全 文 ：生 物 技 术 2010 年 20(3)
机溶剂抽提 3 次才可以去除杂质。重复的工作量大，反复离
心耗时。而高盐低 pH 法只需一步醋酸钾沉淀便可以有效的
除去杂质，进行 DNA沉淀，工作量小，时间短。
总之，高盐低 pH 法试剂易得，步骤简单，时间短，是提取
高粱 DNA 的一种较好的方法。
经过反复摸索，对于利用高盐低 pH 法提取高粱基因组
DNA的适宜条件确定如下:提取液中含有 2% SDS、2% PVP、
2% β －巯基乙醇;水浴时间为 30min;沉淀方法采用 0. 7 体积
异丙醇室温沉淀的沉淀方法。提高离心转速至 14 000r /min，
保证了离心的效果。
参考文献:
［1］王传堂，黄粤，杨新道，等.改良 CTAB法和高盐低 pH值法提取花
生 DNA的效果［J］.花生学报，2002，31(3) :20 － 23.
［2］张宁，王凤山. DNA 提取方法进展［J］. 中国海洋药物，2004，2:40
－ 46.
［3］韩美丽，陆荣生，霍秀娟等.水稻 DNA快速提取及 RAPD分析体系
的优化［J］.江西农业科学，2009，21(5) :1 － 3.
［4］侯艳霞，汤浩茹，张勇，等. DNA 提取方法对一串红不同部位 DNA
提取的比较［J］.基因组学与应用生物学，2009，28(1) :94 － 100.
［5］张继红，陶能国，张小云，等. 三种豆科植物总 DNA 提取方法的比
较［J］.湖南农业科学，2007，(2) :31 － 33.
［6］李玥莹，彭霞，倪娜，等. 高粱 DNA 的提取纯化及抗丝黑穗病基因
的初步分析［J］.安徽农业科学，2008，36(5) :1776 － 1777，1820.
［7］许理文，王凤格，赵久然，等. 高盐低 pH 值法提取玉米基因组
DNA的研究［J］.玉米科学，2009，17(1) :59 － 61，70.
荒漠生物结皮中齿肋赤藓总 RNA最佳提取方法的确立
马 瑞1，杨红兰2，张元明2，张道远2，徐刚标1*
(1.中南林业科技大学生命科学院，湖南 长沙 410004;
2.中国科学院干旱区生物地理与生物资源重点实验室，中国科学院新疆生态与地理研究所，新疆 乌鲁木齐 830011)
摘要:目的:根据不同提取方法对提取荒漠齿肋赤藓总 RNA 质量的影响，寻找一种快速高效提取齿肋赤藓总 RNA 的方法。
方法:采用改良 RNAiso Reagent试剂法、RNAprep pure植物总 RNA提取试剂盒法(TIANGEN)、皂土法分别提取采自新疆古尔班
通古特沙漠生物结皮中齿肋赤藓的总 RNA，用紫外分光光度计测定其浓度、纯度和产量，并通过 RT － PCR 进一步检测其质量。
结果:三种方法均能提取出 RNA，但质量差异较大。其中改良的 RNAiso Reagent试剂法提取的 RNA产量可达 1 298 ～ 1 318μg /g，
完整性好且纯度高，OD260 /OD280值为 1. 86 ～ 1. 92，且经济、操作简便，能有效抑制多酚物质氧化和次生代谢物质的影响，，适合用
于进一步的 RT － PCR反应。结论:改良的 RNAiso Reagent法经济且操作简便，提取的荒漠齿肋赤藓 RNA完整性和纯度较高，可
用于 RT － PCR反应。
关键词:齿肋赤藓;总 RNA;提取;改良 RNAiso Reagent法;古尔班通古特沙漠
中图分类号:Q781 文献标识码:A doi:10. 3969 / j. issn. 1004 － 311X. 2010. 03. 052
A Method Established for Total RNA Extraction from Syntrichia caninervis
in a Temperate Desert
MA Rui1，YANG Hong － lan2，ZHANG Yuan － ming2，ZHANG Dao － yuan2，XV Gang － biao1*
(1. College of Life Science，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004;
2. Key Laboratory of Biogeography and Bioresource in Arid Land，Xinjiang Institute of Ecology and Geography，CAS，Urumqi 830011，China)
Abstract:Objective:To determine a rapid and efficient method for extracting total RNA from Syntrichia caninervis，a drought tolerant des-
ert moss，three tridational methods were selected and examined. Method:Methods of modified RNAiso Reagent，bentonite and RNAprep
pure total RNA isolation kit(TIANGEN)were chose to extract RNA from S. caninervis. The purity，quantity and productivity of extracted
RNA were determined by UV spectrophotometer，and its quality was measured through RT － PCR. Result:The qualities of total RNA iso-
lated from S. caninervis through three methods respectively were significantly different. Among three tested methods，the modified RNAiso
Reagent method could present an optimal result，and efficiently inhibited the influence of phenolic compounds and other secondary sub-
stances. The productivity of total RNA extracted by this method could reach 1 298 － 1 318μg /g，and the ratio of OD260 /OD280 could be
1. 86 to 1. 92. Conclusion:The modified RNAiso Reagent is a simple and convenient way for total RNA extraction，and could provide ex-
tracted RNA with good quality and high purity which is suitable for further molecular research such as RT － PCR.
Key words:Syntrichia caninervis;total RNA;isolation;modified RNAiso Reagent;Gurbantunggut Desert
收稿日期:2009 － 11 － 22;修回日期:2010 － 01 － 05
基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(2009CB825104) ;新疆自
治区重大专项(200731138 － 3) ;中科院知识创新工程(KZCX2 － YW －
336)资助
作者简介:马瑞(1986 －) ，女，新疆人，硕士生，从事分子遗传学研究，
Email:marui0611@ 163. com。* 通讯作者:徐刚标(1965 －) ，男，安徽
人，教授，博导，从事森林和群体遗传学研究，Email:gangbiaoxu@ 163.
com。
在进行 Northern 杂交分析、基因体外翻译、cDNA 文库构
建、cDNA末端快速递增(RACE)、差异显示反转录 PCR 等研
究时均需要高质量的 RNA。植物组织 RNA 的提取较动物和
微生物困难，原因是植物具有坚硬的细胞壁，同时富含多种次
生代谢物，如多糖、多酚、单宁等物质。在细胞破碎后，这些物
质将以不同方式干扰 RNA的提取，严重影响所提取 RNA的质
量和产量［1］。
有关苔藓植物总 RNA 提取的样品多集中在极地等水分
条件好、植株发育相对较大的苔藓植物个体［2，3］，对于长期生
活在恶劣自然环境下的荒漠耐旱藓类却未见报道。耐旱苔藓
植物为抵御沙漠恶劣的环境，常形成植株单个个体矮小、生物
量低、干燥时呈灰黑色的“枯死”状态［5］，体内含有较多的次生
代谢物质，能很好地适应荒漠恶劣生境，参与荒漠生物结皮的
形成［5］，具有重要的生态功能，但给 RNA 提取带来了很大的
困难。
齿肋赤藓(Syntrichia caninervis Mitt.)隶属丛藓科(Potti-
aceae)赤藓属(Syntrichia) ，为典型的变水植物，是构成藓类结
皮的优势种，自然干燥状态下呈灰黑色，似一层“壳”分布在沙
漠表面，不仅具有较强的抗逆能力，而且在维持荒漠生态系统
的稳定性和受损生态系统的恢复重建中起着重要的作用［5］，
其独特的生理特性和抗旱性的分子调控机制已成为国内外相
关学科的研究热点，但目前尚未见到齿肋赤藓 RNA 提取的报
道。本文比较 RNAprep pure 植物总 RNA 提取法、皂土法、改
良 RNAiso Reagent法提取齿肋赤藓总 RNA 的提取效果，并通
过 RT － PCR 验证所得 RNA 的质量，以期为耐旱藓类植物
RNA的提取提供高效、可行的技术方法。
1 材料和方法
1. 1 材料
齿肋赤藓采集于古尔班通古特沙漠南缘。选取发育较好
的齿肋赤藓结皮装入铝盒带回实验室。室内，将齿肋赤藓结
皮放置于底部铺垫湿润滤纸的培养皿里，待叶片完全展开，小
心剥离出单个个体，剪去假根后用 ddH2O冲洗，然后将其装入
25
2010 年 20(3) 生 物 技 术
加满 ddH2O的离心管中，用超声波轻微振荡清洗 10 min，再用
ddH2O冲洗 3 次，滤纸吸干表面水分，用于 RNA提取。
RNAprep pure植物总 RNA 提取试剂盒与反转录试剂盒
购自 TIANGEN，RNAiso Reagent 试剂购自 TaKaRa，DEPC 和
DNA Maker购自上海生工，琼脂糖为 BBI 公司，皂土等试剂均
为分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 皂土法
称取 0. 03g样品放入预冷研钵中，研磨成粉末，加入皂土
提取液，提取液包括:25mmol /L柠檬酸钠(pH 7. 0) ，10mmol /L
EDTA，0. 5% SDS，0. 5% 皂土，均用 DEPC 水配制。操作方法
参照文献［6］。
1. 2. 2 RNAprep pure植物总 RNA提取试剂盒法
称取样品 0. 03g，放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨
成粉末状，加入提取液振荡混匀，操作依照 TIANGEN RNAprep
pure植物总 RNA提取试剂盒说明。
1. 2. 3 RNAiso Reagent试剂法
参照说明书并改进。①称取提取样品 0. 03g，加少许 PVP
粉末研磨充分至粉末状，加入 1mL RNAiso Reagent 试剂，室温
静置，直至样品完全融化后，继续研磨至裂解成透明状。②将
匀浆移至离心管，室温静置 5 min。③12 000g、4℃离心 5min，
吸取上清液，移入新的离心管。④向匀浆裂解液中加入氯仿
(RNAiso Reagent的 1 /5 体积量) ，盖紧离心管，用力震荡，待充
分乳化溶液呈乳白状(无分相现象)后，室温静置 5 min，12
000g 、4℃离心 15min。⑤取出离心管，吸取无色上清液至新的
离心管中，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶ 24∶ 1) ，混匀，室温
静置 5min，12 000g、4℃离心 10 min。⑦吸取上清液，加入等体
积乙二醇丁醚，上下颠倒离心管充分混匀后，室温静置 10min，
12 000g 、4℃离心 15 min。⑧小心弃去上清，缓慢沿管壁加入
75%乙醇 1mL，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12 000g 、4℃离
心 5min后小心弃去乙醇。⑨室温干燥 5min，加入适量 RNase
－ free水溶解沉淀。
1. 2. 4 RNA电泳分析
RNA的非变性琼脂糖凝胶电泳在 1 × TAE 中进行，琼脂
糖浓度为 1. 2%，3μL 上样量，100V 恒压 25 min，然后在紫外
凝胶成像系统中观察所提取 RNA的完整性。
1. 2. 5 RNA纯度鉴定
取 2μL 样品，稀释 100 倍，DU800 Spectrophotometer 测量
其在 230nm、260nm、280nm OD 值，计算 OD260 /OD280(R)和
OD260 /OD230，用于纯度分析。每种提取方法重复 3 次。
三种方法获得的总 RNA 产量采用 SPASS 13. 0 进行单因
素方差分析。
1. 2. 6 6RT － PCR
RT － PCR按照 TIANGEN公司的 M － MLV 反转录酶操作
手册进行。cDNA合成后，室温静置 10min，再按常规 PCR 方
法扩增 18SrRNA 基因。20μl PCR 反应体系包括:2μl cDNA，
2μl dNTP，2μl Mg2 +，2μl Buffer，0. 2μl Tag酶，正向与反向引物
各 0. 5μl，加 ddH2O至 20μl反应体系。引物序列分别为:齿肋
赤藓 18S rRNA基因的特异引物，上游引物为:5′ － GGAGAGG-
GAGCCTGAGA －3′，下游引物为:5′ － CACCAGACTTGCCCTC-
CAA － 3′(引物由上海生工合成)。cDNA 模板在 95℃变性 5
min后，扩增(94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min)30 个循环，最后
72℃保温 10 min。扩增结束后取 5μl 于 1%琼脂糖凝胶电泳
检测。
2 结果与分析
2. 1 三种提取方法获得 RNA样品的纯度和产率的比较
紫外分光光度计测得所提取 RNA 的 OD280、OD260、OD230
值，其中 OD260 /OD280(R)体现了 RNA中蛋白质等有机物的污
染程度，质量较好的 RNA其 R值应在 1. 8 ～ 2. 2 之间，当 R <
1. 8 时，溶液中蛋白质等有机物污染较为明显，当 R > 2. 2 时，
说明 RNA 已水解成单核苷酸。3 种方法所得 RNA 紫外扫描
结果见表 1，皂土法和 RNAprep pure 植物总 RNA 提取试剂盒
法所得 OD260 /OD280和 OD260 /OD230值较低，产率过低无法进行
后续实验，而改良 RNAiso Reagent 试剂法提取的 RNA，OD260 /
OD280和 OD260 /OD230值在合适的范围内，表明样品蛋白质含量
较少，没有 Rnase污染及基因组污染，其产率较高可进行后续
实验。对三种方法提取总 RNA 产量进行单因素方差分析，结
果显示植物总 RNA提取试剂盒法(TIANGEN)与改良 RNAiso
Reagent试剂法得出产量差异极显著(P < 0. 001) ，0. 5%皂土
法与改良 RNAiso Reagent试剂法(TaKaRa)得出产量差异极显
著(P < 0. 001) ，而植物总 RNA 提取试剂盒法(TIANGEN)与
0. 5%皂土法差异不显著。
表 1 不同方法提取齿肋赤藓总 RNA纯度及产量比较
Table 1 Comparition of Syntrichia caninervis total RNA purity and yield
between isolation method
方法 OD260 /OD280(R) OD260 /OD230 产量(μg /g)基因组污染
TIANGEN 2. 01 ± 0. 03 0. 43 ± 0. 05 250 ± 82A －———a
0. 5%皂土法 1. 98 ± 0. 04 1. 40 ± 0. 06 320 ± 10A 少量
改良 RNAiso Reagent 1. 89 ± 0. 03 1. 97 ± 0. 03 1308 ± 10B －———a
注:每样品重复 3 次，取平均值。a:未观察到。
2. 2 三种提取方法获得 RNA的完整性分析
三种提取方法提出的 RNA，取 5μl电泳，凝胶检测结果见
图 1。
图 1 不同方法提取 RNA琼脂糖凝胶电泳图
A:RNAprep pure植物总 RNA提取试剂盒法 B:皂土法 C:改良 RNAiso
Reagent试剂法。
Fig. 1 Agarose electrophoreals of total RNAs extracted by different methods
A:RNAprep pure kit;B:Bentonite method;C:Modified RNAiso Reagent.
由图 1C结果分析可知:改良 RNAiso Reagent 试剂法提取
的总 RNA 中 28S rRNA 的亮度大于 18S rRNA 的亮度，说明
RNA几乎无降解，且分别在 28S和 18S rRNA 附近出现了不止
一条带，28S rRNA条带以上背景有呈现梯度弥散的趋势，进一
步表明其 mRNA的完整性好。采用 RNAprep pure植物总 RNA
提取试剂盒法提取出的 RNA见图 1B，可见其提取 RNA完整性
不高，无 5S rRNA条带，提取效率低;0. 5%皂土法提取 RNA见
图 1A，其完整性较好，但可见其有基因组污染。因此，可知改良
RNAiso Reagent试剂法提出 RNA产率较好，完整性高。
2. 3 RT － PCR结果
以改良 RNAiso Reagent试剂法提取的 RNA 为模板，参照
反转录试剂盒反转录 cDNA 第一链合成，见图 2，其最大长度
远远大于 1 000bp，说明 RNA较完整，有转录活性，以齿肋赤藓
18S rRNA基因特异引物进行 RT － PCR。预期能扩增出长度
为 240bp 左右的片段。实验结果表明，能成功扩增出目的片
段，见图 3。由此可见，改良 RNAiso Reagent 试剂法提取的
RNA样品质量好，可以进一步用于后续实验。
3 讨论
藓类植物 RNA提取的难点在于藓类植物含较多的酚类、
35
生 物 技 术 2010 年 20(3)
萜类等次生化合物［3］。齿肋赤藓生活在沙漠这样恶劣的环境
下，为了抵御干旱少雨的胁迫，植物体内合成多种次生代谢物
质，如多糖类、多酚类。多酚类物质是植物所特有的次生代谢
物质，它很容易被氧化成褐色的醌类物质［7］，醌类物质不可逆
地同 RNA结合，不仅会使 RNA活性丧失，而且在进行苯酚、氯
仿抽提时会使 RNA 丢失。从富含多糖、多酚植物中提取总
RNA，关键在于提取过程中有效地排除 RNase、多糖、多酚的干
扰［9］。改良 RNAiso Reagent试剂法中加入不溶性聚乙烯吡咯
烷酮(PVP)中的 CO － N =基有很强的结合多酚化合物的能
力，能在一定程度上彻底去除这类化合物的干扰。加入酚:氯
仿:异戊醇进行抽提，RNA 在水相、DNA 在有机相，有效避免
了 DNA污染，同时又可去除蛋白质、残留的多糖以及其他污
染物质，使得提取 RNA 质量更好，而沉淀使用乙二醇丁醚代
替传统的异丙醇和无水乙醇能有效去除样品中的多酚类物
质，50%的高浓度乙二醇丁醚可沉淀 RNA，并使多酚溶于乙二
醇丁醚而被除去［9］。
图 2 齿肋赤藓 cDNA第一链合成
Fig. 2 The first － strand cDNA synthesis of S. caninervis
图 3 RT － PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 3 Agarose electrophoreals of RT － PCR products
M:Marker;1:RT － PCR products.
闫苗苗等［9］使用 SDS法成功从生长在五大连池的东亚砂
藓中提取总 RNA，作者也采用 SDS － LiCl法，但因 LiCl沉淀耗
时较长，对齿肋赤藓总 RNA沉淀力不足，实验效果不佳;皂土
主要由含水铝硅酸盐矿物的蒙脱石类矿物组成的粘土，它的
矿物层间带有负电荷，能吸收 Ca +、Mg2 +等阳离子［12］，具有吸
附蛋白质及有效抑制 Rnase的特性［12 － 15］，对于齿肋赤藓 RNA
提取效果较好，但因其产率较低无法进行后续分子实验，还有
待进一步改进。改良 RNAiso Reagent 试剂法操作简单，耗时
少，约 1 ～ 2h完成全部操作，提取的 RNA 样品纯度高，完整性
好，可用于基因表达分析和分子克隆实验。齿肋赤藓因其在
荒漠地表生物结皮中承担重要作用，其自身变水特性及抗逆
机制目前尚未清楚，本研究为深入探讨其抗逆机制打下基础。
荒漠齿肋赤藓植株个体矮小，生物量极低，体内含较多次
生代谢物质，采用改进的 RNAiso Reagent 试剂法能有效地抑
制其体内次生代谢物质，提取出其产量较好，纯度较高总
RNA，因此，可将其应用于其他荒漠藓类植物总 RNA提取。
参考文献:
［1］王玉成，薄海侠，杨传平. 胡杨、柽柳总 RNA 提取方法的建立［J］.
东北林业大学学报，2003，31(5) :99 － 100.
［2］张梅娟，沙伟，都艳霞. 几种提取苔藓植物总 RNA 方法的比较
［J］.齐齐哈尔大学学报，2009，25(1) :51 － 54 .
［3］张道远，张元明，曹同.耐旱苔藓植物 DNA提取及优化 RAPD、ISSR
反应体系的建立［J］.中国沙漠，2006，26(5) :826 － 831.
［4］张元明，陈晋，王雪芹. 古尔班通古特沙漠生物结皮的分布特征
［J］. 地理学报，2005，60(1) :53 － 60.
［5］吴鹏程.苔藓植物生物学［M］.北京:科学出版社，1998:171 － 177.
［6］张容，郑彦峰，吴瑶，等.一种简单有效的植物 RNA 提取方法［J］.
遗传，2006，28(5) :583 － 586.
［7］淳俊，郑彦峰，王胜华，等. 一种广泛使用的 RNA 提取方法［J］. 生
物化学与生物物理进展，2008，35(5) :591 － 598
［8］Schneiderbauer A，Sandermann HJr，Ernst D. Isolation of functional
RNA from plant tissues rich in phenolic compounds［J］. Anal Biochem，
1991，197:91 － 95.
［9］闫苗苗，魏光成，沙伟，等. 藓类植物 RNA 提取方法研究［J］.广西
植物，2008，28(3) :329 － 331.
［10］HE Zhen － Yan，XU Wen － Zhong，YANG Xue － xi，MA Mi. An ef-
fective method of total RNA isolation from a fern Plant － Pteris vittata L［J］.
Chinese Bulletin of Botany，2005，22(2) :198 － 202.
［11］何振艳，徐文忠，杨学习，等. 提取蕨类植物蜈蚣草总 RNA的一种
有效方法［J］.植物学通报，2005，22(2) :198 － 202.
［12］郑彦峰，淳俊，李亮，等.皂土对 RNA的有效分离和保护作用的初
步研究［J］.四川大学学报:自然科学版，2009，46(5) :1558 － 1562.
［13］ZHANG Yun － Ping，Uyemoto J K，Kirkpatrick B C. Analysis of
double － stranded RNAs from cherry trees with stem pitting in California
［J］. Plant Disease，1998，8(8) :871 － 874.
［14］Putzer H，Condon C，Brechemier － Baey D，Brito R，Grunberg Man-
ago M. Transfer RNA － mediated antitermination in vitro［J］. Nucleic Acids
Research，2002，30(14) :3026 － 3033.
［15］Galetzka D，Russo M，Rubino L，Krczal G. Molecule characterization
of a tombusvirus associated with a disease of statice (Goniolimon tataricum
L. Boiss) ［J］. Journal of Plant Pathology，2000，82(2) :151 － 155.
一种经济、简便和准确鉴定重组质粒的方法
范晶，梁梓，伏秦超，廖金花，黄明远
(乐山师范学院 化学与生命科学学院，四川 乐山 614004)
摘要:目的:提高重组质粒的筛选效率，探讨一种经济、快速并准确的重组质粒鉴定方法。方法:取 200μl 菌液于 Eppendorf
管中高速离心 1min，倒出上清，沉淀中加入 20μl裂解缓冲液以裂解细胞并释放出内部质粒，10 000r /min 离心 10 min 后取 5 ～
10μl上清液进行琼脂糖凝胶电泳，并比较其迁移位置来以判断重组质粒。结果:该方法鉴定结果和 PCR鉴定结果完全一致。结
论:该方法具有成本低廉、简便快速的特点，在对大量样品进行鉴定时具明显优势，适合在常规实验室推广。
关键词:重组质粒;裂解缓冲液;琼脂糖凝胶;电泳
中图分类号:Q784 文献标识码:A doi:10. 3969 / j. issn. 1004 － 311X. 2010. 03. 054
An Economic，Simple and Accurate Method for Identifing Recombinant Plasmids
FAN Jing，LIANG Zi，FU Qin － chao，LIAO Jin － hua，HUANG Ming － yuan
(School of Chemistry and Life Science，Leshan Normal University，Leshan 614004，China)
Abstract:Objective:To improve the efficiency of screening recombinant plasmids，an economic，rapid and accurate identification method
45