全 文 ：图 1　栀子蓝色素转化标准曲线
Figure 1　The standard curve of Gardenia blue conversion rate
2.4.3　栀子蓝色素转化率的测定
在步骤 2.3.3培养时间对栀子蓝色素生成量的影响试验
中 ,分别取发酵 12h 、16h 、20h 、24h、36h 后发酵液进行水解及转
化 ,按方法 1.2.4 栀子蓝色素转化率的定义及 2.4.1栀子蓝色
素转化标准曲线的结果 ,计算转化率 , 结果见表 3:
表 3　发酵培养时间对栀子蓝色素转化率的影响
Table 3　Ef fects of culture time on the Gardenia blue conversion rate
A(12h) B(16h) C(20h) D(24h) E(36h)
OD 238(试) 57.8 57.8 57.8 57.8 57.8
OD 590(试) 5.22 9.03 13.78 15.98 17.06
OD 590(标) 17.34 17.34 17.34 17.34 17.34
转化率(%) 30.10 52.08 79.47 92.16 98.43
　　由表 3可知 , 培养 12h 后取样检测 ,转化率较低 , 24h 后转
化率较大于 90%, 36h 后转化率达 98.43%, 36h 后转化率不再
增大。
2.5　离子交换树脂分离栀子蓝色素实验
通过静态吸附实验筛选出 D301 离子交换树脂为吸附剂 ,
将树脂按厂家规定预处理后装柱 , 取方法 1.2.2 栀子蓝色素
溶液 ,用恒流泵上样 , 流速为 3 mL min , 饱和吸附后 , 用 1mol L
盐酸溶液作为洗脱剂 ,收集洗脱液 ,低温干燥 , 得蓝黑色粉末 ,
色价 E1%1cm(590nm)为 55.6。
2.6　薄层层析法分析栀子蓝色素的纯度
将硅胶板 110℃活化后 ,点样(10μL), 15℃恒温展开 , 结果
见图 2 , 展开后出现一个蓝色斑点 , Rf=0.428。
图 2　薄层层析结果图
3　讨论
实验选用宇佐美曲霉(Asergillus usamii)AS -3.758 为产 β
-葡萄糖苷酶菌株 , 对发酵培养基配方 、发酵工艺条件与栀子
蓝色素转化率之间的关系进行了较系统的探讨 ,并研究了离
子交换树脂分离纯化栀子蓝色素的方法 , 获得了高色价的栀
子蓝色素产品。结果为:选用发酵培养基配方为栀子黄废液
4%、K2HPO4 0.4%、NaNO3 0.3%、接种量 4%(V V)、摇瓶装量
为 80mL 250mL、起始 pH 值 6.5、培养温度为 29℃、摇床转速为
200r min 、发酵培养时间为 36h ,发酵结束后置于 50℃水解时间
12h ,过滤除去菌丝 , 滤液中加入 0.7%谷氨酸钠 , 80℃反应 1h ,
得栀子蓝色素液 , 转化率达 98.43%。色素液经 D301 离子交
换树脂吸附 , 再用 1.0mol L 盐酸洗脱 , 洗脱液经低温干燥得到
的栀子蓝色素 , 色价 E1%1cm(590nm)达 55.6 ,高于文献报道值及国
家标准。
参考文献:
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子蓝色素最佳条件的研究[ J] .食品工业科技 , 2004,(7):110-112.
赤藓糖醇发酵工艺研究
杨晓伟 ,吴燕 ,吕惠敏 ,王卫华 ,陆茂林(江苏省微生物研究所有限责任公司 , 江苏 无锡 214063)
摘要:赤藓糖醇的制备方法主要为微生物发酵法。为提高圆酵母(Torula sp.)B84512 转化葡萄糖生产赤藓糖醇的发酵产量 ,
采用控制发酵过程中葡萄糖起始浓度(30.0%)、中间流加葡萄糖浆的工艺使总葡萄糖糖浓度达到 40%, 发酵 120h可产赤藓糖醇
162.5g L ,生产率为 1.35g L·h ,而不采取中间流加工艺 , 起始葡萄糖浓度为 40.0%, 发酵 120h 可产赤藓糖醇 120 g L , 生产率为 1.
00g L·h。通过研究发现在赤藓糖醇发酵过程中采取中间流加葡萄糖工艺 , 能大大提高赤藓糖醇的发酵水平 ,提高幅度达 30-
35%,生产率也有相应提高。
关键词:赤藓糖醇 ;发酵;葡萄糖浓度;中间流加
中图分类号:Q815　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2005)04-0063-03
Study on Fermentation Process of Erythritol
YANG Xiao-wei ,WU Yan ,LV Hui-min ,WANG Wei-hua ,LUMao-lin
(Jiangsu Inst itute of Microbidogy Co.Ltd.,Wuxi 214063 ,P.R.China)
Abstract:Major manufacture method of erythritol was fermentation process by microorganism.Erythritol production was increased by control the
initial concentration of glucose(30.0%)and use fed-batch glucose fermentation process .After 120 hrs , the yield of erythritol was increased to
162.5 g·l-1 with a rate of 1.35 g·l-1 h-1.Used the fed-batch glucose fermentation process , the concentration of erythritol production was in-
creased 30%-35% and the product rate as so.
Key words:erythritol;fermentation;glucose concentration;fed-batch
收稿日期:2005-02-04;修回日期:2005-06-21
基金项目:江苏省科研院所转制专项基金项目(“发酵法生产新型甜味
剂赤藓糖醇的工业化研究” , BM2002521)
作者简介:杨晓伟(1966-),男 ,学士 ,助理研究员 ,研究方向:功能性
食品 , E-mail:jsimyxw5922@sina.com。
　　赤藓糖醇是一种既含甜味又无热量的四碳多元醇。它广
泛存在于海藻 、蘑菇 、瓜类 、葡萄 、梨以及发酵食品中;同时 , 也
存在于人和动物的组织及体液中。 赤藓糖醇具有低能量值 、
高耐受量 、无副作用 、糖尿病人可食用 、非致龋齿性等优越特
性 , 极其适合应用于功能性食品中[1] 。
赤藓糖醇的制备方法主要为微生物发酵法 。日本 、韩国 、
比利时等均在研究开发赤藓糖醇。日本研究者从土壤 、发酵
食品 、果实 、花粉等采样进行分离 、筛选 、诱变育种得到了产赤
藓糖醇的耐高渗酵母菌株 Aureoasidium sp.SN-115 , 以葡萄糖
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2005 年 8 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.15 , No.4:63
Aug.2005
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2005.04.029
为基质 ,赤藓糖醇的得率约为 50%[ 2] 。 韩国 Jinb.Park 等筛选
到一株耐高渗丝孢酵母 Trichosporon sp., 该菌株在 35℃条件
下 ,发酵葡萄糖产生 141g L的赤藓糖醇 ,得率为 47%[3] 。台湾
Shie-Jea Lin 等筛选到 28 株赤藓糖醇产生菌 , 其中 166-2 菌
株发酵 30%的葡萄糖可产赤藓糖醇 111.0g L[4] 。我国发酵法
生产赤藓糖醇的研究开发工作起步较晚。无锡江南大学生工
学院的范光先等筛选到一株单产赤藓糖醇的球状酵母 OS-
194 ,耗糖转化率达到 29.6%[ 5] 。 作者对本实验室分离的赤藓
糖醇产生菌 B84512 采用了中间补料流加葡萄糖的发酵工艺 ,
大大提高了赤藓糖醇的发酵水平。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
菌种选自本实验室保藏圆酵母(Torula sp.)B84512。
1.1.2　试剂
赤藓糖醇标准品 , Sigma公司产品;其它为分析纯试剂。
1.1.3　仪器
德国贝朗 22L全自动发酵罐;上海分析仪器厂 721 分光光
度计;岛津 LC-10ASHPLC 仪。
1.1.4　培养基与培养条件
1.1.4.1 斜面培养基
葡萄糖 200g , 酵母膏 10g , 尿素 1g , 琼脂 20g , 自来水
1000mL, pH6.0。
1.1.4.2　种子培养基
葡萄糖 200g , 酵母膏 10g ,尿素 1g ,自来水 1000mL , pH6.0。
1.1.4.3　分批发酵培养基
Ⅰ .葡萄糖浓度 30.0%, 酵母膏含量为 1.0%, 尿素为 0.
1%,FeSO4·7H2O 0.001%, ZnSO4·7H2O 0.001%, pH 6.0 , 发酵
液总体积 12L。
Ⅱ.葡萄糖浓度 40.0%, 酵母膏含量为 1.0%, 尿素为 0.
1%,FeSO4·7H2O 0.001%, ZnSO4·7H2O 0.001%, pH 6.0 , 发酵
液总体积 12L。
1.1.4.4　补料分批发酵培养基
葡萄糖浓度 30.0%, 酵母膏含量为 1.0%,尿素为 0.1%,
FeSO4·7H2O 0.001%, ZnSO4·7H2O 0.001%, pH 6.0 ,发酵液初
始体积 9.6L , 当糖度降至 20%左右时以 0.1L h 的速率流加
80.0%浓度的葡萄糖液共 2.4L。
1.1.4.5　发酵过程控制
发酵温度 34℃, 通气量 0.5vvm , 菌体生长期控制溶氧为
30%, 50h 后调整溶氧为 15%, 直至发酵结束。
1.2　方法
1.2.1　葡萄糖含量测定:3 , 5-二硝基水杨酸比色法[ 6] 。
1.2.2　赤藓糖醇含量测定
1.2.2.1　化学法[ 7]
取适当稀释样品 0.5ml , 加高碘酸试剂 0.5ml 混匀 , 静置
8min , 加氯化亚锡试剂 0.5ml ,混匀 , 加变色酸试剂 5ml振摇后 ,
沸水浴 30min 冷却 ,于 570nm 测定光吸收值 , 然后按已得到的
光吸收值与标准品浓度的回归方程计算。
1.2.2.2　HPLC(高压液相色谱法):
色谱柱:Hypersil NH2(4.6×250mm , 5μm)
柱　温:30℃
流动相:乙晴-水(85:15)
流动速率:1ml min
检测器:Waters 600 2410(示差折光检测器)
2　结果与讨论
2.1　葡萄糖浓度对发酵产赤藓糖醇的影响
试验了不同葡萄糖浓度发酵产赤藓糖醇的情况 , 培养基
中葡萄糖浓度分别为 10%、20%、30%、40%、50%,酵母膏含量
为 1.0%, 尿素为 0.1%, FeSO4·7H2O 浓度 0.001%, ZnSO4·
7H2O 浓度 0.001%, pH 6.0 , 34℃培养 5d。结果见表 1。由表 1
可见 , 葡萄糖浓度为 30%、40%时发酵赤藓糖醇转化率较高。
表 1　葡萄糖浓度对发酵产赤藓糖醇的影响
Tab 1　Effect of glucose concentration on erythritol production
葡萄糖浓度(%) 10 20 30 40 50
赤藓糖含量(g L) 37.3 66.0 118.4 152.0 134.6
转化率(%) 37.3 33.0 39.5 38.0 26.9
2.2　22L全自动发酵罐试验
在 22L发酵罐发酵试验中 , 进行了分批发酵及补料分批
发酵试验。结果如图 1(A 、B、C)所示。
图 1　22L罐赤藓糖醇发酵曲线
Fig.1　Fermentation diagram of erythritol in 22L-fermentor
培养基成份:A:30.0%葡萄糖;
B:40.0%葡萄糖;
C:30.0%葡萄糖 ,连续流加至 40.0%。
从图 1A、图 1 B 可以看出 ,当葡萄糖浓度为 30%时 , 40h 左
右酵母细胞生长进入稳定期 , 110h 赤藓糖醇产量达到 112.9g
L ,生产率 1.03g L·h;当葡萄糖浓度为 40%时 , 60h 左右酵母细
胞生长进入稳定期 , 140h赤藓糖醇产量达到 159.5g L , 生产率
1.14g L·h ,这是由于葡萄糖浓度太高 , 延滞了细胞的生长 , 推
迟了发酵时间 , 但从生产率看 , 初始葡萄糖浓度为 40%时较
高 , 故考虑采用流加补料发酵工艺。
图 1C 初始葡萄糖浓度 30%连续补加葡萄糖浆使总糖浓
64　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 15 卷第 4期
度达到 40%的发酵过程曲线。从图 1C 可知连续补料 , 45h 左
右酵母细胞生长进入稳定期 ,与分批发酵基本相同 , 发酵 120h
可产赤藓糖醇 162.5g L, 生产率为 1.35g L·h。故选择初始葡
萄糖浓度 30%、中间流加葡萄糖浆使总葡萄糖糖浓度达到
40%的工艺路线。
3　结论
利用赤藓糖醇高产菌种圆酵母(Torula sp.)B84512 , 通过
控制发酵过程中发酵液葡萄糖起始浓度 , 中间流加葡萄糖方
法使总葡萄糖糖浓度达到 40%, 能大大提高赤藓糖醇产量 , 发
酵120h可产赤藓糖醇 162.5g L , 生产率为 1.35g L·h.此工艺
国内未见报道。
参考文献:
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耐氨米根霉发酵生产 L-乳酸的研究
匡群 ,孙梅 ,施大林 ,刘淮 ,胡凌红 ,陈秋红 ,陆茂林(江苏省微生物研究所有限责任公司 , 江苏 无锡 214063)
摘要:传统的 L-乳酸发酵法生产以 CaCO3 为酸中和剂 ,在乳酸后提取中产生的大量石膏废渣不仅在过滤时造成较大的乳
酸损失 ,而且由于废渣不易处理 , 对 L-乳酸万吨级规模的生产将形成巨大的环保压力和废渣处理成本。为此 , 为了降低 L-乳
酸生产成本 ,该文采用氨水为酸中和剂 , 用筛选得到的一株米根霉 Rhizopus oryzae JS-N02-02 进行以氨水为中和剂的 L-乳酸摇
瓶 、15L自动发酵罐的发酵试验。以玉米粉双酶水解糖为碳源 , 接种孢子浓度 1×105 个 ml , 以 0.01%(NH4)2 SO4 为氮源 , 30℃,
15L自动发酵罐连续 5批发酵 , 平均总糖浓度为 136.8g L ,平均产酸达 100.6g L , L-乳酸纯度达 95.3%,糖酸转化率达71.6%。
关键词:米根霉;氨水中和;发酵;L-乳酸
中图分类号:Q815　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2005)04-0065-03
Study on the L-lactic Acid Production by
Ammonia Resistant Strain R .oryzae JS-N02-02
KUANG Qun ,SUN Mei , SHI Da-lin , LIU Huai , HU Ling-hong , CHENG Qiu-hong , LU Mao-lin
(Jiangsu Insititue of Microbiology Co.Ltd., Wuxi 214063 , P.R.China)
Abstract:For traditional L-lactic acid production process , in which CaCO3 was used as neutralizer , calcium sulfate residue from the recovery pro-
cedure , not only caused the loss of L-lactic acid during filtration but also increased the disposal cost , especially for the mass production of L-
lactic acid at a ten-thousand-ton level.Therefore , fermentation with ammonia as neutralizer to replace CaCO3 was studied in shake-flask and
15L fermentation tank.Ammonia resistant strain Rhizopus oryzae JS-N02-02 was selected to ferment enzyme hydrolysate of corn at 30℃ in 15L
fermentation tank , with the spore concentration of 1×105 cfu.ml-1 inoculated and(NH4)2SO4(0.1g L)as nitrogen source , the average total sugar
concentration controlled at 136.8g L , the average yield of lactic acid in 5 successive batches , reached 100.6g L, the optical purity of L-lactic
acid reached 95.3%, the lactate-glucose conversation rate reached 71.6%.
Key words:Rhizopus oryzae;ammonia;neutralization;fermentation;L-lactic acid
收稿日期:2005-03-26;修回日期:2005-05-24
作者简介:匡群(1962-), 男 ,硕士 ,副研究员 , 研究方向:有机酸 、新
药 ,发表论文 10余篇。
　　乳酸是一种重要的有机酸 , 具有调味 、pH 值调节 、杀菌 、
防止杂菌生长等功能 ,乳酸及其衍生物可广泛应用于食品 、医
药 、农药 、烟酒 、印染 、纺织 、皮革 、印刷 、化工 、石油等行业。乳
酸有两种同分异构体 D-(-)-乳酸和 L-(+)-乳酸 , 其中
L-乳酸在人体中自然存在 , 是WHO 没有限定用量的安全的
食品品添加剂[ 1] 。近年 , 以 L-乳酸为活性前体的可降解材料
聚乳酸 、绿色溶剂乳酸酯及新型绿色农药的开发成功[ 1 , 3] , 使 L
-乳酸的发展前景更为诱人 , 但降低 L-乳酸的生产成本 , 生
产高质量低价格的 L-乳酸则是其中的的关键。在传统的米
根霉L-乳酸发酵过程中 , 随着产酸的进行 , 发酵液pH 不断下
降 ,当 pH 低于 5 时 , 菌体的生长和产酸会受到抑制 , 因此 , 常
采用添加 CaCO3 控制 pH ,使乳酸发酵能正常进行。当初糖浓
度高于 120g L时 ,发酵中后期醪中的乳酸钙浓度很高 , 乳酸钙
极易结晶析出 , 发酵液粘稠 , 形成稳定的高泡沫 , 影响供氧水
平 ,降低产酸速度和形成杂酸。为了提高溶氧水平 , 常提高搅
拌速度或提高通气量 ,这样不仅增加能耗 , 而且容易出现跑料
现象 , 增加染菌机会 , 降低发酵罐的装液系数。此外 , 在乳酸
后提取中产生的大量石膏废渣不仅在过滤时造成较大的乳酸
损失 ,而且由于废渣不易处理 , 对 L-乳酸万吨级规模的生产
将形成巨大的环保压力和废渣处理成本。为此 ,为了降低 L-
乳酸生产成本 , 采用新型中和剂的发酵新工艺及其相应的提
取新技术如膜分离技术等的研究引起人们极大的关注。
本文报道了对一株耐氨产 L-乳酸的米根霉 JS-N02-02
菌株的选育 , 以氨水为发酵中和剂 , 对该菌株的发酵性能及适
宜发酵条件进行了研究 , 并进行了摇瓶和 15L 自动发酵罐的
发酵比较试验 , 结果表明该新工艺具有良好的工业化应用前
景。本研究未见同类研究报道。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
菌种:米根霉 Rhizopus oryzae JS-N02-02 ,本研究所分纯
选育和保藏。
1.1.2　试剂
玉米粉 、麸皮为市售;其它试剂均为国产。
1.1.3　仪器
pH 计:梅特勒-托利多 Delta320。
15L自动发酵罐:B.GRAUN BIOSTAT C15-3。
SBA30乳酸生物传感分析仪 :山东省科学院生物研究所
研制。
1.1.4　培养基
斜面培养基:PDA培养基。
分离纯化培养基:察氏培养基 ,其中添加适量 L-乳酸铵 ,
制成 L-乳酸铵分离平板。
麸皮培养基:取未霉变结块或虫蛀的麸皮 ,按量加入 40%
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