , 每瓶接种 1 ～ 2个小鳞茎.观察小鳞茎被诱导增殖的情况并统计 30天时小鳞茎的增殖系
数和诱导率.
1.3.3　小鳞茎的生根诱导
将从增殖培养基中的小鳞茎同前(1.3.2)处理接种到通过正交试验筛选得到的最佳培养基中 , 30天后
将诱导得到的小鳞茎从其鳞茎基部切下转入附加了不同激素和蔗糖浓度的 1/2MS 培养基中生根 , 60天时
统计其生根数和生根率.小鳞茎生根培养基见表 3.
表 1　植物激素与培养条件正交实验因素水平表
水　平 因　　　　　素
A(6-BA)/(mg · L-1) B(NAA)/(mg · L-1) C(蔗糖)/(g · L-1)
1 0.5 0.5 30
2 1.0 1.0 40
3 1.5 1.5 50
表 2　韭莲鳞茎增殖培养正交实验结果
不同处理 因　　　素
A B C
接种数 增殖系数 诱导率/ %
1 0.5 0.5 30 12 2.08 83.33
2 0.5 1.0 40 12 1.75 66.67
3 0.5 1.5 50 12 3.58 100.00
4 1.0 0.5 40 12 2.33 75.00
5 1.0 1.0 50 12 2.58 83.33
6 1.0 1.5 30 12 2.00 75.00
7 1.5 0.5 50 12 1.83 58.33
8 1.5 1.0 30 12 1.75 83.33
9 1.5 1.5 40 12 1.08 50.00
K 1 2.47 2.08 1.94 最佳组合 A1B3C3
K 2 2.31 2.03 1.72
K 3 1.56 2.22 2.67
R 0.91 0.19 0.95
　　注:K i 为水平 i 的平均值;R 为极差.
1.4　韭莲鳞茎中石蒜碱和加兰他敏含量测定
岛津高效液相色谱仪;LCSolution色谱工作站;CTO-10AS 柱温箱;SPD-20A 紫外检测器;LC-20A T
泵;石蒜碱标准品购自北京天宝物华生物技术有限公司 , 批号:20060714;加兰他敏标准品购自南京青泽
医药科技开发有限公司(批号:20060821).
除去鳞茎的叶 、根须及角质化的皮 , 将球茎切成薄片 , 80 ℃烘干 , 冷至室温后粉碎过 100目筛待用.
称取 1.0 g 于折叠好的滤纸中 , 加入1.0 mL 蒸馏水 , 放置浸泡 10 min , 再放入微波炉以 300W微波功率辐
射 2.0 min(辐射 15 s 后间隔 15 s再辐射)[ 5] , 然后将石蒜样和滤纸一块儿转移到索氏提取器中 , 再加入
100 mL 95%乙醇 , 于 85 ℃水浴中加热回流 8 h.将提取液浓缩至干 , 用 2.0%HCL 溶液 20 mL 溶解 , 抽
滤;再用氨水调节水相 pH >10 , 15 mL 三氯甲烷萃取 3次 , 合并三氯甲烷液后减压旋干 , 用水溶解 、定容
到 5 mL , 再通过 0.22 μm 滤膜 , 取过滤液为供试品溶液[ 6] .精密称取石蒜碱 , 加兰他敏对照品适量 , 用流
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动相配成 50 μg/mL , 75μg/mL 的溶液 , 作为对照品溶液.用 RP-HPLC 法检测石蒜碱和加兰他敏的含量.
将测得的峰面积按照下列关系式计算得出样品中石蒜碱和加兰他敏的含量:Cx =(Ax×Cs)/ As , 其中 , Cx
为样品中某种组分的含量(μg/g DW);Ax 为样品中该组分的吸收峰面积;Cs为该组分对照品的含量;As
为该组分对照品的吸收峰面积.
色谱条件:Waters C18色谱柱(4.6 mm×150 mm , 5 μm);流动相:磷酸盐缓冲液(pH 3 ～ 4)-甲醇(94
∶6)(磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钾 2.72 g , 加水100 mL 使溶解 , 加三乙胺1.4 mL , 用磷酸调pH 至 3 ～ 4 ,
加水至 1 000 mL , 摇匀 , 即得);柱温 30 ℃, 流速 1.0 mL/min[ 6] , 检测波长 232 nm[ 5] , 进样量 20μL.
表 3　韭莲生根试验结果
1/2MS 培养基中不同激素浓度和蔗糖浓度
NAA/(mg· L-1) IBA/(mg· L -1) 蔗糖/(g· L-1) 接种数 生根外植体数
外植体平
均生根数
生根率
/ %
0.5 0 30 24 15 2.00 62.50
1.5 0 30 22 15 1.55 68.18
2.5 0 30 22 22 3.55 100.00
0.5 0 15 24 24 3.38 100.00
0 0 30 24 10 0.67 41.67
0 0.5 30 24 16 1.58 66.67
0 1.5 30 19 9 1.63 47.37
0 2.5 30 24 19 1.58 79.17
0 0.5 15 24 14 1.04 58.33
2　结果与分析
2.1　小鳞茎的增殖培养
1周后 , 接种的外植体整体膨大;2周后 , 在切面处有不同数量的白色粒状突起出现 , 其中 , 3号和 5
号增殖培养基中外植体最先出现白色粒状突起.30天时 , 不同增殖培养基中都有外植体长出了数量不等 ,
大小不一的小鳞茎(图 1).
表 2中列出了 30天时不同增殖培养基的增殖系数和诱导率 , 对其结果进行直观分析得出:3种因素对
诱导韭莲鳞茎增殖的效应大小依次为蔗糖 ,6-BA ,NAA.方差分析结果表明(表 4), 蔗糖和 6-BA 对韭莲鳞
茎增殖的诱导效应达到极显著水平 , NAA 诱导效应不显著.利用 SSR法对蔗糖和 6-BA 诱导韭莲鳞茎增
殖的效果进行多重比较 , 结果见表 5.由表 2中 K 值的大小可以看出 , 诱导韭莲鳞茎增殖的最佳培养基组
合为 A1B3C3 , 这恰与该次正交试验中诱导韭莲鳞茎平均增殖数最高的 3号处理相同.因此 , 诱导韭莲鳞
茎增殖的最佳培养基为:MS+6-BA0.5 mg/L+NAA1.5 mg/ L+蔗糖 50 g/L , 月平均增殖系数为 3.58.
2.2　小鳞茎的生根培养
由表 3可知 , 不添加任何激素的 1/2MS 生根培养基 , 其平均生根数和生根率均低于添加了激素的生根
培养基.NAA 诱导的生根率普遍比 IBA高 , 并且经 IBA 处理的小鳞茎长出的根又细又长 , 不及 NAA 处
理后长的根粗壮和生长旺盛.在加了 NAA 2.5 mg/ L和蔗糖 30 g/L 的生根培养基中 , 其生根率和平均生
根数都高 , 但是根稍有点愈伤化.故最佳生根培养基为 1/2MS+NAA0.5 mg/ L+蔗糖 15 g/L(图 2).
小鳞茎在生根培养基中培养 60天后 , 其根已达 4 ～ 6 cm 长 , 打开培养瓶盖在无菌室内炼苗 2 ～ 3 天后
移栽到装有富含腐殖质土壤的花盆中(图 3), 成活率达 100%.
表 4　韭莲鳞茎增殖的方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F 值 p 值
A 17.166 7 2 8.583 3 5.009 5＊＊ 0.008 4
B 0.722 2 2 0.361 1 0.210 8 0.810 3
C 17.555 6 2 8.777 8 5.123 ＊＊ 0.007 6
Se1 10.722 2 2 5.361 1
Se2 162.333 3 99 1.639 7
合并误差 173.055 6 101 1.713 4
　　＊＊表示差异极显著.
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表 5　6-BA和蔗糖诱导鳞茎增殖的多重比较
6-BA
/(mg · L-1) 均值
5%显著
水平
1%极显
著水平
蔗糖
/(g · L-1) 均值
5%显
著水平
1%极显
著水平
0.5 2.472 2 a A 50 2.666 7 a A
1.0 2.305 6 a A 30 1.944 4 b B
1.5 1.555 6 b B 40 1.722 2 b B
2.3　组培苗和野生苗鳞茎中石蒜碱和加兰他敏含量的比较
将在最佳生根培养基中培养 3 个月的组培苗鳞茎及 2年生野生苗的鳞茎按 1.4 的方法处理并进行
HPLC 测定 , 结果见图 4.经换算 , 韭莲组培苗鳞茎中石蒜碱和加兰他敏的含量分别为 204.83 μg/g ,
98.7 μg/g;野生苗鳞茎中石蒜碱和加兰他敏的含量分别为 225.36 μg/g , 63.72 μg/g.组培苗鳞茎中石
蒜碱的含量是野生苗鳞茎的 90.89%, 而加兰他敏的含量则是野生苗鳞茎的 1.55 倍.
图 4　石蒜碱和加兰他敏的对照品(A)、韭莲组培苗鳞茎(B)、韭莲野生苗鳞茎(C)的 HPLC图谱
3　小　　结
正交设计是多因素多水平分析的有力工具 , 采用正交设计的方法 , 可以精简试验次数 , 大大提高试验
结果的正确性和可靠性[ 7] .本文采用正交设计的方法 , 通过统计学分析 , 用较少的试验组合 , 筛选出韭莲
鳞茎增殖的最佳培养基 , 不仅为其离体快繁奠定了基础 , 更为次生代谢产物的利用 、生物合成途径等疑难
问题的研究提供了一个很好的技术平台.在本实验条件下 , 蔗糖浓度对小鳞茎的诱导增殖有极显著影响 ,
且影响最大 , 其原因可能是蔗糖具有诱导小鳞茎膨大的作用[ 8] , 因而在诱导小鳞茎增殖初期 , 接种的小鳞
茎外植体都是先膨大之后才长出小鳞茎突起的.同时 , 6-BA 对韭莲小鳞茎的诱导增殖也具有极显著影响 ,
再次佐证了细胞分裂素类物质对鳞茎的分化和膨大是十分必要的观点[ 9-10] .
利用 RP-HPLC 法测定了韭莲组培苗鳞茎和野生苗鳞茎中石蒜碱和加兰他敏的含量 , 组培苗鳞茎中加
兰他敏的含量是野生苗鳞茎中的 1.55倍 , 这一结果为离体大规模培养韭莲作为生物反应器获得加兰他敏
提供了理论支持.
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参考文献:
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Studies on Tissue Culture and Rapid
Propagation of Zephyranthes grandi f lora
and Accumulation of Lycorine and Galanthamine
FENG 　Wei1 , 2 , 3 , 　TAN 　Feng1 , 2 , 3 , 　XIE　Jun1 ,
CHEN 　Bin1 , 　SU　Jing1
1.School of Life Science , Southwest University , Chongqing 400715 , China;
2.Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region (Ministry of Education), Chongqing 400715 , China;
3.Key Laboratory of Plant Ecology and Resources in Three Gorges Reservoir Region , Chongqing 400715 , China
Abstract:The bulbs of Zephyranthes grandi f lora were used as explants in t issue culture.According to
the resul ts of o rtho gonal test L9(34), the optimal medium fo r bulb multiplication w as identif ied to be M S
+6-BA 0.5 mg/ L+NAA 1.5 mg/ L+sucro se 50 g/L .The optimum medium fo r rhizog enesis w as 1/2M S
+NAA 0.5 mg/L +sucrose 15 g/L , and a survival rate of 100%was achieved af ter the t ransplantat ion of
the rooted plantlets.De termination by RP-HPLC show ed that the contents of lycorine and galanthamine
were 204.83μg/g and 98.7 μg/g for the tissue culture-derived plant lets , respectively , or the content of
galanthamine w as 1.55 times for wild Z.grandi f lora(225.36 μg/g and 63.72 μg/g).
Key words:Zephyranthes grand i f lora;tissue culture;orthogonal test;lycorine;galanthamine;HPLC
责任编辑　胡　杨　　　　
138 西南大学学报(自然科学版)　　　　　投稿网址 http://xbg jx t.sw u.cn　　　　　第 30卷